Détection de protéines prions anormales dans le tissu cérébral à l’aide de l’immunohistochimie

Prenez une diapositive avec une section fixe du cerveau de mammifère présentant des agrégats de protéines prions mal repliés.

Traitez la section avec de l’acide formique pour réduire l’infectiosité des agrégats de prions.

Traiter avec un tampon acide à l’intérieur d’une chambre de pression hydratée. Une chaleur élevée et une rupture du pH acide induites par la fixation se réticulent, démasquant les épitopes antigéniques.

Immerger dans le peroxyde d’hydrogène pour inactiver la peroxydase endogène, évitant ainsi les taches de fond indésirables.

Placez la lame dans une plaque de recouvrement et ajoutez un tampon pour maintenir l’hydratation des tissus.

Introduire une solution bloquante, empêchant la liaison d’anticorps non spécifiques.

Ajouter un anticorps primaire spécifique aux agrégats de prions.

Retirez les molécules d’anticorps non liées. Introduisez un anticorps secondaire biotinylé qui se lie à l’anticorps primaire.

Retirez les molécules d’anticorps non liées. Ajoutez une enzyme peroxydase biotinylée complexée avec de l’avidine qui se lie à la biotine sur l’anticorps secondaire.

Ajoutez un substrat chromogène, que la peroxydase oxyde en un produit coloré.

À l’aide d’un microscope, observez les agrégats colorés.

Immergez soigneusement les sections de tissu dans de l’acide formique à 98 % à température ambiante pendant 30 minutes. Rincez les sections à l’eau du robinet pendant 5 minutes, puis rincez deux fois à l’eau distillée. Utilisez un récipient de coloration en acier inoxydable dans la chambre de pression remplie de 500 millilitres d’eau distillée pour prétraiter un tampon de citrate de 10 millimolaires à 98 degrés Celsius pendant 20 minutes.

À des fins de contrôle de la qualité, placez une section de ruban indicateur d’autoclave adhésif sur le panier pour surveiller la température et la pression. Une fois que l’alarme indique que l’équipement a atteint le temps et la température du programme, immergez le panier avec les diapositives. Ensuite, lancez le programme sur la chambre de pression jusqu’au point de consigne deux, et enregistrez la pression initiale et finale de ce programme.

Pour l’inactivation de la peroxydase endogène, immergez le panier de lames contenant les sections d’échantillon dans un bain de peroxyde d’hydrogène à 3 % dans du méthanol pendant 30 minutes. Rincez les sections à l’eau courante pendant 5 minutes. Après l’égouttage, plongez les sections dans une solution saline tris-tamponnée pendant 5 minutes supplémentaires. Pour l’immunodétection, placez chaque lame sur un support de plaque de recouvrement disponible dans le commerce et préhumidifié avec une solution saline tamponnée au Tris.

Avec le côté du tissu face au support et les bords de la glissière coïncidant avec les deux points inférieurs du support, assurez-vous d’éviter les bulles d’air. Tenez l’ensemble du support de diapositive entre le pouce et l’index. Gardez un doigt sur le dessus de la lame d’échantillon et l’autre sur le bas du support. Placez ensuite l’ensemble dans la galerie du système.

Pour vous assurer que l’ensemble est bien assemblé, remplissez le puits entre la lame d’échantillon et le support avec une solution saline tris-tamponnée, sans le faire déborder. À partir de ce point, assurez-vous qu’environ 80 microlitres de solution saline tamponnée au Tris doivent être retenus entre le support et la lame. Ne laissez pas les sections sécher.

Diminuer la coloration de fond avant le traitement avec l’anticorps primaire en préincubant les échantillons de lames pendant 30 minutes avec 20 % de sérum normal de la même espèce que l’hôte de l’anticorps secondaire dans une solution saline tamponnée Tris. Sans laver les sections, appliquez 200 microlitres de la solution d’anticorps primaire directement dans chaque puits du porte-lames et incubez pendant 60 minutes à température ambiante.

Pour laver les sections, remplissez les puits de solution saline tris-tamponnée et attendez 5 minutes. Répétez le lavage deux fois. Ensuite, diluez l’anticorps secondaire biotinylé à une concentration de 1 à 200 dans une solution saline tamponnée au tris avec 10 % de sérum de cheval.

Réparer le volume requis, en fonction du nombre de sections à traiter. Appliquez 200 microlitres de solution d’anticorps secondaire dans chaque puits de l’ensemble de supports de lames. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, répétez le lavage salin tamponné au Tris.

Pour l’incubation avec le complexe avidine-biotine peroxydase, préparez le réactif 30 minutes avant l’utilisation et appliquez 200 microlitres de la solution dans chaque puits du support de plaque de lame. Une fois cela fait, incubez le support de plaque réglé pendant 30 minutes à température ambiante.