Utilisation de bicouches lipidiques soutenues par des billes pour étudier la sortie synaptique des lymphocytes T

Prenons l’exemple des billes de silice bicouches lipidiques soutenues par des billes, des billes de silice recouvertes de bicouches lipidiques conjuguées à des complexes peptides antigéniques-CMH, des molécules d’adhésion et de co-stimulation, agissant comme des cellules présentatrices d’antigènes synthétiques.

Incuber avec des lymphocytes T.

Les TCR se lient à des peptides antigéniques sur les BSLB, qui, avec des signaux de co-stimulation, forment une synapse immunitaire, activant les lymphocytes T.

Cette liaison déclenche des cascades de signalisation intracellulaire, induisant un réarrangement de l’actine et formant des micrograppes au niveau de la synapse contenant des molécules d’adhésion et de signalisation.

Les lymphocytes T libèrent dans la synapse des vésicules transsynaptiques enrichies en TCR, des molécules de co-stimulation et du contenu des granules lytiques dans la synapse, se liant aux BSLB.

Refroidissez progressivement la co-culture pour séparer les BSLB des lymphocytes T.

Centrifugez et jetez le surnageant. Utilisez un tampon contenant des protéines pour bloquer les sites de liaison libres sur les surfaces.

Centrifugez et traitez les BSLB et les lymphocytes T avec des anticorps conjugués aux fluorophores qui se lient à des molécules de signalisation et de co-stimulation spécifiques.

À l’aide de la cytométrie en flux, analysez les signaux de fluorescence des BLB et des lymphocytes T pour quantifier la sortie synaptique.

Remettre en suspension 500 000 BSLB par puits dans 200 microlitres de tampon HBS/HSA. Transférez 100 microlitres de BSLB par puits sur une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U pour faire une copie, de sorte que la quantité finale de BSLB par puits soit de 250 000. Faites tourner les BSLB à 300 fois g pendant deux minutes à température ambiante. Jetez le surnageant, puis remettez en suspension les BSLB à l’aide de 100 microlitres de suspension de lymphocytes T. Mélangez doucement pour éviter la formation de bulles. Incuber les co-cultures pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius.

Protégez les cellules de la lumière et refroidissez les co-cultures en les incubant d’abord à température ambiante pendant au moins 15 minutes. Centrifuger les co-cultures à température ambiante pendant 5 minutes à 500 fois g. Jeter le surnageant et remettre en suspension les co-cultures dans du BSA-PBS sans ions calcium et magnésium à 2 % à température ambiante pour le blocage. Placez les cellules sur de la glace pendant 45 minutes et protégez-les de la lumière.

Préparez le mélange maître d’anticorps en utilisant du BSA et du PBS à 2 % filtrés par 0,22 micromètre comme tampon de coloration. Ce master mix fournira un blocage supplémentaire. Faites tourner les co-cultures à 500 fois g pendant 5 minutes et 4 degrés Celsius. Jetez les surnageants, puis utilisez une pipette multicanaux pour remettre en suspension les cellules dans le mélange maître sur pied contenant des concentrations d’anticorps optimisées.

Comprend les cellules et les BSLB marqués par isotype, les BSLB fluorescents et non fluorescents, et les cellules et les BSLB colorés seuls. Mélangez doucement en pipetant de haut en bas sur la moitié du volume. Incuber 30 minutes sur de la glace et les protéger de la lumière. Lavez les cellules et les BSLB deux fois avec du BSA-PBS glacé à 2 % : faites-les tourner à 500 fois g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Après centrifugation, vérifiez les co-cultures sédimentées au fond des puits. Ensuite, remettez en suspension les co-cultures lavées dans 100 microlitres de PBS et acquérez immédiatement.