Name: Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Découvrez l'analyse unicellulaire par cytométrie de flux massique pour étudier les altérations immunologiques dans le sang périphérique. Cette méthode permet d'évaluer la production de cytokines et les phénotypes cellulaires dans les maladies auto-immunes.

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Nous tenons à remercier Aimee Pugh-Bernard pour son apport intellectuel et commentaires utiles. Ce travail est soutenu par le nombre Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award et prix K23-1K23AR070897 du NIH à Elena W.Y. Hsieh. Elle est également soutenue par attribution numéro K12-HD000850 de l’Institut National d’Eunice Kennedy Shriver , de la santé de l’enfant et le développement humain et la Lucile Packard Foundation pour la santé de l’enfant, Stanford CSTC UL1 TR001085 et Child Health Research Institut de Stanford University.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Colorado plusieurs institutionnels Review Board (COMIRB) de l’Université du Colorado. Toutes les procédures décrites ci-dessous doivent être effectuées sous une hotte de vitroplants stérile, sauf indication contraire, avec des pointes de pipette filtrée, et tous les réactifs filtrée.
1. préparation des réactifs pour le traitement du sang périphérique
<ol><li>Préparer ruxolitinib stocks aliquotes (10 – 15 μL/flacon à usage unique) à 10 mM en diluant le réactif lyophilisé dans le DMSO selon les instructions du fabricant (conserver à-80 ° C). Maintenir les concentrations de DMSO dans tous les essais, y compris les contrôles non stimulées inférieur à 0,2 % (vol/vol).</li>
	<li>Préparer R848 aliquotes de stock (resiquimod) (10 – 15 μL/flacon à usage unique) à 1 μg/μL en diluant le réactif lyophilisé dans de l’eau stérile comme le selon les instructions du fabricant. Conserver à-80 ° C.</li>
	<li>Préparer les lipopolysaccharides (LPS) stock parties aliquotes (5 μL par flacon pour un usage de temps seulement) à 1 μg/μL en diluant le réactif lyophilisé dans de l’eau stérile selon les instructions du fabricant. Conserver à-80 ° C.</li>
	<li>Préparer les médias de coloration cellulaire (CSM) à l’aide de PBS, 0,5 % de BSA et 0,02 % NaN3.</li>
	<li>Acquérir et préparez le cocktail protéines d’inhibiteur (PTI) transport (Table des matières).</li>
	<li>Décongeler et diluer le ruxolitinib stock flacon (10 mM) 01:10 dans du PBS stérile (1 mM). Mettre de côté à température ambiante dans une hotte de culture de tissus.</li>
	<li>Décongeler et diluer le flacon de stock R848 (1 μg/µL) 01:10 dans du PBS stérile (0,1 μg/µL). Mettre de côté à température ambiante dans une hotte de culture de tissus.</li>
	<li>Décongeler et diluer le LPS stock vial (1 μg/µL) 1/100 dans du PBS stérile (0,01 µg/µL). Mettre de côté à température ambiante dans une hotte de culture de tissus.</li>
	<li>Réchauffez RPMI stérile (pas de L-glutamine) dans un bain d’eau standard 37 ° C (pendant au moins 10 min).</li>
	<li>Diluer le tampon de lyse/fix de 1:5 dans ddH filtrée2O (concentration de travail) sur la table (n’a pas besoin d’être stérile). Note : 1 mL de sang total nécessite 20 mL de concentration de travail du tampon de lyse/fix.<ol>
<li>Faire le tampon de lyse/fix pour 5 conditions de 1 mL de sang total chaque (au moins 100 mL). Aliquote 20 mL de la concentration de travail du tampon de lyse/fix en tubes conique de 50 mL par millilitre de sang total (garder la solution de lyse/fix à 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire). Étiqueter les conditions sur les tubes coniques contenant un tampon de lyse/fix comme suit : T0 (temps zéro), T6 + 5R (durée 6 h avec 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (durée 6 h avec 1 μg/mL R848), T6 + LPS (durée 6 h avec 0,1 μg/mL LPS), T6 (durée 6 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Étiquette autour des tubes du polystyrène stériles avec des bouchons et des tubes de microcentrifuge de 1 mL avec la même nomenclature comme au point 1.10.</li>
</ol>2. la stimulation et la transformation du sang périphérique (Figure 1)
<ol><li>Placez l’étiquette ronde polystyrène tubes du bas de l’étape 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) sur une grille. Remarque : Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans ce type de tube, sauf indication contraire. Cap des tubes lors du transfert entre le capot de culture de tissus et incubateur pour maintenir la stérilité.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de 37 ° C RPMI (pas de L-glutamine) dans chacun des tubes (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Inverser le tube de prélèvement de sang plusieurs fois, ajouter 1 mL de sang total dans chaque tube et Pipeter monter et descendre plusieurs fois pour bien les mélanger avec le RPMI (dilution avec RPMI empêche l’agglutination du sang au cours de la période d’incubation de 6 h).</li>
	<li>Ajouter 10 μL de la 01:10 ruxolitinib T6 + 5R. Bien mélanger avec une pipette P1000. Placez le portoir dans l’incubateur à 37 ° C et commencez à chronométrer l’incubation (T = 0).</li>
	<li>Traiter l’échantillon T0 comme suit.<ol>
<li>Dans un tube conique étiqueté contenant 20 mL de tampon de lyse/fix concentration 37 ° C travail, déposer la totalité du contenu du tube T0. Pour optimiser la récupération de la cellule, rincer le tube avec du tampon de lyse/fix travail concentration. Mélanger en retournant le tube à fond conique.</li>
		<li>Incuber à 37 ° C pendant 15 min permettre la lyse et de fixation. Après fixation, effectuez toutes les étapes subséquentes à la paillasse. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Décanter le liquide surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS froid glace pour briser le culot, puis remplir la forme conique à un volume de 15 mL de PBS.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à température ambiante. Décanter le liquide surnageant. Répéter le lavage PBS (mesures 2.4.3–2.4.4) si les boulettes sont rouges. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de CSM pour casser vers le haut de la pastille, puis transférer dans le tube de microcentrifuge étiquetées (étape 1.11) pour la coloration des anticorps. Prélever un échantillon de 10 µL à compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées ou un hémocytomètre. Remarque : Étant donné que toutes les cellules sont fixés à ce stade, il n’est pas nécessaire d’inclure une tache de viabilité.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant, laissant le culot dans ~ 60 µL du volume résiduel. Gardez ce pellet sur la glace jusqu'à ce que les échantillons d’autres affections ont terminé le traitement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À T = 30 min, passer le portoir (étape 2.3) à la hotte de la culture de tissus et suivez la procédure suivante.<ol>
<li>Ajouter 10 μL de la 0.1 μg/μL R848 T6 + R848. Bien mélanger avec une pipette P1000.</li>
		<li>Ajouter 10 μL de la 0,01 μg/μL LPS T6 + LPS. Bien mélanger avec une pipette P1000.</li>
		<li>Ajouter 4 μL d’inhibiteur du transport de protéines (stock à 500 X) T6, T6 + 5R et T6 LPS (mais pas à T6 + R848) et retourner les échantillons dans l’incubateur jusqu'à T = 6 h. mélanger soigneusement avec une pipette P1000 toutes les 2 h. Remarque : R848 est un agoniste TLR endoplasmique et nécessite donc un délai temporel dans l’ajout de l’inhibiteur de transport des protéines permettant l’accès à son récepteur de cible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À T = 2 h, ajouter 4 μL d’inhibiteur du transport de protéines cocktail (stock à 500 X) au T6 + R848 tube. Mélanger tous les échantillons avec une pipette P1000 et remettez le panier dans l’incubateur jusqu'à T = 6 h.</li>
	<li>Mélanger les échantillons avec un P1000 une fois de plus à T = 4 h.</li>
	<li>À T = 6 h, traiter T6 T6 + LPS, T6 + R848 et T6 + 5R tubes d’échantillons de sang tel que décrit dans l’étape 2.4 pour l’échantillon de T0.</li>
	<li>Stocker les pellets de cellule en volume résiduel de CSM à-80 ° C à traiter à une date ultérieure. Sinon, passez à codes à barres et anticorps coloration sans stocker.</li>
</ol>3. les codes barres des cellules du sang lysé/fixe
<ol><li>Décongeler les échantillons de cellules lysées/fixe du stockage-80 ° C lentement sur la glace ; un maximum de 20 échantillons peut être étiqueté avec code à barres unique et commun à l’aide de ce système. Diluer le tampon de perm X barcoding 10 en 01:10 par PBS ; faire suffisamment tampon pour ~ 3 mL par exemple.</li>
	<li>Remplir un creux non stérile avec le MCS et l’autre avec le tampon de perm X barcoding 1. Ajouter 1 mL de glace froide CSM à échantillons fraîchement décongelés, bien mélanger avec une pipette et transférer aux tubes respectifs préalablement étiqueté cluster en polypropylène.</li>
	<li>Prélever un échantillon de 10 μL de compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées ou un hémocytomètre. Normaliser le nombre de cellules à 1,5 – 2 x 106 cellules par exemple dans chaque tube de cluster : Enlevez et jetez le volume des cellules excès au-dessus de 2 x 106 cellules.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de perm X barcoding 1 avec une pipette multicanaux et centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer hors le surnageant.</li>
	<li>Aligner les tubes de cluster sur une grille dans l’ordre comme indiqué sur la clé du code à barres pour l’échantillon correspond avec son code à barres. Ajouter 800 μL 1 X tampon de perm barcoding de pipette multicanaux à tous les échantillons dans les tubes de cluster sans toucher le culot avec les pointes de pipette (pas de mélange) afin de réduire la perte de cellules. Mettre de côté le panier avec les tubes de cluster.</li>
	<li>Retirez 20-plex Pd Barcoding Kit tube bandes de-20 ° C et décongélation à température ambiante. Ajouter 100 μL de tampon de perm X barcoding 1, bien mélanger et transférer 120 μl du mélange barcode resuspendues dans les échantillons de cellules correspondantes dans les tubes de cluster.</li>
	<li>Mélanger soigneusement la pipette multicanaux afin qu’il n’y a aucune contamination croisée entre individuellement les échantillons avec code à barres. Incuber les tubes de cluster pendant 30 min à température ambiante pour permettre les codes-barres marquer les cellules.</li>
	<li>Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de CSM.</li>
	<li>Centrifuger et resuspendre dans CSM à nouveau comme au point 3.8. Remarque : Chaque échantillon est maintenant étiqueté avec un code à barres unique et échantillons sont prêtes à être mises en commun.</li>
	<li>Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Avec une pipette simple et en utilisant le même embout, transférer tous les granulés de cellule en ~ 70 – 80 volume résiduel μL d’un tube en polystyrène. Ne pas éjecter l’embout de la pipette ; mettre de côté la seule pipette avec cette astuce.</li>
	<li>Avec une pipette multicanaux et de nouvelles astuces, ajouter ~ 100 μL CSM dans chaque tube de cluster initial à maximiser la récupération de la cellule. Avec la pipette simple avec la pointe qui a été annulée, transférer tous les granulés de cellule en volume résiduel de ~ 100 μL dans le même tube polystyrène.</li>
	<li>Ajouter CSM au haut du tube de polystyrène (~ 3 mL). Comptage et enregistrement du nombre de cellules du code à barres regroupée définie. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Procéder à la coloration des échantillons avec code à barres sur le même jour. Remarque : Il est normal de s’attendre à environ 20 à 30 % la perte de cellules dans le processus de codage à barres.</li>
</ol>4. coloration des Barcoded lysées/fixe globules et préparation pour l’analyse sur l’Instrument de cytométrie de flux massique
Remarque : Chaque 1 X titre d’anticorps de coloration (1 μL d’anticorps par tranche de 100 μL réaction de coloration), peuvent tacher habituellement 3 à 4 x 106 cellules. Par conséquent, lorsque tous les échantillons avec code à barres sont regroupés dans un seul tube, la quantité d’anticorps doit être entartrée. Si le montant d’échantillons barcoded 20 à 30 x 106 cellules et chaque titre X 1 peut tacher les 3 – 4 x 106 cellules, l’échantillon avec code à barres nécessite seulement un 10 X titre, par opposition à la coloration de chaque échantillon individuellement, qui nécessiterait une quantité X 20 d’anticorps (1 X par chaque tube). La concentration de l’anticorps du nombre de cellules devrait être soigneusement réglée pour chaque cocktail d’anticorps individuel (ne pas discuté ici).
<ol><li>Colorer les cellules à l’aide d’anticorps (Table des matières) pour l’induction surface de coloration et de cytokines.<ol>
<li>Faire la coloration de surface cocktail en calculant le montant destiné à être ajoutée et comptable pour erreur de pipetage (c'est-à-dire, si la coloration avec code à barres de 20 échantillons de 2 x 106 cellules dans chaque échantillon, un 10 X tache de titre est exigé ; pour les calculs de volume final, compenser pour pipetage erreur en faisant un 10,5 X final solution de coloration).</li>
		<li>Ajouter 10 X d’une valeur de volume pour le culot avec code à barres de la coloration de surface. Pour réduire la perte de cellules, avec la même pointe, homogénéiser et mesurer le volume des taches en surface et le culot cellulaire.</li>
		<li>Basé sur le volume des cellules et cocktail de coloration, ajouter le CSM pour un volume final de coloration de 50 μL / nombre d’échantillons cellulaires (c'est-à-dire, si l’exécution d’un ensemble de 20 échantillons, 50 μL X 20 = 1 mL). Incuber 30 min à 4 ° C. Agiter l’échantillon toutes les 15 min pour promouvoir la même coloration.</li>
		<li>Pendant l’incubation des taches superficielles, préparer le tampon de Perm/lavage (Table des matières) en dilution 01:10 avec les ddH filtrée2Prepare O. volumes de 2 mL pour perméabilisation et 5 mL pour le lavage. Conserver à 4 ° C ou sur la glace.</li>
		<li>Couronner le tout la surface coloration tube avec le CSM, et centrifuger à 600 x g à 4 ° C pendant 5 min. aspirer le surnageant. Remettre en suspension l’échantillon avec code à barres dans 2 mL de 4 ° C, 01:10 tampon de dilution Perm/cycle de lavage. Incuber à 4 ° C pendant 20 à 30 min pour permeabilize pleinement les cellules.</li>
		<li>Centrifuger à 600 g à 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant.</li>
		<li>Pour la coloration intracellulaire, suivez les étapes coloration semblables (quant à la coloration de surface). Cependant, utiliser les 4 ° C, 01:10 tampon de dilution Perm/cycle de lavage au lieu de la CSM de faire le total volume de coloration afin que les cellules demeurent dans un environnement perméabilisant tout au long de la coloration intracellulaire.</li>
		<li>Ajoutez l’anticorps intracellulaire cocktail à la surface tachée et perméabilisées culot cellulaire (pas 4.1.2–4.1.17). Porter le total volume à 50 μL / nombre d’échantillons cellulaires de coloration. Incuber pendant 60 min à 4 ° C. Agiter l’échantillon toutes les 15 min pour assurer la même coloration.</li>
		<li>Au cours de la coloration intracellulaire, préparer la solution intercalator : 900 μl de PBS filtré + 100 μL de filtrée 16 % PFA (concentration finale de 1,6 % PFA) + 0,2 μL de 500 uM de colorant intercalator (Table des matières).</li>
		<li>Terminez le culot cellulaire + anticorps intracellulaire cocktail avec froid 01:10 tampons Perm/cycle de lavage.</li>
		<li>Centrifuger à 600 g à 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant. En haut du tube de coloration avec le CSM. Compter et noter le nombre de cellules. Centrifuger à 600 g à 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de solution d’intercalator de l’étape 4,9. Incuber pendant au moins 20 min à température ambiante pendant l’intercalation complet, ou toute la nuit à 4 ° C (échantillons en solution intercalator peuvent rester à 4 ° C pendant 1 semaine avant de les exécuter sur l’instrument de la cytométrie en flux massique).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les cellules à l’instrument de la cytométrie en masse.<ol>
<li>Terminez le tube avec 3 mL de ddH filtrée2O et centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans 3 mL de ddH filtrée2O. passer cette suspension à travers un filtre de 100 μm pour enlever tout débris ou agrégats qui pourraient potentiellement bloquer l’instrument cytométrie en masse.</li>
		<li>Compter et enregistrer la filtration après numéro de cellulaire. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la solution étalon de la perle (Table des matières) en diluant il 01:10 dans ddH filtrée2O.</li>
	<li>Resuspendre le teinté cellules dans le volume requis de 01:10 solution de perle d’étalonnage pour atteindre une concentration cellulaire de ~ 1 x 106 cellules/mL dilué. Remarque : Pour un CyTOF1 à 45 µL/min, l’optimum recommandée est de 5 x 105 cellules/mL ; pour Helios à 30 µL/min, 7,5 x 105 cellules/mL.</li>
	<li>Aller de l’avant pour exécuter l’exemple sur la cytométrie de flux massique instrument9.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un roman, unicellulaires, approche protéomique à évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Cette méthode emploie le sang périphérique comme véhicule analytique et masse cytométrie de flux comme outil pour évaluer les anomalies immunitaires cellulaires phénotypiques et fonctionnelles. La méthode est facilement applicable à l’homme...

Les maladies auto-immunes sont une cause majeure de morbidité et de mortalité touchant 3-8 % de la population. Aux États-Unis, les maladies auto-immunes sont parmi les principales causes de décès chez les femmes jeunes et d’âge moyen (âges < 65 ans)1,2. Maladies auto-immunes sont caractérisées par une présentation clinique hétérogène et divers processus immunologiques sous-jacents. Le spectre de l’hétérogénéité est bien représenté à travers différents troubles, comme articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) et les maladies neurologiques dans la sclérose en plaques (MS). Toutefois, ce niveau d’hétérogénéité est également illustré dans un trouble unique, comme le lupus érythémateux systémique (les) : certains patients peuvent présenter des pathologie rénale, alors que d’autres souffrent de participation hématologique ou mixte3.
L’immunopathogenèse sous-jacente dans les maladies auto-immunes reflète l’hétérogénéité clinique, impliquant et hyper-activation automatique de plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative et la production de cytokines dysrégulation concomitante. Alors que les cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la maladie auto-immune, comprendre leur rôle spécifique dans le mécanisme de la maladie s’est avéré difficile. Cytokines sont caractérisés par la pléiotropie (une cytokine peut avoir des effets multiples sur différents types de cellules), redondance (cytokines multiples peuvent avoir le même effet), la dualité (une cytokine peut avoir des effets pro - ou anti-inflammatoires, dans des conditions différentes), et la plasticité (cytokines peut être moulé dans un rôle différent de son « original », selon l’environnement)4,5,6. Par conséquent, méthodes l’échelle de la population ne peut pas distinguer les réponses cellulaires hétérogènes à la même « milieu de cytokine ». De même, les plans d’études qui mettent l’accent sur un aspect spécifique du système immunitaire (cellules du même type ou cytokine), n’offrent pas une évaluation globale de tous les éléments impliqués dans des maladies auto-immunes complexes. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés.
Récemment, nous avons développé une approche protéomique monocellulaires pour évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires et détecter leurs diverses perturbations de cytokine dans le milieu du patient spécifiques « pathogènes » plasma sanguin périphérique facteurs circulants. Le workflow décrit ici est caractérisé par l’utilisation d’échantillons de sang périphérique intacte, par opposition aux cellules mononucléaires isolées du sang périphérique (PBMC). Sang périphérique représente le véhicule plus physiologiquement pertinent pour étudier la maladie auto-immune systémique, incluant 1) non-sang des mononucléaires souvent impliqués dans les maladies auto-immunes (p. ex., neutrophiles, plaquettes) et le plasma 2) circulant de facteurs, tels que les acides nucléiques, complexes immuns et cytokines, qui ont un rôle activateur immunitaire. Pour capturer le « intrinsèque pathogènes » dysrégulation la production de cytokines, les échantillons sont traités immédiatement après le tirage de sang (T0, temps zéro) et après 6 h d’incubation à 37 ° C (température du corps physiologique) avec un transport des protéines du sang périphérique inhibiteur en l’absence de toute condition de stimulation exogène (T6, durée 6 h), pour détecter la production de cytokines (accumulation, T6-T0) qui reflète l’état de la maladie « intrinsèque » (Figure 1). Pour étudier les processus de dysrégulation qui reflètent plus ou moins activation des voies de signalisation impliquées dans les réponses immunitaires pertinents à la maladie, des échantillons de sang périphérique sont traités (6 h d’incubation à 37 ° C avec un inhibiteur de transport de protéine) avec une exogène stimuler la condition qui reflète la pathogenèse de la maladie, tels que les agonistes des récepteurs Toll-Like (TLR) dans le cas de SLE (T6 + R848, temps de 6 h avec 1 µg/mL R848), pour détecter la production de cytokines qui refléterait une réponse aux acides nucléiques (comparant T0 vs T6 vs T6 + R848, Figure 1). Afin d’étudier les effets immunomodulateurs de thérapeutique disponible ex vivo, en ce qui concerne les processus précis dysrégulation immunitaire des patients spécifiques, des échantillons de sang périphérique sont traitées par un inhibiteur JAK à la thérapeutique concentration (ici, 5 uM ruxolitinib ; T6 + 5R, temps de 6 h avec 5 uM ruxolitinib), pour détecter des changements dans l’état de la maladie « intrinsèque » en réponse à la drogue (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figure 1). Un inhibiteur JAK a été choisi pour cette étude parce que les inhibiteurs de JAK auraient dû être divulgués pour réussir dans le traitement de maladies auto-immunes telles que RA
Evaluer simultanément les dysrégulation des processus décrits ci-dessus en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, des échantillons de sang périphérique de SLE patients et témoins sains ont été traitées comme décrit ci-dessus et analysés par cytométrie de flux massique. Cytométrie en masse, également connu sous le nom Cytometry-Time-Of-Flight, offre une analyse unicellulaires de plus de 40 paramètres sans problèmes de spectral chevauchent7,8,9. Cette technique utilise des isotopes métalliques de terres rares sous forme d’ions métalliques solubles sous forme de balises liés aux anticorps, au lieu de fluorophores10. Des détails supplémentaires au sujet de la plateforme technologique de cytométrie de flux massique (c.-à-d., tuning et étalonnage, l’acquisition de l’échantillon) se trouvent dans Leipold et coll. et McCarthy et al. 11 , 12 la haute-dimensionnalité de cytométrie de flux massique permet mesure simultanée de plusieurs cytokines dans l’ensemble des sous-ensembles de cellules immunitaires innée et adaptative avec granularité unicellulaires (Table des matières).
Les paramètres cliniques et de laboratoire classiques actuels ne sont souvent pas sensibles ou suffisamment précis pour détecter l’activité en cours de la maladie ou la réponse aux immunomodulateurs spécifiques13, reflétant la nécessité de mieux délimiter le système immunitaire sous-jacent changements qui animent les poussées. Compte tenu de l’omniprésence de dérèglement de cytokine dans une maladie auto-immune, une multitude de méthodes de traitement qui utilisent des anticorps ou des petits inhibiteurs moléculaires ciblant les cytokines ou la signalisation des protéines impliquées dans la régulation de la production de cytokines ont récemment vu le jour. Dans son format de base, l’approche analytique de sang périphérique décrite ici fournit une plate-forme pour identifier les sous-ensembles de cellules spécifiques au patient dysrégulation et leur production de cytokines anormale dans une maladie auto-immune avec des manifestations systémiques. Cette méthodologie permet la personnalisation des choix thérapeutiques comme dysrégulation spécifique cytokines peuvent être identifiés, et un traitement spécifique peut être testé ex vivo pour évaluer leur capacité à immunomodulate la patiente maladie spécifique processus.

<table><tbody><tr><td>Ruxolitinib</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-364729A</td><td>Stock Conc : 10 mM ; Conc final : 5 &mu ; M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>Stock Conc : 1 &mu ; g/&mu ; L; Conc final : 1 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>Stock Conc : 1 &mu ; g/&mu ; L; Concentration finale : 0,1 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Stérile PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Lyse/Fix BD</td><td>biosciences</td><td>558049</td><td>Stock Conc : 5X ; Conc final : 1X (dilué dans ddH2O)</td></tr><tr><td>BD Phosflow perm/wash buffer I</td><td>BD biosciences</td><td>557885</td><td>Stock Conc : 10X ; Teneur finale : 1:10 (dilué dans ddH2O)</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>Teneur en stock : >99,9 %; Processeur final : 0,0002</td></tr><tr><td>Inhibiteur de transport de protéines (PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>Processeur : 500X ; Conc final : 1X</td></tr><tr><td>Intercalateur d’ADN</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>Stock Conc : 500 &mu ; M; Concentration finale : 0,1 &mu ; </td></tr><tr><td>Média de coloration des cellules M (CSM)</td><td></td><td></td><td>PBS + 0,5 % BSA, 0,02 % NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td><td>Fluidigm</td><td>201057</td><td>Stock Conc : 10X ; Conc final : 1X</td></tr><tr><td>20-plex Barcode Set</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>Stock Conc : n/a ; Conc final : n/a</td></tr><tr><td>EQ TM Perles d’étalonnage à quatre éléments</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Stock Conc : 10X ; Cône final : 1X</td></tr><tr><td>16 % sans MeOH Solution de formaldéhyde</td><td>Thermo</td><td>28908</td><td>Processeur : 16 % (p/v) ; Cône final : 1,6 % (p/v)</td></tr><tr><td>Tubes stériles en polystyrène à fond rond</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>Processeur : n/a ; Commande finale : n/a</td></tr><tr><td>Tubes en grappe de polypropylène</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>Référence stock : n/a ; Conc final : n/a</td></tr><tr><td>Helios CyTOF instrument</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>Toutes les solutions à utiliser dans l’analyse CyTOF doivent être exemptes de contamination métallique. ddH2O est utilisé dans la préparation de toutes les solutions doivent avoir une résistivité d’au moins 18,0 M&Omega ;. cm. ddH2O et toutes les solutions auto-préparées doivent être stockées dans des bouteilles neuves en plastique ou en verre qui n’ont jamais été autoclavées.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticorps utilisés pour la cytométrie de masse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marqueurs de surface</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>Masse : 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>Masse : 144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>Masse : 174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>Masse : 149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>Masse : 142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>Masse : 209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>Masse : 152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>Masse : 115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>Masse : 154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>Masse : 165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>Masse : 163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>Masse : 141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>Masse : 155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>Masse : 172</td></tr><tr><td>CD45 total</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>Masse : 89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>Masse : 153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>Masse : 168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>Masse : 113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>Masse : 150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>Masse : 143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>Masse : 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>Masse : 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>Masse : 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>Masse : 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>Masse : 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>Masse : 167</td></tr><tr><td>Cytokines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&alpha ;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>Masse : 147</td></tr><tr><td>IL-1&beta ;</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td>H1b-98</td><td>Masse : 169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>Santa Cruz</td><td>AS17</td><td>Masse : 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>Masse : 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>Masse : 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td>C8.6</td><td>Masse : 171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td>BL168</td><td>Masse : 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>Masse : 176</td></tr><tr><td>MIP1&beta ;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>Masse : 158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>Masse : 170</td></tr><tr><td>IFN&alpha ;</td><td>Miltenyi&nbsp ;</td><td>LT27:295</td><td>Masse : 175</td></tr><tr><td>IFN&gamma ;</td><td>Biolégende</td><td>4S. B3</td><td>Masse : 165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>Masse : 159</td></tr><tr><td>TNF&alpha ;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>Masse : 166</td></tr><tr><td>Note : Si le fabricant est indiqué comme Fluidigm, cet anticorps a été acheté auprès de Fluidigm avec du métal préconjugué. Si le fabricant est indiqué comme autre que Fluidigm, cet anticorps a été auto-conjugué à l’aide de l’étiquetage multi-métaux MaxPar. Kit (Fluidigm Cat : 201300) selon le protocole du fabricant.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse unicellulaires lymphoblastiques et production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse des maladies auto-immunes. Par conséquent, la mesure des niveaux de cytokine a fait l’objet de plusieurs études pour tenter de comprendre les mécanismes précis qui conduisent à la rupture de l’autotolérance et l’auto-immunité ultérieure. Les approches jusqu’ici ont été fondées sur l’étude d’un aspect spécifique du système immunitaire (un seul ou quelques types de cellules ou de cytokines) et n’offrent pas une évaluation globale d’une maladie auto-immune complexe. Alors que des études axées sur les sérums patients ont donné des renseignements importants sur l’auto-immunité, ils ne fournissent pas la source cellulaire spécifique des cytokines dysrégulation détectés. Une approche globale de la cellule unique pour évaluer la production de cytokines en plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires, dans le cadre de « intrinsèque » spécifique au patient plasmatique circulant des facteurs, est décrite ici. Cette approche permet la surveillance du phénotype immunitaire spécifique au patient (marqueurs de surface) et fonction (cytokines), soit dans son indigène » intrinsèque pathogènes » maladie, État, ou en présence d’agents thérapeutiques (in vivo ou ex vivo).

Figure 1 illustre le flux de travail pour la stimulation et traitement des échantillons de sang périphérique, y compris la répartition des aliquotes d’échantillons sanguins, date de l’ajout d’agents de stimulation, protéine de transport cocktail inhibiteur et incubation fois jusqu'à la lyse des globules rouges (GR) et de la fixation. Le choix des agents stimulants dépendra des voies de signalisation et de cytokines qui sont ciblés pour évaluation. Par exemple...

Nous décrivons ici une approche protéomique unicellulaires Evaluer immunitaire phénotypique et fonctionnelle (induction de cytokines intracellulaires) des altérations dans les échantillons de sang périphérique, analysés par cytométrie en masse.

Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de l’auto-immunité, telles que l’identification des anomalies de fréquence cellulaire et des différences de fonction, telles que la production de cytokines clés dans le cadre d’une maladie auto-immune. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle peut capturer un large répertoire de différents types de cellules et de différences de fonction à partir d’un échantillon de sang périphérique facilement obtenu. En général, les personnes qui débutent dans ce processus peuvent avoir du mal à déterminer le bon timing des étapes de traitement du sang, la conception du panel d’anticorps, le processus de codage à barres lui-même et l’analyse de données de cellules uniques de grande dimension.Cette approche d’immunologie systémique est particulièrement adaptée aux maladies auto-immunes comme le LED, où la dérégulation immunitaire est omniprésente et évidente dans le sang périphérique. La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour clarifier le calendrier des étapes et aussi pour montrer comment plusieurs échantillons peuvent être codés à barres et regroupés avant l’analyse par cytométrie de masse. Pour commencer cette procédure, placez les tubes de polystyrène à fond rond étiquetés de cinq conditions différentes pour le traitement du sang total sur un support.Ensuite, ajoutez un millilitre de 37 degrés Celsius RPMI dans chaque tube. Ensuite, ajoutez un millilitre de sang total dans chaque tube et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger avec RPMI. Par la suite, ajoutez 10 microlitres de ruxolitinib pré-dilué dans le tube étiqueté T six plus cinq R et mélangez soigneusement.Placez le rack de tubes dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et commencez à chronométrer l’incubation. Pour traiter l’échantillon T zéro, pipetez tout le contenu du tube T zéro dans un tube conique étiqueté contenant 20 millilitres de tampon lyse/fix à 37 degrés Celsius à la concentration de travail. Pour optimiser la récupération cellulaire, rincez le tube avec un tampon lyse/fix et mélangez en inversant le tube conique.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la lyse et la fixation. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, décantez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS glacé pour briser la pastille.Ensuite, remplissez le tube conique à un volume de 15 millilitres avec du PBS. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de CSM pour briser la pastille.Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de microcentrifugation étiqueté pour la coloration des anticorps. À l’aide d’un compteur de cellules automatisé, comptez les cellules avec un échantillon de 10 microlitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, aspirez le surnageant, en laissant la pastille dans environ 60 microlitres de résidu. Conservez cette pastille sur de la glace jusqu’à ce que les échantillons provenant d’autres conditions aient terminé le traitement. À T égale 30 minutes, transférez le support de tube dans le capuchon de culture tissulaire.Ajoutez 10 microlitres de R848 à raison de 0,1 gramme par microlitre dans le tube T six plus R848 et mélangez soigneusement. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de LPS à 0,01 microgramme par microlitre dans le tube T six plus LPS et mélangez soigneusement. Ensuite, ajoutez quatre microlitres d’inhibiteur de transport de protéines dans les tubes étiquetés T six, T six plus cinq R et T six plus LPS et retournez les échantillons dans l’incubateur jusqu’à ce que T soit égal à six heures.Mélangez soigneusement les échantillons avec une pipette P1000 toutes les deux heures. À T égale deux heures, ajoutez quatre microlitres de cocktail d’inhibiteur de transport de protéines dans le tube T six plus R848. Mélangez tous les échantillons et remettez le support dans l’incubateur jusqu’à ce que T soit égal à six heures.À T égale quatre heures, mélangez les échantillons avec une pipette P1000 une fois de plus. À T égale six heures, traitez T six, T six plus LPS, T six plus R848 et T six plus cinq tubes d’échantillon de sang R comme décrit pour l’échantillon T zéro. Ensuite, stockez les granulés dans un volume CSM résiduel à moins 80 degrés Celsius pour les traiter plus tard.Pour coder les cellules lysées et fixes, décongelez lentement les échantillons du stockage à moins 80 degrés Celsius sur de la glace. Diluez le tampon permanent de code-barres 10X avec PBS de un à 10 et faites suffisamment de tampon pour trois millilitres par échantillon. Remplissez une auge non stérile avec du CSM et une autre avec le tampon permanent de code-barres X.Ensuite, ajoutez un millilitre de CSM glacé aux échantillons fraîchement décongelés, mélangez soigneusement et transférez dans les tubes en polypropylène pré-étiquetés respectifs. Maintenant, prenez un échantillon de 10 microlitres et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Normalisez le nombre de cellules dans chaque tube de grappe en supprimant le volume de cellules en excès.Ensuite, centrifugez les cellules à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Remettre les cellules en suspension dans un millilitre d’un tampon permanent de codage à barres X à l’aide d’une pipette multicanaux et centrifuger à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le surnageant.Alignez les tubes du cluster sur un rack dans le même ordre que celui indiqué sur la clé du code-barres afin que l’échantillon corresponde à son code-barres. Ajoutez 800 microlitres d’un tampon permanent de codage à barres X à l’aide d’une pipette multicanaux à tous les échantillons dans les tubes de grappe sans toucher la pastille de cellule pour réduire la perte de cellules. Ensuite, mettez de côté le support avec les tubes de grappe.Retirez les bandes de tubes du kit de code-barres en palladium 20 plex à moins 20 degrés Celsius et décongelez-les à température ambiante. Ajoutez 100 microlitres d’un tampon permanent de code-barres X, mélangez soigneusement et transférez 120 microlitres du mélange de codes-barres remis en suspension dans les échantillons de cellules correspondants dans les tubes de grappe. Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux afin d’éviter toute contamination croisée entre les échantillons à code-barres individuels.Incuber les tubes en grappe pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux codes-barres d’étiqueter les cellules. Après 30 minutes, centrifugez les échantillons à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirez le surnageant, puis mettez-les à nouveau en suspension dans un millilitre de CSM.Ensuite, centrifugez et suspendez à nouveau dans le CSM. Ensuite, centrifugez à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et aspirez le surnageant. À l’aide d’une seule pipette et à l’aide de la même pointe, transférez toutes les pastilles de cellules d’environ 70 à 80 microlitres de volume résiduel dans un tube en polystyrène.N’éjectez pas la pointe de la pipette. Mettez de côté la pipette unique avec cette pointe. À l’aide d’une pipette multicanaux et de nouvelles pointes, ajoutez 100 microlitres de CSM à chaque tube de grappe d’origine pour maximiser la récupération des cellules.À l’aide de la pipette unique avec l’embout qui a été mis de côté, transférez toutes les pastilles de cellules de 100 microlitres de volume résiduel dans le même tube de polystyrène. Ajoutez du CSM pour compléter le tube de polystyrène à environ trois millilitres. Comptez et enregistrez le numéro de cellule de l’ensemble de codes-barres regroupés.Ensuite, centrifugez à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et aspirez le surnageant. Procéder à la coloration des échantillons à code-barres le même jour. Ce schéma illustre le flux de travail pour la stimulation et le traitement des échantillons de sang périphérique, y compris l’attribution des aliquotes d’échantillons de sang, le moment de l’ajout des agents de stimulation, le cocktail d’inhibiteurs de transport de protéines et les temps d’incubation jusqu’à la lyse et la fixation des globules rouges.Le choix des agents stimulants dépendra de la signalisation et des voies cytokiniques ciblées pour l’évaluation. Après la fixation et la lyse des globules rouges, les échantillons de cellules individuelles lysées et fixées d’un donneur sain ont été marqués avec 26 anticorps contre les marqueurs de surface, perméabilisés et colorés avec 14 anticorps contre les cytokines. La stratégie de déclenchement limitée représentant l’identification des monocytes élevés en CD14 est illustrée ici.De gauche à droite, chaque graphique 2D représenté est un sous-ensemble de population de la population parente qui est contrôlé à partir du graphique 2D immédiatement à gauche. En utilisant des monocytes élevés de CD14 comme représentants dans huit sous-ensembles de cellules immunitaires, une analyse par cytométrie de masse a été effectuée sur des échantillons de sang périphérique provenant d’un donneur sain au temps zéro non stimulé et après stimulation avec l’agoniste TLR LPS et R848 et l’activateur de cellules T PMA ionomycine. Un exemple de l’induction de cytokines dans les monocytes élevés de CD14 est présenté et des cytokines sélectionnées avec une spécificité à l’agent stimulant utilisé sont représentées.R848 induit sélectivement la sous-unité IL-12p40 et MCP1 dans les monocytes CD14 élevés, ce qui n’est pas le cas du LPS. En revanche, l’ionomycine PMA n’induit pas de cytokines dans les monocytes CD14 élevés. Une fois maîtrisées, les stimulations sanguines peuvent être effectuées en sept heures environ et l’étape du code-barres peut être effectuée en seulement une heure environ.Lorsque vous tentez cette procédure, il est important d’être conscient du calendrier des étapes et de planifier en conséquence. Une fois que vous avez mis en place cette procédure, vous pouvez envisager de modifier les conditions de stimulation sanguine dans le panel de cytométrie de masse afin d’évaluer les réponses des cellules immunitaires qui sont spécifiques à vos propres objectifs de recherche. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des réponses cytokiniques à partir d’échantillons de sang total et de regrouper plusieurs échantillons dans un ensemble de codes-barres pour l’analyse de cytométrie de masse.

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