Surveillance de l’activation des lymphocytes B avec des liposomes antigéniques à l’aide d’un dosage du flux de calcium

Prenez des splénocytes appauvris en globules rouges dans un tampon contenant un colorant fluorescent sensible au calcium perméable aux cellules, Indo-1 AM.

Les estérases intracellulaires clivent l’Indo-1 AM en Indo-1 imperméable à la membrane, qui se lie aux ions calcium, changeant le signal de fluorescence de l’Indo-1 du bleu au violet.

Introduire des anticorps spécifiques de l’antigène conjugués aux fluorophores qui se lient spécifiquement aux antigènes respectifs sur les cellules.

À l’aide de la cytométrie en flux, identifiez les lymphocytes B marqués au fluorophore et mesurez leur rapport de fluorescence violet-bleu Indo-1.

Maintenant, traitez les cellules avec des liposomes antigéniques comprenant des fragments IgM Fab conjugués à des bicouches de liposomes.

Les récepteurs des lymphocytes B se lient aux antigènes couplés aux liposomes, activant les tyrosine kinases cytoplasmiques associées et déclenchant l’activation de la phospholipase-C gamma-2.

La phospholipase-C activée clive le phospholipide membranaire, le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, générant des seconds messagers, y compris l’inositol 1,4,5-trisphosphate, ou IP3.

L’IP3 se lie aux canaux calciques IP3-dépendants du réticulum endoplasmique, libérant des ions calcium dans le cytoplasme.

Ces ions calcium lient les molécules d’Indo-1 non liées, augmentant la fluorescence violette.

Un rapport de fluorescence violet-bleu Indo-1 plus élevé dans les lymphocytes B marqués confirme leur activation réussie par les liposomes antigéniques.

Pour surveiller la réponse des lymphocytes B à l’activation des liposomes antigéniques, réintroduisez 1,5 x 10⁷ splénocytes dans un tampon de charge de flux calcique et ajoutez 1,5 micromolaire d’Indo-1 aux cellules, en inversant la solution dans le tube plusieurs fois pour mélanger. Après une incubation au bain-marie de 30 minutes à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière, ajoutez 5 fois le volume de tampon de charge de flux de calcium et centrifugez les cellules marquées à l’Indo-1.

Pour le contrôle des lymphocytes B, colorez les cellules avec des anticorps anti-CD5 et anti-B220 dans 0,5 millilitre de tampon de charge à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans un tampon de charge de flux de calcium frais, et remettre en suspension la pastille à 1 à 2 x 10⁷ cellules par millilitre de tampon de flux de calcium frais pour le stockage sur de la glace à l’abri de la lumière, jusqu’à l’analyse.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de cellules dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 millilitres et réchauffez les cellules à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Après 3 à 5 minutes, transférez le tube dans une chambre à chemise d’eau de 37 degrés Celsius reliée à un bain-marie à recirculation, et faites passer le tube dans la chemise d’eau sur le cytomètre en flux.

Après avoir collecté 5 000 à 10 000 événements par seconde, laissez les cellules se stabiliser pendant 15 à 30 secondes et relancez l’acquisition de données, en collectant les données pendant au moins 10 secondes pour établir une lecture d’arrière-plan. Au bout de 10 secondes, retirez rapidement le tube du cytomètre en flux et ajoutez la concentration expérimentale appropriée de liposomes antigéniques. Ensuite, pulsez les cellules et lisez le tube sur le cytomètre pendant 3 à 5 minutes supplémentaires.