Imagerie de phase quantitative tridimensionnelle pour la caractérisation des sous-types de lymphocytes

Chargez une suspension de sous-type de lymphocytes dans une chambre d’imagerie.

Positionnez la chambre sur la platine du microscope d’imagerie quantitative en phase 3D.

Ajustez les paramètres du microscope et le plan focal pour une imagerie optimale.

Lors de l’imagerie lymphocytaire, le faisceau laser se divise en faisceaux de référence et en faisceaux d’échantillons.

Le dispositif numérique à micromiroirs, doté d’un réseau de micromiroirs sur la trajectoire du faisceau de l’échantillon, permet au faisceau de pivoter à 360 degrés autour de l’axe optique.

Chaque faisceau traversant le lymphocyte subit un déphasage basé sur les variations de l’indice de réfraction à l’intérieur de la cellule.

L’échantillon et les faisceaux de référence résultants se recombinent, formant un hologramme 2D.

Une séquence d’hologrammes contenant des informations de phase et d’amplitude sous différents angles est capturée par la rotation du faisceau autour du lymphocyte.

Acquérez plusieurs hologrammes d’arrière-plan avec différents angles d’éclairage, à l’exclusion des lymphocytes.

À l’aide de l’algorithme de tomographie par diffraction, reconstruisez les hologrammes en un tomogramme à indice de réfraction 3D, fournissant des informations morphologiques et biochimiques sur les lymphocytes sans qu’il soit nécessaire de les étiqueter.

Pour une imagerie optimale, diluez chaque échantillon cellulaire à une concentration de 180 cellules par microlitre de milieu RPMI, et injectez lentement 120 microlitres du premier échantillon dilué dans une chambre d’imagerie. Après avoir vérifié l’absence de bulles à l’intérieur de la chambre, placez une goutte d’eau distillée sur la lentille de l’objectif d’un microscope quantitatif en phase 3D, puis placez la chambre d’imagerie sur la platine de translation du microscope. Ajustez la platine de sorte que l’échantillon s’aligne avec l’objectif et cliquez sur Focus et surface dans l’onglet Étalonnage de la perspective du microscope du logiciel d’imagerie, pour ajuster les positions axiales de l’objectif et des lentilles du condenseur respectivement.

Cliquez sur Mode automatique pour aligner l’objectif et les objectifs du condenseur. Pour optimiser l’alignement, ouvrez le mode de balayage et ajustez manuellement les lentilles pour aligner le motif du dispositif à micromiroir numérique au centre. Ensuite, revenez au mode normal et ajustez l’étape de translation pour localiser une cellule dans le champ de vision. Ajustez la position axiale de l’objectif pour trouver le plan focal jusqu’à ce que la limite de l’échantillon visualisée à l’écran soit presque invisible.

Il est important d’ajuster parfaitement la mise au point de la cellule pour générer un tomogramme 3D RI optimal. Si l’image n’est pas prise correctement, la reconstruction 3D sera altérée, ce qui entraînera un tomogramme bruyant.

Ajustez la platine de translation pour trouver un emplacement sans cellule, puis cliquez sur Calibrer pour mesurer plusieurs hologrammes 2D avec différents angles d’éclairage. Ajustez l’étape de translation pour localiser une cellule au centre du champ de vision et, sous l’onglet Acquisition, nommez l’échantillon imagé.

Cliquez sur Instantané 3D pour mesurer les hologrammes de la cellule en utilisant les mêmes angles d’éclairage que pour les hologrammes 2D qui viennent d’être mesurés. Lorsque les données acquises apparaissent dans le panneau de gestion des données, cliquez avec le bouton droit de la souris sur les données, puis cliquez sur Traiter pour reconstruire un tomogramme à indice de réfraction 3D à partir des hologrammes 2D à l’aide de l’algorithme de tomographie par diffraction implémenté dans le logiciel d’imagerie. Après l’imagerie, dans le panneau Gestion des données, cliquez avec le bouton droit de la souris sur les données, puis cliquez sur Ouvrir pour visualiser les données.

Cliquez au centre de la cellule pour la repositionner, puis cliquez sur Tomogramme RI dans le panneau Gestionnaire de données. Dans l’onglet Préréglage, cliquez sur Charger et double-cliquez sur lymphocytes.xml, qui est une fonction de transfert prédéfinie fournie par le logiciel d’imagerie pour visualiser le tomogramme en fonction des distributions 3D RI. Faites défiler la souris pour zoomer et faites glisser la cellule pour la faire pivoter dans n’importe quelle direction.