Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de l’auto-immunité, telles que l’identification des anomalies de fréquence cellulaire et des différences de fonction, telles que la production de cytokines clés dans le cadre d’une maladie auto-immune. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle peut capturer un large répertoire de différents types de cellules et de différences de fonction à partir d’un échantillon de sang périphérique facilement obtenu. En général, les personnes qui débutent dans ce processus peuvent avoir du mal à déterminer le bon timing des étapes de traitement du sang, la conception du panel d’anticorps, le processus de codage à barres lui-même et l’analyse de données de cellules uniques de grande dimension.

Cette approche d’immunologie systémique est particulièrement adaptée aux maladies auto-immunes comme le LED, où la dérégulation immunitaire est omniprésente et évidente dans le sang périphérique. La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour clarifier le calendrier des étapes et aussi pour montrer comment plusieurs échantillons peuvent être codés à barres et regroupés avant l’analyse par cytométrie de masse. Pour commencer cette procédure, placez les tubes de polystyrène à fond rond étiquetés de cinq conditions différentes pour le traitement du sang total sur un support.

Ensuite, ajoutez un millilitre de 37 degrés Celsius RPMI dans chaque tube. Ensuite, ajoutez un millilitre de sang total dans chaque tube et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger avec RPMI. Par la suite, ajoutez 10 microlitres de ruxolitinib pré-dilué dans le tube étiqueté T six plus cinq R et mélangez soigneusement.

Placez le rack de tubes dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et commencez à chronométrer l’incubation. Pour traiter l’échantillon T zéro, pipetez tout le contenu du tube T zéro dans un tube conique étiqueté contenant 20 millilitres de tampon lyse/fix à 37 degrés Celsius à la concentration de travail. Pour optimiser la récupération cellulaire, rincez le tube avec un tampon lyse/fix et mélangez en inversant le tube conique.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la lyse et la fixation. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, décantez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS glacé pour briser la pastille.

Ensuite, remplissez le tube conique à un volume de 15 millilitres avec du PBS. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de CSM pour briser la pastille.

Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de microcentrifugation étiqueté pour la coloration des anticorps. À l’aide d’un compteur de cellules automatisé, comptez les cellules avec un échantillon de 10 microlitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, aspirez le surnageant, en laissant la pastille dans environ 60 microlitres de résidu. Conservez cette pastille sur de la glace jusqu’à ce que les échantillons provenant d’autres conditions aient terminé le traitement. À T égale 30 minutes, transférez le support de tube dans le capuchon de culture tissulaire.

Ajoutez 10 microlitres de R848 à raison de 0,1 gramme par microlitre dans le tube T six plus R848 et mélangez soigneusement. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de LPS à 0,01 microgramme par microlitre dans le tube T six plus LPS et mélangez soigneusement. Ensuite, ajoutez quatre microlitres d’inhibiteur de transport de protéines dans les tubes étiquetés T six, T six plus cinq R et T six plus LPS et retournez les échantillons dans l’incubateur jusqu’à ce que T soit égal à six heures.

Mélangez soigneusement les échantillons avec une pipette P1000 toutes les deux heures. À T égale deux heures, ajoutez quatre microlitres de cocktail d’inhibiteur de transport de protéines dans le tube T six plus R848. Mélangez tous les échantillons et remettez le support dans l’incubateur jusqu’à ce que T soit égal à six heures.

À T égale quatre heures, mélangez les échantillons avec une pipette P1000 une fois de plus. À T égale six heures, traitez T six, T six plus LPS, T six plus R848 et T six plus cinq tubes d’échantillon de sang R comme décrit pour l’échantillon T zéro. Ensuite, stockez les granulés dans un volume CSM résiduel à moins 80 degrés Celsius pour les traiter plus tard.

Pour coder les cellules lysées et fixes, décongelez lentement les échantillons du stockage à moins 80 degrés Celsius sur de la glace. Diluez le tampon permanent de code-barres 10X avec PBS de un à 10 et faites suffisamment de tampon pour trois millilitres par échantillon. Remplissez une auge non stérile avec du CSM et une autre avec le tampon permanent de code-barres X.

Ensuite, ajoutez un millilitre de CSM glacé aux échantillons fraîchement décongelés, mélangez soigneusement et transférez dans les tubes en polypropylène pré-étiquetés respectifs. Maintenant, prenez un échantillon de 10 microlitres et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Normalisez le nombre de cellules dans chaque tube de grappe en supprimant le volume de cellules en excès.

Ensuite, centrifugez les cellules à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Remettre les cellules en suspension dans un millilitre d’un tampon permanent de codage à barres X à l’aide d’une pipette multicanaux et centrifuger à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le surnageant.

Alignez les tubes du cluster sur un rack dans le même ordre que celui indiqué sur la clé du code-barres afin que l’échantillon corresponde à son code-barres. Ajoutez 800 microlitres d’un tampon permanent de codage à barres X à l’aide d’une pipette multicanaux à tous les échantillons dans les tubes de grappe sans toucher la pastille de cellule pour réduire la perte de cellules. Ensuite, mettez de côté le support avec les tubes de grappe.

Retirez les bandes de tubes du kit de code-barres en palladium 20 plex à moins 20 degrés Celsius et décongelez-les à température ambiante. Ajoutez 100 microlitres d’un tampon permanent de code-barres X, mélangez soigneusement et transférez 120 microlitres du mélange de codes-barres remis en suspension dans les échantillons de cellules correspondants dans les tubes de grappe. Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux afin d’éviter toute contamination croisée entre les échantillons à code-barres individuels.

Incuber les tubes en grappe pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux codes-barres d’étiqueter les cellules. Après 30 minutes, centrifugez les échantillons à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirez le surnageant, puis mettez-les à nouveau en suspension dans un millilitre de CSM.

Ensuite, centrifugez et suspendez à nouveau dans le CSM. Ensuite, centrifugez à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et aspirez le surnageant. À l’aide d’une seule pipette et à l’aide de la même pointe, transférez toutes les pastilles de cellules d’environ 70 à 80 microlitres de volume résiduel dans un tube en polystyrène.

N’éjectez pas la pointe de la pipette. Mettez de côté la pipette unique avec cette pointe. À l’aide d’une pipette multicanaux et de nouvelles pointes, ajoutez 100 microlitres de CSM à chaque tube de grappe d’origine pour maximiser la récupération des cellules.

À l’aide de la pipette unique avec l’embout qui a été mis de côté, transférez toutes les pastilles de cellules de 100 microlitres de volume résiduel dans le même tube de polystyrène. Ajoutez du CSM pour compléter le tube de polystyrène à environ trois millilitres. Comptez et enregistrez le numéro de cellule de l’ensemble de codes-barres regroupés.

Ensuite, centrifugez à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et aspirez le surnageant. Procéder à la coloration des échantillons à code-barres le même jour. Ce schéma illustre le flux de travail pour la stimulation et le traitement des échantillons de sang périphérique, y compris l’attribution des aliquotes d’échantillons de sang, le moment de l’ajout des agents de stimulation, le cocktail d’inhibiteurs de transport de protéines et les temps d’incubation jusqu’à la lyse et la fixation des globules rouges.

Le choix des agents stimulants dépendra de la signalisation et des voies cytokiniques ciblées pour l’évaluation. Après la fixation et la lyse des globules rouges, les échantillons de cellules individuelles lysées et fixées d’un donneur sain ont été marqués avec 26 anticorps contre les marqueurs de surface, perméabilisés et colorés avec 14 anticorps contre les cytokines. La stratégie de déclenchement limitée représentant l’identification des monocytes élevés en CD14 est illustrée ici.

De gauche à droite, chaque graphique 2D représenté est un sous-ensemble de population de la population parente qui est contrôlé à partir du graphique 2D immédiatement à gauche. En utilisant des monocytes élevés de CD14 comme représentants dans huit sous-ensembles de cellules immunitaires, une analyse par cytométrie de masse a été effectuée sur des échantillons de sang périphérique provenant d’un donneur sain au temps zéro non stimulé et après stimulation avec l’agoniste TLR LPS et R848 et l’activateur de cellules T PMA ionomycine. Un exemple de l’induction de cytokines dans les monocytes élevés de CD14 est présenté et des cytokines sélectionnées avec une spécificité à l’agent stimulant utilisé sont représentées.

R848 induit sélectivement la sous-unité IL-12p40 et MCP1 dans les monocytes CD14 élevés, ce qui n’est pas le cas du LPS. En revanche, l’ionomycine PMA n’induit pas de cytokines dans les monocytes CD14 élevés. Une fois maîtrisées, les stimulations sanguines peuvent être effectuées en sept heures environ et l’étape du code-barres peut être effectuée en seulement une heure environ.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important d’être conscient du calendrier des étapes et de planifier en conséquence. Une fois que vous avez mis en place cette procédure, vous pouvez envisager de modifier les conditions de stimulation sanguine dans le panel de cytométrie de masse afin d’évaluer les réponses des cellules immunitaires qui sont spécifiques à vos propres objectifs de recherche. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des réponses cytokiniques à partir d’échantillons de sang total et de regrouper plusieurs échantillons dans un ensemble de codes-barres pour l’analyse de cytométrie de masse.