Dosage planaire des lipides bicouches : une technique in vitro basée sur la microscopie pour étudier l’assemblage de la septine sur des mimiques de membranes biologiques

Les septines sont des protéines cytosquelettiques comprenant un domaine de liaison au GTP flanqué de domaines aminés et carboxyles terminaux, avec une capacité inhérente à s’auto-assembler en filaments et en structures d’ordre supérieur au niveau de la membrane plasmique interne pour diverses fonctions cellulaires.

Pour étudier les interactions septine-membrane in vitro à l’aide d’un mimétique de membrane biologique, procurez-vous un tube de microcentrifugation coupé. Appliquez de l’adhésif ultraviolet sur le bord plat non coupé et positionnez-le sur une lamelle en verre hydrophile traité au plasma. Lors de l’exposition à la lumière ultraviolette, l’adhésif durcit, créant une chambre de réaction ouverte.

Transférez dans la chambre des vésicules lipidiques unilamellaires zwitterioniques monodispersées de composition lipidique souhaitée, complétées par un tampon contenant des cations mono- et divalents. Les cations facilitent l’adsorption et l’accumulation des vésicules lipidiques sur la lamelle. Secouez doucement la chambre, initiant la rupture de la vésicule, et incuber.

Les vésicules rompues se déplient et fusionnent avec la lamelle via leurs groupes de tête hydrophiles, formant des plaques bicouches lipidiques planes. Les bords des plaques déclenchent la rupture des vésicules restantes, générant une bicouche lipidique continue soutenue par un planaire, SLB. Retirez l’excès de vésicules non adsorbées avec un tampon approprié.

Ensuite, ajoutez une suspension de septine marquée par fluorescence avec un tampon contenant un agent d’encombrement et incuber. Les agents d’encombrement permettent aux septines de se déposer sur la lamelle recouverte d’un SLB. Dans des conditions optimales, les septines peuvent s’associer aux lipides de la SLB, s’assemblant en structures organisées.

Éclairer sélectivement la lamelle à l’aide de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour exciter les septines marquées par fluorescence collées sur le SLB afin d’observer l’assemblage des septines.

Pour commencer le nettoyage au plasma des lames, purgez le nettoyeur au plasma pendant 5 minutes avec de l’oxygène pour éliminer l’air des conduites et de la chambre. Disposez les lames de verre à couverture sèche dans un berceau en céramique. Pendant la purge, faites passer un gaz inerte sur les lames de verre de micro-couverture pour éliminer la poussière et les particules.

Placez le berceau à l’arrière de la chambre à plasma de manière à ce que les lamelles soient parallèles au bord long de la chambre. Faites fonctionner le nettoyeur plasma pendant 15 minutes avec de l’oxygène à puissance maximale.

Pour la préparation de la chambre, coupez le capuchon juste en dessous de la partie givrée d’un tube PCR de 0,2 millilitre. Peignez le bord du tube PCR avec un adhésif activé par les UV, en évitant l’intérieur du tube. Placez délicatement le tube PCR collé au centre d’une lamelle nettoyée au plasma, puis placez la chambre sous une lumière UV à longue longueur d’onde pendant 5 à 7 minutes pour durcir l’adhésif.

Pour former une bicouche, ajoutez les réactifs dans le puits. Secouez doucement les chambres d’un côté à l’autre pour perturber les SUV, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Après l’incubation, rincez la bicouche 6 fois avec 150 microlitres de SLBB, par pipetage pour éliminer l’excès de lipides. Ensuite, lavez la bicouche 6 fois avec 150 microlitres de tampon de réaction, avant de l’incuber avec les septines.

Lors de la dernière étape de lavage, retirez le tampon de réaction, en laissant 75 microlitres dans le puits. Ajouter 25 microlitres de septines diluées dans de la SSB, et imager par microscopie TIRF.