Un test de codage à barres pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules immunitaires

Commencez par des échantillons d’essai contenant des cellules immunitaires stimulées et fixes.

La stimulation induit l’expression de marqueurs spécifiques dans les cellules, tandis que la fixation préserve les marqueurs phénotypiques, y compris les antigènes de surface cellulaire, et les marqueurs d’état fonctionnel, y compris les cytokines.

Ajoutez une combinaison unique d’anticorps conjugués aux isotopes des métaux lourds à chaque échantillon.

Cette technique permet d’attribuer un code-barres unique à plusieurs échantillons, en distinguant chaque échantillon par sa combinaison d’isotopes de métaux lourds.

Les anticorps se lient à un épitope commun, codant à barres toutes les cellules des échantillons.

Combinez tous les échantillons à code-barres dans un seul tube, pour un traitement en aval.

Ajoutez un cocktail d’anticorps conjugués au métal pour colorer les antigènes de surface.

Ajouter un tampon de perméabilisation pour augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire pour la coloration intracellulaire.

Ajoutez un autre ensemble d’anticorps conjugués aux métaux pour colorer les cytokines intracellulaires.

Le code-barres permet la coloration et l’acquisition simultanées des échantillons groupés par cytométrie de masse. Cette technique maximise l’efficacité du dosage, améliorant ainsi l’évaluation des marqueurs d’état phénotypiques et fonctionnels.

Pour coder à barres les cellules fixes lysées, décongelez les échantillons du stockage à moins 80 degrés Celsius, lentement sur de la glace. Diluez de 1 à 10 le tampon permanent de code-barres 10x avec PBS et préparez suffisamment de tampon pour 3 millilitres par échantillon.

Remplissez une auge non stérile avec du CSM et une autre avec le tampon permanent 1x code-barres. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de CSM glacé aux échantillons fraîchement décongelés. Mélangez bien et transférez dans les tubes en polypropylène pré-étiquetés respectifs.

Maintenant, prélevez un échantillon de 10 microlitres et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Normalisez le nombre de cellules dans chaque tube de grappe en supprimant le volume de cellules en excès. Ensuite, centrifugez les cellules à 600 fois g pendant 5 minutes à température ambiante. Remettre les cellules en suspension dans 1 millilitre de tampon permanent à code-barres avec une pipette multicanaux, et centrifuger à 600 fois g pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le surnageant.

Alignez les tubes du cluster sur un rack dans le même ordre que celui indiqué sur la clé du code-barres, de sorte que l’échantillon corresponde à son code-barres. Ajoutez 800 microlitres de 1x tampon permanent de codage à barres par pipette multicanaux à tous les échantillons dans les tubes en grappe, sans toucher la pastille de cellule pour réduire la perte de cellule.

Ensuite, mettez de côté le support avec les tubes de grappe. Retirez les bandes de tubes du kit de code-barres en palladium 20-plex à moins 20 degrés Celsius et décongelez-les à température ambiante. Ajoutez 100 microlitres de 1x tampon permanent de code-barres, mélangez soigneusement et transférez 120 microlitres du mélange de codes-barres remis en suspension dans les échantillons de cellules correspondants dans les tubes du grappe.

Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux, afin d’éviter toute contamination croisée entre les échantillons à code-barres individuels. Incuber les tubes en grappe pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux codes-barres d’étiqueter les cellules. Après 30 minutes, centrifugez les échantillons à 600 fois g pendant 5 minutes à température ambiante. Aspirez le surnageant. Ensuite, remettez-les en suspension dans 1 millilitre de CSM. Ensuite, centrifuger et remettre en suspension dans le CSM à nouveau.

Ensuite, centrifugez à 600 fois g pendant 5 minutes à température ambiante et aspirez le surnageant. À l’aide d’une seule pipette et à l’aide de la même pointe, transférez toutes les pastilles de cellules et environ 70 à 80 microlitres de volume résiduel dans un tube de polystyrène. N’éjectez pas la pointe de la pipette. Mettez de côté la pipette unique avec cette pointe.

À l’aide d’une pipette multicanaux et de nouvelles pointes, ajoutez 100 microlitres de CSM à chaque tube de grappe d’origine pour maximiser la récupération des cellules. À l’aide de la pipette unique avec l’embout qui a été mis de côté, transférez toutes les pastilles de cellules de 100 microlitres de volume résiduel dans le même tube de polystyrène. Ajoutez du CSM pour compléter le tube de polystyrène à environ 3 millilitres. Comptez et enregistrez le numéro de cellule de l’ensemble de codes-barres regroupés. Ensuite, centrifugez à 600 fois g pendant 5 minutes à température ambiante et aspirez le surnageant. Procéder à la coloration des échantillons à code-barres le même jour.