Identification des complexes protéiques dans Escherichia coli En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d'interactions protéiques et d'enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d'affinité (SPA) procédure APMS développé pour la bactérie

Le but de cette expérience est d’identifier les protéines, les interactions protéiques et la composition en sous-unités des complexes MultiPro natifs d’e coli. Ceci est réalisé en amplifiant les produits de PCR linéaire spécifiques à la séquence, en codant l’étiquette SPA et un marqueur sélectionnable, qui sont intégrés et exprimés dans le cadre sous forme de fusions terminales carboxy dans un fond ddy 3, 3 0 à l’aide d’un système de recombinaison de bactéries Fage lambda comme deuxième étape. La purification en deux étapes est effectuée à l’aide de modlin de vache et de billes d’affinité Anti-Flag pour récupérer efficacement les complexes protéiques de faible abondance. Ensuite, les protéines liées auxquelles il est fait allusion avec de la modline de vache, un tampon d’élution ou un CEB sont digérées avec de la trypsine et traitées par spectrométrie de masse pour l’identification des protéines.

Les résultats obtenus montrent que les différentes sous-unités de l’enzyme ARN polymérase centrale, y compris la terminaison de transcription, les facteurs anti-détermination co-purifiés efficacement avec la protéine de la sous-unité D de l’ARN polymérase marquée, indiquant que les composants nouvellement associés peuvent être efficacement découverts en utilisant cette approche. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés avec deux purifications d’affinité rondes, où un traitement minutieux des lysats cellulaires avec des solutions tampons appropriées est absolument nécessaire pour assurer le succès de la récupération efficace des complexes de charge de faible et de haute abondance à partir de cultures à grande échelle. Ce protocole commence par le ciblage de séquences amplifiées spécifiques sur la souche DDY 30 dans laquelle la machinerie de recombinaison du rouge Lambda est exprimée comme décrit dans le protocole écrit.

Ensuite, où le système de recombinaison Lambda de la bactérie Farge exprimant la souche pendant la nuit dans deux millilitres de Luria bati ou de milieu LB à 32 degrés Celsius, en agitant à 180 tr/min le lendemain, inoculez un millilitre de la culture de nuit dans 70 millilitres de milieu LB frais dans une fiole conique de 500 millilitres. Cultivez l’inoculum à 32 degrés Celsius en l’agitant à 180 tr/min jusqu’à ce que la DO 600 atteigne environ 0,8. Induisez les cellules en incubant le ballon dans un bain-marie à 42 degrés Celsius en agitant doucement à 180 tr/min pendant 15 minutes.

Immédiatement après l’induction, incubez le ballon dans un bain de boue d’eau glacée pendant au moins 30 minutes en agitant. Après avoir récolté et lavé les cellules comme décrit dans la procédure écrite, Reese suspend la pastille cellulaire dans 700 microlitres de glace, d’eau froide et stérile, ce qui permet d’obtenir des cellules électrocompétentes par électroporation. Introduisez un microlitre de l’amplicon purifié dans 40 microlitres de cellules électrocompétentes.

Les cellules sont électroporées après recombinaison et intégration homologues. Les transformants qui ont réussi à recombiner la cassette de barre oblique dans le chromosome sont sélectionnés en fonction de leur résistance à la mycine canette, sélectionner plusieurs transformateurs pour le transfert occidental afin de vérifier la génération correcte des protéines de fusion marquées SPA avec l’anticorps anti-Flag M deux qui est sélectif contre les épitopes de drapeau de l’étiquette SPA Transférer 10 millilitres de la culture de nuit dans 990 millilitres de tuberculose fraîche. Complété par 25 microgrammes par millilitre de mycine dans une fiole de quatre litres.

Cultivez la culture à 32 degrés Celsius avec une agitation constante à 250 tr/min pendant cinq à six heures jusqu’à ce que l’OD 600 atteigne entre deux et trois. Transférez la culture d’étiquette SPA d’un litre d’e coli dans des bouteilles de centrifugation propres et faites tourner les cellules à quatre degrés Celsius et 3 993 fois G pendant 15 minutes. Après la suspension des cellules comme décrit dans le protocole écrit.

Transférez les échantillons dans une tasse stérile en acier inoxydable placée sur de la glace pour la sonication. Immergez la sonde dans l’échantillon et sonisez pendant trois minutes. Après la sonication, attendez deux minutes supplémentaires pour refroidir l’échantillon de la surchauffe après la centrifugation du lysat de sonicate.

Transférez avec précaution le surnageant S du tube de centrifugation dans un tube faucon en polypropylène de 50 millilitres. Congelez l’échantillon à l’aide d’azote liquide et conservez l’extrait cellulaire congelé soniqué pendant une période maximale de six mois à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Pour commencer la purification d’affinité de l’extrait de cellules soniquées congelées en plaçant le tube dans de l’eau froide, incubez l’extrait de cellules TH avec trois microlitres de benzo, une nucléase pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

À ce mélange, ajoutez le détergent non ionique Triton X 100 et les suspensions de 200 microlitres de deux billes agricoles Anti-Flag M. Mélangez doucement le contenu en tournant le tube pendant trois heures à quatre degrés Celsius après trois heures de rotation, centrifugez le tube à 1 700 fois G pendant six minutes. Après la centrifugation, retirez soigneusement la plus grande quantité possible de sate, sans déranger la pastille de vitesse lâche.

Remettre la pastille en suspension dans le SNA restant, puis transférer dans une colonne de préparation en polypropylène. Retirez les bouchons de sortie inférieurs de la colonne pour permettre à l’éluat de s’écouler par gravité. Couler. Ensuite, lavez la colonne cinq fois avec 200 microlitres d’un tampon FC et passez à Cleve avec TEV comme décrit dans le protocole écrit.

Après le clivage rapide en haut et en bas de la colonne, fermement. Mélangez doucement le contenu de la colonne en tournant toute la nuit à quatre degrés Celsius après une rotation pendant la nuit. Égouttez l’éluat en retirant le capuchon supérieur et le bouchon inférieur dans la nouvelle colonne.

Lavez l’ancienne colonne avec 400 microlitres d’un tampon de liaison Modlin x cal et une suspension de 150 microlitres de billes de liaison Cal Modlin. Éluez la protéine liée en quatre fractions de 50 microlitres dans un tube d’orph frais. Utilisation d’un tampon d’élution Modlin x cal.

Répartissez la fraction éluée dans deux tubes d’orph propres et égaux. Séchez ensuite le contenu des deux tubes à l’aide d’un vide rapide. L’éluat séché d’un tube est utilisé pour faire fonctionner un gel de coloration à l’argent comme décrit dans le texte, tandis que l’autre est stocké à moins 80 degrés Celsius.

Pour une utilisation future en spectrométrie de masse à l’échantillon séché, ajoutez 50 microlitres de tampon de digestion et 0,9 microlitre d’acide chlorhydrique trisphosphine 100 millimolaires Incuber le mélange pendant 45 minutes à température ambiante pour l’étape de réduction Ensuite, ajoutez un microlitre d’acétamide IDO 500 millimolaires et incubez dans l’obscurité pendant 40 minutes supplémentaires. Pour permettre l’alkylation de l’échantillon Après le deuxième cycle d’incubation, ajoutez un microgramme de trips dans le mélange. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant cinq heures ou toute la nuit à température ambiante après l’incubation.

Assurez-vous d’arrêter la réaction en ajoutant un microlitre d’acide acétique. Préparez ensuite l’embout zippé Millipore, l’embout de pipette comme décrit dans le texte pour une liaison efficace du peptide à l’embout du tuyau pep. Mélangez le mélange de peptides 20 fois, rincez le mélange de peptides qu’il a fait jusqu’à la pointe en aspirant et en distribuant la solution de lavage.

Répétez cette procédure deux fois pour assurer une liaison efficace du mélange peptidique à l’extrémité avec l’extrémité contenant le peptide lié. Aspirez 10 microlitres de la solution de mouillage et d’équilibrage et distribuez-les dans un tube à orph propre. Répétez cette étape deux fois.

Après avoir séché les échantillons élués dans un vide rapide, les échantillons peuvent être analysés immédiatement par spectrométrie de masse ou stockés à moins 80 degrés Celsius avant d’être utilisés. Les micro-colonnes utilisées dans cette procédure sont remplies d’environ 10 centimètres de résine lunaire C 18 de trois microns et sont reliées à une source d’ions nano-électronébulisation pro Zion qui est placée en ligne avec l’instrument orbitrap. Une pompe HPLC binaire pro Zion nano flow est utilisée pour fournir un débit de pointe stable d’environ 300 nanolitres par minute pendant les séparations peptidiques afin d’obtenir une dilution peptidique et de mettre en place un gradient de tampon organique en fonction de la complexité de l’échantillon.

Pour cet échantillon de SPA d’e coli, le solvant A en phase mobile contient 95 % d’eau de gradient HPLC et 5 % de nitrile acéto avec 0,1 % d’acide formique, tandis que le solvant B a 5 % d’eau de gradient HPLC et 95 % de nitrile acéto avec 0,1 % d’acide formique après spectrométrie de masse pour rechercher les spectres à l’aide d’un algorithme de recherche de base de données tel que seaquest par rapport à une base de données de séquences de protéines e coli. Filtrez statistiquement le résultat à l’aide d’un algorithme de probabilité tel que star quest pour garantir un faible taux de fausses découvertes, à la fois le facteur sigma d’ARN polymérase marqué SPA et la protéine LA yak de fonction inconnue co-purifiées spécifiquement avec l’enzyme ARN polymérase de base, y compris les sous-unités alpha bêta et bêta prime, ainsi que le facteur de recyclage de l’ARN polymérase. Contrairement à l’ARN polymérase marquée, le facteur yak L s’est lié en plus à un facteur anti-détermination essentiel de terminaison de transcription, suggérant une fonction spécialisée dans la transcription.

Plusieurs autres protéines copurifiantes plus petites ont également été détectées par LCMS qui n’étaient pas apparentes sur le gel, y compris la sous-unité ARN polymérase Omega et les facteurs de transcription, de terminaison et de détermination, ainsi que les États-Unis et NUSD. Inversement, dans une expérience indépendante marquée mobilisation de la machinerie soufrée, S-U-F-B-S-U-F-C et SUFD co-purifiés l’un avec l’autre, indiquant une participation conjointe à la biosynthèse du cluster fer-soufre en tant que complexe d’échafaudage unique. Cet exemple représentatif met en évidence le fait que les complexes bactériens MultiPro hautement annotés, précédemment bien étudiés et participant à des processus biologiques essentiels, ont souvent de nouveaux composants associés qui peuvent être identifiés efficacement.

En utilisant cette approche, le faible nombre de copies de la protéine SUFB peut avoir entraîné une faible intensité du signal par rapport à la forte intensité observée dans les expériences de traction SUFC et SUFD pour définir la composition de complexes protéiques multi-unités stables, des scores de co-purification ont été attribués à des interactions de confiance élevée en tenant compte du caractère unique des proies appâts, relations entre appâts, appâts et proies-proies. Ensuite, à l’aide de procédures de clustering de graphes comme l’algorithme de clustering de marquage. Des amas de protéines discrets sont identifiés à partir du réseau PPI probabiliste partitionné.

Les réseaux d’interaction putatifs peuvent être visualisés à l’aide de cyto scape. La combinaison de données protéomiques avec des preuves d’association fonctionnelle supplémentaires déduites par des méthodes génomiques peut être utilisée pour étudier de nouveaux rôles mécanistes des protéines e coli précédemment annotées. Ici, des sous-réseaux de complexes protéiques et de modules fonctionnels qui participent en tant que voisinages fonctionnels plus larges ont été définis chez e coli.

Le groupe hiérarchique principal, Graham, montre les modèles de prédictions fonctionnelles et les annotations existantes pour les gènes fonctionnellement orphelins et caractérisés d’e coli, les couleurs jaune et bleue représentent respectivement les fonctions existantes et déduites, tandis que les intensités d’ombre reflètent les scores de confiance. Les processus biologiques associés à divers quartiers sont indiqués sur les médaillons de droite qui montrent les composants individuels d’un voisinage représentatif sur la base des scores de similitude du réseau d’interaction physique et fonctionnelle intégré. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont les complexes protéiques stables d’estia coli peuvent être isolés en utilisant l’approche de purification d’affinité couplée à la spectrométrie de masse.

En principe, cette technique peut être appliquée pour caractériser des complexes protéiques membranaires ou des complexes protéiques de toute autre espèce pour qu’il se recombine le plus possible.