Name: Identification des complexes protéiques dans Escherichia coli En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Découvrez l'identification des complexes protéiques dans Escherichia coli par purification d'affinité séquentielle couplée à la spectrométrie de masse. Cette méthode permet d'isoler efficacement les protéines peu abondantes et de révéler de nouvelles interactions.

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Ce travail a été soutenu par des fonds de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, Génome Canada, l&#39;Ontario Genomics Institute, le ministère de l&#39;Innovation, et les Instituts de recherche en santé du don à JG et E. L&#39;AE rouge exprimant coli souche DY330 était un gentil cadeau de Donald L. Cour (National Cancer Institute, Frederick, MD).

1. Construction de gènes spécifiques SPA-tagging dans E. coli souche DY330 <ol><li> Le plasmide pJL148 englobant la séquence d&#39;ADN SPA-tag et la kanamycine marqueur de résistance aux antibiotiques de cassette (Kan R) sont utilisés comme matrice dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) 7. A 45 nt gène spécifique à l&#39;amorce sens, située immédiatement en amont du codon stop du gène cible dans le cadre avec un 27 pb (&#39;5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) amorce sens étiquette spécifique, et un 45 nt spécifique du gène amorce inverse, situé immédiatement en aval du codon stop du gène cible dans l&#39;image avec un point d&#39;ébullition 27 (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) amorce anti-sens spécifique tag, sont utilisés pour amplifier le marqueur et SPA-Kan R cassette du pJL148 utilisant les conditions suivantes: 94 cycles de PCR ° C pendant 5 min; 30 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 1 min, 68 ° C pendant 2 min 10 sec, puis 68 ° C pendant 10 min. Ces séquences amplifiées servir uns substrats pour la ectopique introduit λ-Rouge machines de recombinaison homologue (voir ci-dessous). </li><li> Le produit de PCR est purifié en utilisant un kit QIAquick PCR purification pour éliminer les sels qui peuvent interférer avec l&#39;électroporation. Le produit de PCR purifié est ensuite ciblé pour intégrer à l&#39;extrémité 3 &#39;(juste en amont du codon d&#39;arrêt natif) d&#39;un gène spécifique dans DY330 souche dans laquelle le mécanisme de recombinaison λ-rouge 10 est exprimé. </li><li> Le DY330 λ-Rouge souche exprimant est cultivée pendant une nuit dans 2 ml de Luria-Bertani (LB) à 32 ° C en agitant à 180 tours par minute. 1 ml de la culture d&#39;une nuit est ensuite inoculée dans 70 ml de milieu LB frais dans 500 ml fiole conique. L&#39;inoculum est cultivé à 32 ° C en agitant à 180 tours par minute jusqu&#39;à ce que la DO 600 atteigne environ 0,8. </li><li> La culture est transférée dans un nouveau erlenmeyer de 250 ml, où les cellules sont induites par incubation de la fiole dans un bain d&#39;eau à 42 ° C en agitant doucement à180 tours par minute pendant 15 minutes. Immédiatement après l&#39;induction, le ballon est mis en incubation dans un bain de bouillie de glace d&#39;eau pendant au moins 30 min sous agitation. </li><li> La culture glacée est immédiatement transféré en pré-réfrigérés tube de 50 ml en polypropylène et soumis à une centrifugation à 3993 xg pendant 6 min à 4 ° C. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 50 ml d&#39;eau glacée stérile et centrifugé de nouveau à 3993 xg pendant 6 min à 4 ° C. Le culot cellulaire est alors remis en suspension dans 1 ml d&#39;eau froide et transféré dans un tube de 1,5 ml Effendorf, et centrifugé à une vitesse maximale de 20 secondes à 4 ° C. Après deux ou trois étapes de lavage avec de l&#39;eau glacée, le culot cellulaire est remis en suspension dans 700 ul enfin de l&#39;eau glacée stérile, résultant en des cellules électro-compétentes. </li><li> Grâce à l&#39;électroporation, une pi de l&#39;amplicon purifié est introduit dans 40 pl de cellules électro-compétentes. Les cellules sont électroporation dans un Bio-Rad II GenePulser avec les paramètres suivants: 2,5 kV, 25 uF avec impulsionContrôleur de 200 Ω. Après recombinaison homologue et de l&#39;intégration, les transformants qui ont réussi à recombiner l&#39;étiquette / cassette dans le chromosome sont choisis en fonction de la résistance à Kan (figure 1A). Plusieurs transformants sont sélectionnés pour Western blot pour vérifier la génération correcte (c&#39;est à dire un signal positif) de la SPA taggés protéines de fusion avec anticorps anti-FLAG M2 qui est sélective contre les épitopes drapeau de la SPA-tag. </li><li> Confirmé souche carboxy terminal de fusion SPA-tag est cultivé sur une grande échelle afin d&#39;isoler des complexes de protéines solubles à partir des cellules récoltées en utilisant le protocole de purification SPA. Les grandes lignes des étapes de la procédure de purification par affinité tag est montré dans la figure 1B. </li></ol> 2. La culture et la sonication <ol><li> Inoculer 100 pi d&#39;une étiquette E. SPA- stock de glycérol coli dans 50 ml de bouillon terrible (TB) milieu liquide supplémenté avec 50 ul de 25 pg / ml of Kan solution dans une fiole conique de 250 ml. Cultiver la culture pendant la nuit à 32 ° C. Remarque: Comme la cassette λ inductible par la température dans la souche DY330 rouge est sous le contrôle d&#39;un répresseur sensible à la température 10, la souche de SPA-marqué E. coli est cultivée à 32 ° C. </li><li> Transférer 10 ml de la culture d&#39;une nuit dans 990 ml tuberculose frais additionné de 25 pg / ml de Kan dans un ballon de 4 litres. La culture est développée à 32 ° C avec agitation constante à 250 tours par minute, pendant 5 à 6 heures, jusqu&#39;à ce que la DO 600 atteigne 2 à 3 ~. </li><li> Transférer le 1 litre E. coli SPA-tag culture pour nettoyer les bouteilles de centrifugation et tourner les cellules à 4 ° C dans Beckman J6-HC centrifugeuse @ 3993 xg pendant 15 min. </li><li> Le surnageant est éliminé des bouteilles de centrifugation. Reprendre le E. culots cellulaires coli avec 25 ml de tampon de sonication. Assurez-vous de garder les bouteilles de centrifugation sur la glace en tout temps. </li><li> Le culot remis en suspension esttransféré à tube de 50 ml en polypropylène Falcon et congelés à l&#39;azote liquide. Les cellules congelées sont conservées à -80 ° C pour utilisation à long terme. </li><li> Avant de sonication, décongeler les cellules congelées complètement en gardant les boulettes sur la glace. Les échantillons décongelés sont transférés à une coupelle en acier inoxydable stérile placé sur de la glace pendant la sonication. La sonde est immergée dans l&#39;échantillon et soumis aux ultrasons pendant 3 min. Encore 2 min, on laisse refroidir l&#39;échantillon de surchauffe. </li><li> Le lysat cellulaire est traitée aux ultrasons transmis dans le tube de pré-réfrigéré centrifugation stérile, et on le soumet à une centrifugation à 4 ° C en utilisant une centrifugeuse Beckman JA-17 @ rotor 35.267 xg (16.000 rpm) pendant 15 min à deux reprises. Remarque: Dans le cas de la purification des protéines membranaires, le lysat cellulaire soniqué est centrifugé qu&#39;une seule fois pendant 15 minutes parce que nous ne savons pas dans quelle fraction des protéines membranaires sont, c&#39;est, que ce soit dans le culot ou dans la fraction surnageante. Donc, pour éviter la perte de plus de membresprotéines membranaires, nous tournons les cellules pendant 15 min à grande vitesse de centrifugation et le surnageant est ensuite traité pour la purification (voir les étapes ci-dessous), où 1% de détergent est utilisé pour solubiliser les protéines membranaires. </li><li> Le surnageant du tube de centrifugation est soigneusement transférée dans un tube Falcon de 50 ml en polypropylène et congelés à l&#39;azote liquide. L&#39;extrait de cellules congelées soniqué est stocké pour une période maximale de 6 mois à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 3. Purification par affinité <ol><li> Avant d&#39;utiliser, 100 pi de Anti-Flag M2 perles sont lavées par 10 volumes de tampon AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de détergent, et 0,1-0,5 mM PTCE [tris (2-carboxyéthyl) phosphine - l&#39;acide chlorhydrique]) sans le détergent et l&#39;agent de réduction TCEP (tris (2-carboxyéthyl) phosphine). </li><li> Le congelés, extrait cellulaire soniqué est décongelé en plaçant le tube dans l&#39;eau froide. L&#39;extrait cellulaire décongelée est incubé avec 3 pi de benzonase nucléase pendant 30 min à 4 ° C. A ce mélange, ajouter un détergent non ionique Triton X-100 (concentration finale du détergent devrait être de 0,1%) et 200 pi de suspensions anti-FLAG M2 billes d&#39;agarose. Remarque: Pour toutes les purifications de protéines solubles, 0,1% de Triton X-100 est utilisé pour minimiser l&#39;adsorption non spécifique, alors que pour la purification d&#39;une protéine membranaire, différents doux détergents non ioniques, tels que C12E8 (octaéthylène dodécyl éther de glycol), DDM ( n-dodécyl β-D-maltoside) et le maltose-néopentylglycol (MNG) peut être utilisé à une concentration de 1% de détergent pour améliorer la solubilisation. Depuis différents détergents ont une efficacité variable solubilisation des protéines membranaires, il est recommandé d&#39;effectuer des purifications de protéines indépendantes en utilisant plus d&#39;un détergent. </li><li> Le contenu est mélangé doucement en tournant le tube pendant 3 heures à 4 ° C en utilisant un agitateur LabQuake. Après 3 h de rotation, le tube est centrifugé à 1.700 g pendant 6 minutes. Le surnageant est alors removed soin, autant que possible, sans perturber le cordon lâche granulés. </li><li> Le culot est remis en suspension dans le surnageant restant, puis transféré dans un 0,8 x 4 cm colonne de Bio-Rad polypropylène de préparation. S&#39;assurer de retirer les bouchons de vidange par le bas de la colonne, afin de permettre les éluats à vidanger par gravité. Laver la colonne 5 fois avec étape de clivage TEV. </li><li> Après la vidange des éluats lavés, la sortie de fond de la colonne est fermée. À la même colonne, le clivage est réalisée par l&#39;addition de 5 à 10 ~ pi (50 unités) de protéase TEV et 400 pl de tampon 1X AFC sur la colonne. S&#39;assurer de fermer la partie supérieure de la colonne avec un capuchon. La colonne contenant les billes sont tournés doucement une nuit à 4 ° C pendant la nuit à l&#39;aide d&#39;un agitateur LabQuake. </li><li> Enlever le bouchon sur le dessus et le bouchon de sortie au bas de la colonne, et égoutter les éluats récupérés après clivage TEV dans une colonne contenant 200 suspensions frais ul de billes de sépharose-calmoduline qui est lavé par 10volumes de tampon de liaison calmoduline. </li><li> À la fois le haut et le bas de la colonne sont fixées hermétiquement, et le contenu de la colonne sont mélangées doucement par rotation pendant 3 heures à 4 ° C à l&#39;aide d&#39;un agitateur LabQuake. </li><li> Après 3 h de rotation, l&#39;éluat est évacué en retirant le couvercle supérieur et le bouchon de fond de la colonne. La colonne est lavée quatre fois avec 200 pi de tampon de liaison 1X calmoduline suivie d&#39;un lavage rigoureux avec 400 pl de tampon de lavage calmoduline. </li><li> La protéine liée est éluée en quatre fractions de 50 ul dans un nouveau tube Eppendorf en utilisant 1X tampon d&#39;élution calmoduline. La fraction éluée est distribué dans deux tubes Eppendorf propres dans des volumes égaux. Les deux tubes sont ensuite séchés sous vide à l&#39;aide d&#39;une vitesse. </li><li> L&#39;éluat séché d&#39;un tube est utilisé pour l&#39;exécution d&#39;un gel coloration à l&#39;argent, tandis que l&#39;autre est stocké dans -80 ° C, avant d&#39;utiliser la spectrométrie de masse. </li></ol> 4. Coloration à l&#39;argent <ol><li> Pour l&#39;argent staining, la moitié du volume de SDS 3X (dodécyl sulfate de sodium) tampon d&#39;échantillon est ajouté à 50 ul de l&#39;éluat séché. Après avoir fait bouillir le mélange pendant 5 min, les échantillons sont chargés sur un gel de polyacrylamide SDS. </li><li> Après le gel a fini de s&#39;exécuter, il est soigneusement placé dans une solution de fixation (méthanol à 50% et 10% d&#39;acide acétique) et agité doucement sur un agitateur rotatif pendant 20 min. Le gel est ensuite rincé à l&#39;éthanol à 20% pendant 10 min. </li><li> Le gel fixe est lavée deux fois à fond avec 500 ml d&#39;eau bidistillée pendant 10 minutes pour assurer fond uniforme faible. </li><li> Le gel est ensuite agité doucement dans 500 ml de thiosulfate de sodium pendant 1 min, suivie de deux étapes de lavage avec de l&#39;eau distillée pendant 20 sec. </li><li> L&#39;eau est éliminée, et le gel est incubé dans 200 ml de nitrate d&#39;argent 0,1% pendant 30 min. Après ce temps, le nitrate d&#39;argent est éliminé et le gel est lavé avec de l&#39;eau distillée pendant 20 secondes pour éliminer l&#39;excès de nitrate d&#39;argent. </li><li> Le gel est finalement la main agitée dans 75 mlde la solution de développement. Lorsque l&#39;intensité désirée est atteinte, la solution de développement est éliminé et 80 ml d&#39;acide acétique est ajouté pour arrêter la réaction. Assurer à incuber le gel dans l&#39;acide acétique pendant une période minimale de 20 minutes pour une visualisation correcte des bandes de gel. </li></ol> 5. Protéolyse et préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse <ol><li> Pour l&#39;échantillon séché, ajouter 50 ul du tampon de digestion et 0,9 ul de 100 mM PTCE-HCl (tris (2-carboxyéthyl) phosphine - acide chlorhydrique) et incuber le mélange pendant 45 min à température ambiante pour l&#39;étape de réduction. Ensuite, 1 pl de 500 mM d&#39;iodoacétamide est ajouté et incubé dans l&#39;obscurité pendant 40 min un autre pour permettre d&#39;alkylation échantillon. </li><li> Après le second tour de l&#39;incubation, ajouter 1 ug de trypsine immobilisée sur le mélange et incuber soit à 37 ° C pendant 5 heures ou toute la nuit à température ambiante. Assurez-vous d&#39;arrêter la réaction en ajoutant 1 ul d&#39;acide acétique. </li><li> Pré-humide, la Millipore Zip-Tip pointe de la pipette en aspirant 10 ul de la solution de mouillage et d&#39;équilibrage. Distribuer la solution à perdre. Par la suite aspirer 10 ul de la solution de lavage et distribuer la solution à perdre. Répétez cette étape deux fois. </li><li> Pour une fixation efficace du mélange peptidique à l&#39;extrémité, d&#39;une pipette mélanger le mélange de peptides de 20 fois. Le mélange de peptides qui ont adhéré à la pointe est lavé par aspiration et la distribution de la solution de lavage. Répétez cette procédure deux fois pour une fixation efficace du mélange de peptides à la pointe. </li><li> Avec le bout contenant le peptide lié, aspirer 10 ul de la solution de mouillage et d&#39;équilibration, et distribuer dans un tube eppendorf propre. Répétez cette étape deux fois. Après séchage, les échantillons élués dans le vide de vitesse, les échantillons peuvent être analysés par spectrométrie de masse immédiatement ou conservés à -80 ° C avant utilisation. </li></ol> 6. Identification des protéines par LTQ Velos Orbitrap spectromètre de masse Thcomposants électroniques polypeptidiques des complexes isolés sont identifiés à l&#39;aide d&#39;un Orbitrap LTQ Velos hybrides spectromètre de masse en tandem. L&#39;exception des Orbitrap pouvoir de résolution (&gt; 60.000 maximum intégral moitié de la largeur, ou FWHM) et la précision de masse (&lt;2 ppm) qui minimise MS / MS échantillonnage de contaminants non pertinentes fond non spécifiques détectés dans purifications de commande, tandis que la vitesse élevée à piège à ions Velos composant peut détecter et peptides de fragments de faible abondance en utilisant à la fois le transfert d&#39;électrons et de dissociation induite par collision modes de dissociation. Matchs de confiance élevé entre résultant spectres MS / MS sont mappés à la référence E. séquences de protéines coli en utilisant l&#39;algorithme de recherche de base de données comme SEQUEST et chaque séquence correspondant évaluée au cours d&#39;un algorithme de probabilité comme STATQUEST 11. Le nombre total de spectres, l&#39;unicité séquence peptidique et les contaminants de fond communs détectés dans le contrôle négatif (c.-à-maquette.) Purifications sont envisagées pour atteindre un bas empirique faux-distaux de découverte. Les étapes suivantes sont effectuées pour l&#39;identification des protéines: <ol><li> Les micro-colonnes sont emballées avec ~ 10 cm de 3 pm Luna-C 18 et de résine sont en interface avec une source d&#39;ions Proxeon nanoélectronébulisation qui est placé en ligne avec l&#39;instrument Orbitrap. </li><li> Un Proxeon flux binaire nano HPLC pompe est utilisée pour délivrer un taux stable de flux pointe d&#39;environ 300 -1 nl min pendant les séparations de peptides. </li><li> Pour parvenir à élution peptide, un gradient de tampon organique est mis en place selon la complexité de l&#39;échantillon. Par exemple, le gradient suivant est généralement mis en place pour E. échantillons SPA coli: le solvant B est passée de 2% à 6% en 1 min, à 24% en 38 min, à 100% dans la prochaine 4 min, détenue à 100% pendant 1 min, puis a diminué à 2% en 1 min, et dernière maintenir à 2% pendant 15 min. Le solvant de phase mobile A a 95% HPLC gradient d&#39;eau et 5% ACN avec de l&#39;acide formique 0,1%, tandis que le solvant B a 5% HPLC gradient d&#39;eau et 95% d&#39;ACN avec 0,1% d&#39;acide formique acid. Le débit à la pointe de l&#39;aiguille est fixée à 300 nl min -1 pendant 60 min. </li><li> Comme les cycles de spectrométrie de masse de fonctionner grâce à un balayage complet de masse à 60.000 résolutions, 10 concomitants scans en tandem fragmentation de masse sont recueillies pour les ions précurseurs les plus intenses. L&#39;exclusion dynamique, la sélection massale monoisotopique, et en temps réel des données dépendantes de caractéristiques de l&#39;instrument d&#39;acquisition sont activés. </li><li> Les spectres sont recherchés en utilisant un algorithme de recherche de base de données tels que SEQUEST contre une base de E. séquences de protéines coli, et le résultat est statistiquement filtré en utilisant un algorithme probabiliste comme STAQUEST 11 pour assurer un taux faible de faux découverte. Seuls les candidats de confiance élevé (99% de probabilité) sont sélectionnés, tandis que les matchs montrant plus de 10 ppm en masse d&#39;erreur par rapport à la masse des peptides théoriques sont éliminés sans autre considération. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Un aspect essentiel de l&#39;approche basée sur APMS SPA décrit ici est que le marquage est effectué dans le cadre naturel chromosomique, assurant ainsi la régulation des gènes normale est maintenue (. Promoteur natif appât préservé, où les niveaux d&#39;expression n&#39;est pas perturbé) et natif stable associée à complexes protéiques sont récupérés à court endogènes niveaux. Questions polarité opéron sont également évités par un promoteur comprenant orientée vers l&#39;extérieur dans le marqueur de sélection....

<table><tbody><tr><td colspan="4">I. Antibiotiques</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Bioshop</td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>#AMP201<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">2. Terrific-Broth moyen</fort></td></tr><tr><td>Bio-Tryptone</td><td>Bioshop</td><td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Bioshop</td><td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Bioshop</td><td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4Bioshop</td><td></td><td>#PPM 303</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Souche bactérienne et plasmide </td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu et al. (2000)10</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>Zeghouf et al. (2004)7</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Réactifs de PCR et d’électrophorèse </fort></td></tr><tr><td>Taq ADN polymérase</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 X tampon PCR</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Chargement colorant</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TBE 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Bioshop</td><td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>5. Kits d’isolement et de nettoyage des plasmides</td></tr><tr><td>Plasmid Midi</td><td>kit Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR</td><td>kit Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6. Equipements de PCR et de Transformation</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>BioRad</td><td>iCycler</td><td></td></tr><tr><td>Électrophorèse sur gel d’agarose</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulser II</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg ; C agitateur</td><td></td> à bain-marie <td>Innova 3100</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>TS-5.1-500</td><td></td></tr><tr><td>32 &deg ; C Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg ; C grand Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg ; Incubateur à plaque C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">7. Électrophorèse et Western blot</td></tr><tr><td>Acrylamide monomère, N,N'- méthylènebis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0125</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Bioshop</td><td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>Sigma</td><td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td><td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman No. 1</td><td>Fischer Scientific</td><td>#09-806A</td><td></td></tr><tr><td>Mini protéiforme 3 cellules</td><td>Bio-Rad</td><td>#165-3301</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de transfert de gel iBlot</td><td>Invitrogen</td><td>#IB1001</td><td></td></tr><tr><td>Membranes de nitrocellulose</td><td>Bio-Rad</td><td>#162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-drapeau M2</td><td>Sigma</td><td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>Raifort peroxydase</td><td>Amersham</td><td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td>Pré-coloré étalons de poids moléculaire des protéines</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de chimiluminescence</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>Film d’autoradiographie</td><td>Clonex Corp</td><td>#CLEC810</td><td></td></tr><tr><td>Papier buvard Quick Draw</td><td>Sigma</td><td>#P7796</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à bascule à plate-forme C2</td><td>New Brunswick Scientific, États-Unis<td</td><td></td><td></td></tr> <tr>colspan="4"><fort>8. Équipement et réactifs de sonication </td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">9. Réactifs et équipement de purification d’affinité </td></tr><tr><td>0,8 x 4 cm Colonne en polypropylène Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>#732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase benzonase</td><td>Novagen</td><td>#70746</td><td></td></tr><tr><td>Perles d’agarose anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>Perles de calmoduline-sépharose</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>TEV protéase</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake</td><td>Shaker Thermolyne</td><td>#59558</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10. Réactifs de coloration à l’argent </fort></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Bioshop</td><td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Bioshop</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-thiosulfate</td><td>Sigma</td><td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate d’argent</td><td>Fischer Scientific</td><td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Bioshop</td><td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate</td> <td>de sodiumBioshop</td><td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">11. Réactifs et équipements pour l’identification des protéines </td></tr><tr><td>Trypsin Gold, Spectrométrie de masse Grade</td><td>Promega</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH4HCO3</td><td>Bioshop</td><td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Formic acide</td><td>Sigma</td><td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>eau de qualité HPLC</td><td>Sigma</td><td>#95304</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma</td><td>#16125</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Zip-Tip</td><td>Millipore</td><td># ZTC18M960</td><td></td></tr><tr><td>~10 cm de 3 &mu ; m Luna-C18 résine</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon nano Pompe HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos spectromètre</td><td></td><td>de masse Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">12. Matériel de laboratoire</td></tr><tr><td>Fioles coniques de 4 litres</td><td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes de faucon en polypropylène</td><td>N’importe quel fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes micro-centrifugeuses de 1,5 ml</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml de flacons</td><td>coniques VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture stériles de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques</td><td>VWR</td><td>#479-3221-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg ; C congélateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>Système de vide rapide</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tampons et solutions 1. 1 litre de bouillon Terrific (TB) média 11 g de Bio-Tryptone 22 g d’extrait de levure 2 % de glycérol 50 ml de bouillon de sel de potassium solution 2. Solution mère de sel de potassium 1,5 M K2HPO4 0,35 M KH2PO4 3. Tampon de sonication 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10 % Glycérol Avant utilisation, ajouter un inhibiteur de protéase (PI) et 0,1-0,5 mM de TCEP 4. Tampon AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1 % détergent Avant utilisation, ajouter PI et 0,1-0,5 mM TCEP 5. Tampon de clivage TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1 % détergent Avant utilisation, ajouter PI et 0,1-0,5 mM TCEP 6. Tampon de liaison à la calmoduline 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1 % détergent Avant utilisation, ajouter PI et 0,1-0,5 mM TCEP 7. Tampon de lavage à la calmoduline 30 mM Tris-HCl pH 7,9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1-0,5 mM TCEP 8. Tampon d’élution de calmoduline 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0,1-0,5 mM TCEP 9. Solution de développement (1L) 37 % Formaldéhyde 30 g de carbonate de sodium 1000 ml d’eau distillée 10. Tampon de digestion 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Solution de mouillage et d’équilibration acétonitrile à 70 % (ACN) dans de l’acide formique à 0,1 % 12. Solution de lavage 100 % H2O dans de l’acide formique à 0,1 %</td></tr></tbody></table>

identification des complexes protéiques dans<em&gt; escherichia coli</em&gt; en utilisant séquentielle purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Comme la plupart des processus cellulaires sont médiés par des assemblages macromoléculaires, l&#39;identification systématique des interactions protéine-protéine (PPI) et l&#39;identification de la composition de sous-unité du complexe multi-protéique peut donner un aperçu de la fonction des gènes et améliorer la compréhension des systèmes biologiques 1, 2. Interactions physiques peuvent être mis en correspondance avec confiance vialarge échelle haute isolation et la caractérisation des complexes de protéines endogènes dans des conditions proches des conditions physiologiques basés sur la purification par affinité des protéines chromosomiques marqués en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS). Cette approche a été appliquée avec succès dans les organismes évolutivement divers, y compris les levures, les mouches, les vers, les cellules de mammifères, et les bactéries 1-6. En particulier, nous avons généré une affinité carboxy-terminale de peptides séquentielle (SPA) pour système de marquage double affinité de purification des complexes protéiques natifs de culture d&#39;Escherichia coli à Gram négatif, en utilisant genetically-traitables souches de laboratoire d&#39;accueil qui sont bien adaptés à l&#39;échelle du génome des enquêtes sur la biologie fondamentale et les processus conservées des procaryotes 1, 2, 7. Notre SPA-tagging système est analogue à la méthode de purification d&#39;affinité en tandem développé à l&#39;origine pour la levure 8, 9, et se compose d&#39;un peptide liant la calmoduline (CBP), suivi par le site de clivage pour la protéase du virus hautement spécifique du tabac etch (TEV) et trois copies du FLAG (FLAG 3X) épitope, ce qui permet deux cycles consécutifs d&#39;enrichissement par affinité. Après amplification de cassette, spécifiques d&#39;une séquence linéaire des produits de PCR codant pour la SPA-tag et un marqueur de sélection sont intégrés et sont exprimées en tant que cadre carboxy-terminaux dans un fond fusions DY330 qui est induite à exprimer de façon transitoire un système hétérologue est performant bactériophage lambda recombinaison 10. Après deux étapes de purification utilisant la calmoduline et billes d&#39;affinité anti-FLAG permet sélective hautementet une récupération efficace de même de faibles complexes protéiques d&#39;abondance des cultures à grande échelle. Spectrométrie de masse tandem est ensuite utilisé pour identifier de façon stable les co-purification de protéines avec une sensibilité élevée (faibles limites de détection nanogramme). Ici, nous décrivons détaillées étape par étape, les procédures communément utilisés pour le marquage des protéines systématique, la purification et la spectrométrie de masse basée sur l&#39;analyse des complexes protéiques solubles de E. coli, qui peuvent être étendus et potentiellement adaptée à d&#39;autres espèces bactériennes, y compris certains agents pathogènes opportunistes qui se prêtent à recombineering. Les interactions physiques qui en découlent peuvent souvent révéler intéressantes composants et des connexions inattendues suggérant de nouveaux liens mécanistes. Intégration des données PPI avec remplacement des données d&#39;association moléculaire, tels que génétiques (gène-gène) les interactions et la génomique contexte (GC) des prédictions peuvent faciliter l&#39;élucidation de l&#39;organisation mondiale moléculaire de complexes multi-protéiques dans les deuxvoies méthodologiques. Les réseaux générés pour E. coli peuvent être utilisées pour mieux comprendre l&#39;architecture fonctionnelle des produits des gènes orthologues dans d&#39;autres microbes dont annotations fonctionnelles font actuellement défaut.

Une fois les protéines appâts marquées, exprimées à des niveaux endogènes, purifiées par affinité à partir de cultures en phase logarithmique, les échantillons ont été analysés sur un gel coloré à l'argent afin de visualiser les composants polypeptidiques individuels des complexes stables isolés. Nous avons également soumis une seconde portion des échantillons protéiques purifiés par affinité à une spectrométrie de masse tandem sans gel (LCMS) afin d'identifier les séquences polypeptidiques correspondantes. L'efficacité ...

La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d&#39;interactions protéiques et d&#39;enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d&#39;affinité (SPA) procédure APMS développé pour la bactérie<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Qui peut être utilisé pour isoler et caractériser stables complexes multi-protéiques jusqu&#39;à homogénéité à partir de près de même faible nombre de copies par cellule.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

L'objectif de cette expérience est d'identifier les protéines, les interactions protéiques et la composition en sous-unités des complexes MultiPro natifs provenant d’e. coli. Ceci est réalisé en amplifiant des produits PCR linéaires spécifiques à la séquence, codant pour la marque SPA et un marqueur sélectionnable, qui sont intégrés et exprimés en phase comme fusions carboxy-terminales dans un fond ddy 3, 3 0 à l’aide du système de recombinaison bactérienne Fage lambda. Dans une deuxième étape, une purification double est effectuée à l’aide de billes d’affinité cow modlin et Anti-Flag afin de récupérer efficacement les complexes protéiques peu abondants. Ensuite, les protéines liées, élutées avec cow modlin, un tampon d’élution ou CEB, sont digérées par la trypsine et analysées par spectrométrie de masse pour l’identification des protéines.Les résultats obtenus montrent que plusieurs sous-unités de l'enzyme ARN polymérase, y compris les facteurs de terminaison de la transcription et les facteurs anti-détermination, co-purifient efficacement avec la sous-unité D de l'ARN polymérase marquée, indiquant que les composants nouvellement associés peuvent être efficacement identifiés à l'aide de cette approche. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés lors des deux cycles de purification par affinité, où un traitement soigneux des lysats cellulaires à l'aide de solutions tampons appropriées est absolument nécessaire pour assurer la récupération efficace des complexes porteurs de faible et de forte abondance à partir de cultures à grande échelle. La réalisation des procédures de purification par affinité et de spectrométrie de masse sera démontrée par Olga Kagan et HBO guo, deux techniciennes de mon laboratoire. Ce protocole commence par le ciblage de séquences amplifiées spécifiques vers la souche DDY trois 30, dans laquelle le système de recombinaison Lambda red est exprimé comme décrit dans le protocole écrit.Ensuite, cultiver la souche exprimant le système de recombinaison bactériophage Lambda pendant la nuit dans deux millilitres de milieu Luria bacto ou milieu LB à 32 degrés Celsius, sous agitation à 180 tr/min. Le jour suivant, ensemencer un millilitre de la culture de nuit dans 70 millilitres de milieu LB frais, dans un flacon conique de 500 millilitres. Faire croître l'inoculum à 32 degrés Celsius sous agitation à 180 tr/min jusqu'à ce que la DO à 600 atteigne environ 0,8. Induire les cellules en incubant le flacon dans un bain-marie à 42 degrés Celsius, sous agitation douce à 180 tr/min, pendant 15 minutes.Immédiatement après l'induction, incuber le flacon dans un bain de glace pilée et d'eau pendant au moins 30 minutes sous agitation. Après avoir récolté et lavé les cellules comme décrit dans la procédure écrite, Reese resuspend le culot cellulaire dans 700 microlitres d'eau stérile, froide et glacée, produisant ainsi des cellules électrocompétentes par électroporation. Introduire un microlitre de l'amplicon purifié dans 40 microlitres des cellules électrocompétentes.Les cellules sont électroporées après la recombinaison homologue et l'intégration. Les transformants ayant correctement recombiné le marqueur ou cassette dans le chromosome sont sélectionnés en fonction de leur résistance à la canamycine ; sélectionnez plusieurs transformants pour un immunoblot afin de vérifier la production correcte des protéines de fusion marquées SPA à l’aide de l’anticorps Anti-Flag M2, spécifique des épitopes Flag du marqueur SPA. Transférez 10 millilitres de la culture de nuit dans 990 millilitres de milieu TB frais, supplémenté avec 25 microgrammes par millilitre de canamycine, dans un flacon de quatre litres.Faire croître la culture à 32 degrés Celsius avec agitation constante à 250 tr/min pendant cinq à six heures, jusqu'à ce que la DO 600 atteigne une valeur comprise entre 2 et 3. Transférer un litre de la culture d'E. coli avec marqueur SPA dans des bouteilles de centrifugation propres et centrifuger les cellules à 4 degrés Celsius et à 3 993 ×g pendant 15 minutes. Après avoir resuspendu les cellules comme décrit dans le protocole écrit.Transférez les échantillons dans un récipient stérile en acier inoxydable placé sur de la glace pour la sonication. Immergez la sonde dans l'échantillon et soumettez-le à la sonication pendant trois minutes. Après la sonication, laissez refroidir l'échantillon deux minutes supplémentaires afin d'éviter toute surchauffe, puis procédez à la centrifugation du lysat soniqué.Transférez soigneusement le surnageant S du tube de centrifugation vers un tube Falcon en polypropylène de 50 millilitres. Congelez l'échantillon à l'aide d'azote liquide et conservez l'extrait cellulaire soniqué congelé pendant une période maximale de six mois à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Pour commencer la purification par affinité de l'extrait cellulaire soniqué congelé, placez le tube dans de l'eau froide, puis incubez l'extrait cellulaire TH avec trois microlitres de benzo, une nucléase, pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.À ce mélange, ajoutez le détergent non ionique Triton X-100 et 200 microlitres de suspensions de billes Anti-Flag M2 agro. Mélangez délicatement le contenu en faisant tourner le tube pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Après trois heures de rotation, centrifugez le tube à 1 700 ×g pendant six minutes. Après la centrifugation, retirez soigneusement autant de surnageant que possible sans perturber le culot lâche.Ré-suspendre le culot dans le SNA restant, puis transférer dans une colonne de préparation en polypropylène. Retirer les bouchons du fond de la colonne pour permettre l'écoulement du liquide par gravité. Ensuite, laver la colonne cinq fois avec 200 microlitres de tampon FC à une fois, puis procéder à la clivaison avec la TEV comme décrit dans le protocole écrit.Après le clivage, fermez hermétiquement les extrémités supérieure et inférieure de la colonne. Mélangez délicatement le contenu de la colonne en la faisant tourner toute la nuit à quatre degrés Celsius après une rotation nocturne. Élué le liquide en retirant le bouchon supérieur et le bouchon inférieur dans la nouvelle colonne.Lavez la colonne usagée avec 400 microlitres de tampon de liaison Cal Modlin 1 x et une suspension de 150 microlitres de billes de liaison Cal Modlin. Éluéz la protéine liée en quatre fractions de 50 microlitres dans un nouveau tube eppendorf. En utilisant un tampon d'élution Cal Modlin 1 x.Répartir la fraction éluée en deux tubes eend orph propres en volumes égaux. Ensuite, sécher les contenus des deux tubes à l'aide d'un évaporateur sous vide. L'éluat séché provenant d'un tube est utilisé pour réaliser un gel de coloration argentée comme décrit dans le texte, tandis que l'autre est stocké à moins 80 degrés Celsius.Pour une utilisation ultérieure en spectrométrie de masse sur l'échantillon séché, ajouter 50 microlitres de tampon de digestion et 0,9 microlitre de tris-phosphine à 100 millimolaire en acide chlorhydrique, puis incuber le mélange pendant 45 minutes à température ambiante pour l'étape de réduction. Ensuite, ajouter un microlitre d'acétamide IDO à 500 millimolaire et incuber à l'obscurité pendant 40 minutes supplémentaires afin de permettre l'alkylation de l'échantillon. Après ce second temps d'incubation, ajouter un microgramme de trips au mélange. Incuber l'échantillon soit à 37 degrés Celsius pendant cinq heures, soit toute la nuit à température ambiante après l'incubation.Veillez à arrêter la réaction en ajoutant un microlitre d'acide acétique. Préparez ensuite la micropointe Millipore, la pipette selon les instructions décrites dans le texte pour une liaison efficace du peptide à la micropointe. Mélangez le mélange de peptides 20 fois et rincez le mélange de peptides fixé à la pointe en aspirant et en dispensant la solution de lavage.Répétez cette procédure deux fois afin d'assurer une liaison efficace du mélange de peptides à l'embout contenant le peptide fixé. Aspirez 10 microlitres de la solution d'humidification et d'équilibrage et délivrez-les dans un nouveau tube Eppendorf propre. Répétez cette étape deux fois.Après avoir séché les échantillons élutés dans un vide accéléré, les échantillons peuvent être analysés immédiatement par spectrométrie de masse ou stockés à moins 80 degrés Celsius avant utilisation. Les microcolonnes utilisées dans cette procédure sont remplies d'environ 10 centimètres de résine lunaire C18 de trois microns et sont connectées à une source d'ionisation électrospray nano Pro Zion placée en ligne avec l'instrument Orbitrap. Une pompe HPLC binaire à débit nano Pro Zion est utilisée pour délivrer un débit stable d'environ 300 nanolitres par minute pendant les séparations peptidiques afin d'obtenir une dilution des peptides, et de mettre en place un gradient de tampon organique en fonction de la complexité de l'échantillon.Pour cet échantillon d'E. coli SPA, le solvant de phase mobile A contient 95 % d'eau HPLC pour gradient et 5 % d'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique, tandis que le solvant B contient 5 % d'eau HPLC pour gradient et 95 % d'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique. Après la spectrométrie de masse, rechercher les spectres à l'aide d'un algorithme de recherche dans une base de données, tel que SEQUEST, contre une base de données de séquences protéiques d'E. coli. Filtrer statistiquement les résultats à l'aide d'un algorithme de probabilité tel que STARPEP pour garantir un faible taux de découverte d'erreurs. Le facteur sigma de la polymérase ARN marqué SPA et la protéine YakLA, de fonction inconnue, co-purifient spécifiquement avec l'enzyme polymérase ARN centrale, incluant les sous-unités alpha, bêta et bêta prime, ainsi qu'avec le facteur de recyclage de la polymérase ARN. En revanche, YakL, contrairement au facteur sigma de la polymérase ARN marqué, se lie en outre à un facteur essentiel de terminaison de la transcription et d'anti-détermination, suggérant une fonction spécialisée dans la transcription.Plusieurs autres petites protéines co-purifiées ont également été détectées par LC-MS et n'étaient pas visibles sur le gel, notamment la sous-unité Oméga de l'ARN polymérase ainsi que des facteurs de transcription, de terminaison et de détermination, USA et NUSD. Inversement, dans une expérience indépendante portant sur la machinerie de mobilisation du soufre, S-U-F-B-S-U-F-C et SUFD se sont co-purifiés mutuellement, indiquant une participation conjointe à la biosynthèse des clusters fer-soufre en tant que complexe d'échafaudage unique. Cet exemple représentatif met en évidence le fait que des complexes MultiPro bactériens bien étudiés et hautement annotés, impliqués dans des processus biologiques essentiels, possèdent souvent de nouveaux composants associés qui peuvent être efficacement identifiés.Grâce à cette approche, le faible nombre de copies de la protéine SUFB a pu entraîner une intensité de signal faible par rapport à l'intensité forte observée lors des expériences de tirage immunologique de SUFC et SUFD, permettant de définir la composition de complexes protéiques stables formés de plusieurs unités. Des scores de co-purification ont été attribués aux interactions de haute confiance en tenant compte de l'unicité des relations appât-proie, appât-appât et proie-proie. Ensuite, à l'aide de procédures de regroupement par graphes, telles que l'algorithme de regroupement markovien, des groupes protéiques distincts ont été identifiés à partir du réseau probabiliste de PPI partitionné.Les réseaux d'interaction putatifs peuvent être visualisés à l'aide de cyto scape. La combinaison de données de protéomique avec des preuves supplémentaires d'associations fonctionnelles déduites par des méthodes de génomique peut être utilisée pour étudier de nouveaux rôles mécanistiques des protéines e coli précédemment annotées. Ici, des sous-réseaux de complexes protéiques et de modules fonctionnels participant à des voisinages fonctionnels plus larges ont été définis chez e coli.Le principal regroupement hiérarchique de Graham montre les profils de prédictions fonctionnelles et d'annotations existantes pour les gènes orphelins fonctionnels et caractérisés d’*E. coli* ; les couleurs jaune et bleue représentent respectivement les fonctions existantes et prédites, tandis que l’intensité des teintes reflète les scores de confiance. Les processus biologiques associés à divers voisinages sont indiqués à droite ; les encarts montrent les composants individuels d’un voisinage représentatif, basés sur les scores de similarité du réseau intégré d’interactions physiques et fonctionnelles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière dont les complexes protéiques stables d’*E. coli* peuvent être isolés par l’approche de purification par affinité couplée à la spectrométrie de masse.En principe, cette technique peut être appliquée pour caractériser des complexes de protéines membranaires ou des complexes protéiques provenant de n'importe quelle autre espèce, pour autant qu'ils puissent se recombiner.

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Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite sont indispensables pour toutes les fonctions cellulaires. Ici, les auteurs décrivent un protocole qui permet une analyse parallèle de ces interactions avec une protéine de choix. Notre protocole a été optimisé pour les cultures de cellules végétales et combine purification d’affinité avec la protéine basé sur la spectrométrie de masse et de la détection de métabolite.

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Nous présentons ici un protocole visant à contrôler le montage et le démontage de la toxine du charbon à l’aide de biolayer l’interférométrie (BLI). Suite de montage/démontage sur la surface du biocapteur, les complexes de protéine importante sont dispensés de la surface pour la visualisation et l’identification des composantes des complexes à l’aide de la microscopie électronique et microanalyse, respectivement.

Analyse des Complexes protéiques dynamique assemblés sur et libéré de Biolayer interférométrie biocapteur à l’aide de la spectrométrie de masse et de microscopie électronique

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

Nous présentons ici un protocole pour l’identification rapide des protéines produites par des bactéries pathogènes séquencées génomiquement en utilisant la spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et l’analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. Les ions protéiques métastables se fragmentent en raison de l’effet acide aspartique et cette spécificité est exploitée pour l’identification des protéines.

Identification des protéines d’immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d’une analyse protéomique descendante

Découvrez l'identification des complexes protéiques dans Escherichia coli par purification d'affinité séquentielle couplée à la spectrométrie de masse. Cette méthode permet d'isoler efficacement les protéines peu abondantes et de révéler de nouvelles interactions.

Identification des complexes protéiques dans Escherichia coli En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem (Vidéo) | JoVE Journal

Identification des complexes protéiques dans

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