Une technique in vitro pour étudier l’interaction des lymphocytes T avec des bicouches lipidiques planes soutenues

Prenez une lame d’écoulement contenant une bicouche lipidique supportée, ou SLB.

La SLB est conjuguée à des ligands spécifiques – la molécule d’adhésion intercellulaire 1 ou ICAM-1 et les anticorps anti-CD3 – marqués avec des fluorophores.

Ajoutez des lymphocytes T et un anticorps anti-CD107a Fab marqué au fluorophore, le fragment de liaison à l’antigène d’un anticorps contre le marqueur de dégranulation.

Le complexe récepteur des lymphocytes T-CD3 ou TCR-CD3 se lie à l’anticorps anti-CD3, déclenchant le TCR.

La signalisation de l’intérieur vers l’extérieur induite par le déclenchement active les intégrines à la surface, qui se lient à l’ICAM-1 immobilisé.

La conjugaison induit une réorganisation cytosquelettique - réarrangement des microtubules et polymérisation de l’actine qui conduit à l’étalement latéral de la cellule à la surface de la SLB.

La propagation permet à davantage d’interactions ligand-récepteur de former un cluster d’activation supramoléculaire ou SMAC, créant une synapse immunitaire.

Les granules lytiques des lymphocytes T se déplacent le long des microtubules et fusionnent avec la membrane plasmique, exposant des marqueurs de dégranulation à la surface de la cellule, qui se lient à l’anti-CD107a Fab.

À l’aide d’un microscope à fluorescence, visualisez la synapse immunitaire enrichie en complexes TCR-CD3, en intégrines et en marqueurs de dégranulation.

Commencez par utiliser une pince en polypropylène de type ciseaux pour immerger les lamelles en verre dans une solution acide de piranha fraîchement préparée pendant 25 à 30 minutes. À la fin du lavage, rincez les lamelles sept fois dans un volume frais d’eau ultra-pure pour chaque lavage, et mettez les lamelles humides de côté pour laisser l’eau restante s’écouler du verre propre.

Lorsque les lamelles sont sèches, prélever deux microlitres du mélange final de liposomes, précisément, au centre d’un canal de lame auto-adhésif à l’intérieur d’une hotte d’écoulement stérile, et immédiatement mais soigneusement, aligner une lamelle propre et sèche avec la lame pour permettre à la lamelle d’être doucement abaissée sur le côté collant de la lame, et utilisez l’anneau extérieur de la pince de type ciseau en polypropylène pour appliquer une légère pression sur le contact périphérique de la lamelle avec la glissière, en s’assurant que la glissière est bien fixée à la glissière pour éviter les fuites. Ensuite, retournez la diapositive et utilisez un marqueur permanent pour dessiner quatre points autour du bicouche sur le côté extérieur de l’ensemble de diapositives.

Avant la première injection, désignez un port du canal comme port d’entrée et l’autre comme port de sortie, en maintenant cette désignation tout au long de l’expérience. Pour éviter la formation de bulles, insérez l’extrémité de la pointe de la pipette directement dans l’orifice d’entrée jusqu’à ce que vous sentiez le joint en caoutchouc du canal de la glissière pénétrer avec la pointe.

Lentement, remplissez le canal avec 50 microlitres de tampon de dosage chaud. Injectez 200 microlitres de chlorure de nickel(II) dans une solution bloquant la caséine dans l’orifice d’entrée et retirez 50 microlitres de tampon de l’orifice de sortie. Après une incubation de 45 minutes, retirez l’excès de solution de caséine de l’orifice de sortie.

Injecter 100 microlitres d’une solution d’ICAM-1 et de streptavidine dans l’orifice d’entrée pour une incubation de 45 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, retirez l’excès de solution protéique de l’orifice de sortie et lavez la bicouche deux fois avec 100 microlitres de tampon de dosage par lavage. Ensuite, étiquetez les bicouches avec 100 microlitres d’anticorps anti-CD3 conjugué au fluorophore pendant 45 minutes à température ambiante, suivi de deux lavages dans 100 microlitres de tampon de dosage par lavage, comme démontré.

Pour imager les interactions lymphocytes T-bicouche, placez la lame sur la platine chauffée à 37 degrés Celsius d’un microscope à fluorescence par réflexion interne totale, ou TIRF, et ajustez la platine à l’aide des marques d’encre pour centrer la bicouche sur l’objectif de puissance 100.

Pour l’imagerie à libération de granules, ajoutez des fragments Fab d’anticorps anti-CD107a conjugués à la fluorescence dans la suspension de lymphocytes T CD4, et remettez en suspension les cellules marquées dans 50 microlitres de tampon de test pour injection dans le port d’entrée du canal de lame. Ensuite, sélectionnez le nombre approprié de champs expérimentaux et enregistrez des images de chaque champ une fois par minute pendant 30 minutes après l’injection.