Développement et essais d’analyses quantitatives pcr spécifiques aux espèces pour les applications de l’ADN environnemental

Des tests bien optimisés sont essentiels à la bonne interprétation des données d’ADN environnemental. Ce protocole décrit les étapes de conception et d’essai nécessaires à la mise au point d’un tel essai. En général, l’ADN environnemental est une méthode non invasive pour détecter une espèce particulière ou une suite d’espèces.

Il peut réduire les coûts et être plus sensible que les méthodes d’enquête conventionnelles. Cette méthode peut aider à la conservation et à la gestion de la faune grâce à la détection de l’ADN d’une espèce d’intérêt, ce qui permet de déduire la présence de cette espèce dans la zone échantillonnée. En raison de la grande sensibilité de la PCR quantitative, la contamination peut se produire facilement, et des contrôles négatifs sont nécessaires pour identifier les étapes auxquelles la contamination a été introduite.

L’ADNe est un domaine jonché de jargon et de termes abrégés. Pour ceux qui ne sont pas pratiqués en biologie moléculaire ou en qPCR, les démonstrations visuelles peuvent aider à la planification d’un plan expérimental, de la conceptualisation à la génération de données. Dannise Ruiz Ramos, biologiste de notre laboratoire, et Trudi Frost, étudiante aide de laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer, recherchez et téléchargez des séquences de plusieurs régions génétiques pour les espèces d’intérêt à l’aide de la base de données nucléotidiques du NCBI. Sélectionnez toutes les séquences qui correspondent aux spécifications, puis sélectionnez Envoyer à.Choisissez Enregistrement complet, Fichier, Format de téléchargement comme GenBank ou FASTA, puis Créer un fichier. Ces séquences sont maintenant enregistrées sur l’ordinateur.

Répétez ces étapes pour toutes les espèces d’intérêt. Conservez les séquences de chaque région génétique dans un fichier séparé, car elles seront analysées séparément. Pour aligner les séquences de chaque région génétique séparément, importez les fichiers de séquence téléchargés dans un programme d’alignement de séquences, tel que le logiciel Geneious Prime.

Créez des dossiers distincts pour chaque région de gène, puis sélectionnez toutes les séquences dans un dossier contenant des séquences d’une région de gène. Utilisez l’outil Alignement multiple pour créer un alignement de nucléotides, tel que Geneious ou MUSCLE, des séquences sélectionnées. Choisissez des régions prometteuses pour la conception d’analyses grâce à la visualisation de données de séquence alignées.

Sélectionnez une région qui dispose d’un grand nombre de données de séquence pour l’espèce d’intérêt, qui est très divergente entre les espèces et qui présente une faible variation au sein d’une même espèce. Ensuite, concevez les amorces de test et la sonde. Utilisez un logiciel de conception de tests qPCR pour concevoir cinq ensembles de tests qPCR.

Collez la séquence sélectionnée dans la zone Entrée de séquence. Si l’alignement a créé des espaces, supprimez-les de la séquence. Sélectionnez la sonde d’amorces qPCR 2 dans l’option Choisissez votre conception, puis téléchargez les tests recommandés.

Copiez les séquences de l’amorce avant du premier essai et recherchez cette séquence d’amorce dans l’alignement précédemment créé. Si vous utilisez Geneious Prime, utilisez l’outil Annoter la prédiction pour ajouter la région d’amorce à l’alignement. Faites-le pour toutes les combinaisons d’amorces et de sondes.

Inspectez ces régions de l’alignement pour détecter les variations au sein de l’espèce cible, ainsi qu’au sein des espèces cooccurrentes. Testez les amorces in silico grâce à l’outil Primer-BLAST du NCBI. Collez les amorces dans la boîte d’utilisation de mon propre amorce sous Paramètres d’amorce.

Dans les options Paramètres de vérification de la spécificité de la paire d’amorces, sélectionnez NR comme base de données et tapez l’ordre taxonomique ou la famille de l’organisme d’intérêt dans la zone Organisme. S’assurer que les amorces sélectionnées ne sont pas susceptibles d’amplifier les espèces non ciblées. Testez l’efficacité du test in vitro en créant une courbe standard et déterminez l’efficacité et la plage linéaire de la courbe.

Testez au moins six dilutions dix fois d’un étalon d’ADN synthétique contenant la séquence cible, à environ un à un million d’exemplaires par réaction. Utilisez le logiciel qPCR pour tracer la valeur CQ de chaque étalon sur l’axe Y et le log base 10 de la concentration initiale de l’étalon en copies par réaction sur l’axe X. Le logiciel qPCR doit exécuter automatiquement une régression linéaire.

Calculez l’efficacité à partir de la pente de la régression. Inspectez visuellement la courbe standard pour détecter tout biais ou mauvaise performance, mesurée par l’efficacité et les valeurs R au carré. Utilisez un contrôle positif interne pour tester l’inhibition de la PCR sur des échantillons de terrain réels, ce qui peut entraîner une diminution de la sensibilité et des faux négatifs.

Déterminer les limites de détection et de quantification pour chaque essai. Testez des tests avec des espèces non cibles pour vérifier la spécificité et assurez-vous que le test fonctionne bien avec un multiplexage IPC. Les tests avec une bonne sensibilité, spécificité et efficacité peuvent passer aux étapes suivantes.

Pour effectuer des tests in situ du test, obtenez plusieurs échantillons d’eau et traitez-les pour la qPCR. Exécutez le test PCR quantitatif et comparez la concentration et la fréquence de détection de l’ADNe avec les différences connues entre les sites en termes d’occurrence et d’abondance. Confirmez toutes les détections par séquençage.

Les séquences disponibles de toutes les espèces d’Unionidae dans la rivière Clinch ont été téléchargées et alignées. Après avoir conçu plusieurs essais, cinq ensembles d’amorces et de sondes ont été ajoutés à l’alignement pour l’évaluation visuelle. Les ensembles d’amorces et de sondes ont été testés in silico et in vitro.

En laboratoire, tous les tests ont été analysés à l’aide d’extractions d’ADN de 27 espèces disponibles pour vérifier la spécificité. Un test n’a réussi à amplifier que l’espèce cible. Un test réussi avec une bonne efficacité et des valeurs R au carré est illustré ici.

La LD et la LQ pour le test sélectionné étaient toutes deux de cinq copies par réaction. En revanche, les tests qui ont produit une courbe standard avec une faible efficacité ont été écartés. Dans une qPCR de qualité, les dilutions standard amplifient à intervalles réguliers des valeurs de quantification de cycle d’environ 3,3 cycles pour chaque différence de concentration de dix fois.

Dans une qPCR médiocre, les étalons peuvent présenter une variation inégale des valeurs de quantification du cycle entre les dilutions. L’amplification de la CIB pour les échantillons inconnus doit être comparée aux résultats de la commande de matrice négative IPC. Si aucun inhibiteur n’est présent dans les échantillons, toutes les amplifications de la CPI doivent avoir un regroupement serré dans le graphique, avec des valeurs de quantification de cycle presque identiques à celles du contrôle sans modèle.

Pour les essais in situ de l’essai, les sites d’implantation comprenaient le fond du lit de moules dans le cours d’eau, le fond du lit musculaire près du rivage, 100 mètres en aval du lit dans le cours d’eau, 500 mètres en aval du lit dans le cours d’eau et 500 mètres en aval du lit près du rivage. Les tests PCR quantitatifs pour l’ADN environnemental peuvent aider à la surveillance des espèces envahissantes et en voie de disparition, ainsi qu’à améliorer notre compréhension des changements spatiaux et temporels dans la détection des espèces sans avoir à capturer physiquement l’organisme individuel.