Procédé basé sur l’immunofluorescence pour visualiser des cellules de touffe dans des cryosections de jéjunum

Commencez par une boîte de culture contenant des cryosections de jéjunum de souris fixées au formol et remplies de gélatine avec des cellules de touffe avec des microvillosités apicales et des somas en forme de bobine.

Laver avec un tampon contenant un détergent pour perméabiliser les membranes cellulaires.

Ajouter une solution alcaline de récupération d’antigène. Incuber pour briser les réticulations protéiques induites par la fixation, révélant les protéines pour la coloration.

Appliquez une solution bloquante pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Superposition avec des anticorps primaires ciblant une protéine de liaison à l’actine, spécifiquement phosphorylée dans les cellules de la touffe.

Retirez les anticorps non liés. Introduire un mélange d’anticorps secondaires conjugués au fluorophore, de colorant de liaison à l’ADN et de colorant fluorescent à la phalloïdine.

Les anticorps secondaires se lient aux anticorps primaires, le conjugué phalloïdine-colorant fluorescent marque l’actine et le colorant de liaison à l’ADN marque les noyaux cellulaires.

Retirez les composants non liés et ajoutez un tampon sans détergent.

Transférez la section sur une diapositive en verre enduite d’adhésif, en la montant avec un support.

Au microscope confocal, des cellules vertes en forme de bobine avec une fluorescence intensifiée à l’extrémité luminale et une masse radiculaire rouge étendue indiquent la présence de cellules de touffe.

Pour préparer des sections de jéjunum, commencez par régler la température de la chambre du cryostat et la température de l’objet à moins 22 degrés Celsius. Placez le bloc de tissu congelé dans un moule cryogénique dans la chambre du cryostat pendant au moins 15 minutes. Au bout de 15 minutes, coupez le bloc en deux avec une lame de rasoir pour exposer la section transversale du jéjunum. Montez la moitié du bloc sur un adaptateur de cryostat. Sectionnez le jéjunum rempli de gélatine en sections de 30 microns d’épaisseur. À l’aide d’une pince congelée, transférez délicatement les sections dans une boîte de culture de 35 millimètres contenant 3 millilitres de PBS.

Après avoir lavé les sections trois fois pendant 5 minutes chacune avec 3 millilitres de PBS-T, ajoutez 3 millilitres de solution de récupération d’antigène fraîchement préparée dans le plat contenant les sections flottantes. Ensuite, fermez le couvercle, scellez l’espace entre le plat et le couvercle avec une bande de ruban adhésif et incubez à 50 degrés Celsius dans un incubateur d’hybridation pendant trois heures sans secouer.

Après l’immunomarquage, transférez la boîte de coupes colorées dans le PBS dans un microscope stéréoscopique. Placez 200 microlitres de PBS dans une gouttelette au centre d’une lame en verre blanc revêtue d’AMS. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette P200, vous pouvez transférer une section de jéjunum de la boîte dans la gouttelette.

Après avoir ajusté l’alignement de la section, aspirez tout le PBS restant autour de la section. Ajoutez 20 microlitres de support de montage aqueux et placez une lamelle sur le support. Scellez immédiatement les bords de la lamelle avec un support de montage à base de xylène et laissez sécher pendant deux à trois heures avant de commencer la microscopie confocale.