Méthode basée sur l’immunofluorescence pour quantifier le stress de réplication dans les cellules cancéreuses

Commençons par les cellules cancéreuses porteuses d’IdU, un substitut synthétique du nucléotide de thymidine, déjà intégré dans leur ADN. Lorsque ces cellules sont confrontées à un stress de réplication, la synthèse de leur ADN s’arrête, révélant l’IdU dans les régions d’ADN monocaténaire exposées.

Fixez les cellules et ajoutez des molécules de détergent pour rendre la membrane cellulaire perméable.

Ajoutez BSA pour bloquer les sites de liaison des anticorps non cibles.

Introduire des anticorps anti-IdU qui interagissent avec l’ADN simple brin marqué IdU.

Ajoutez des anticorps secondaires marqués au fluorophore vert qui ciblent les anticorps anti-IdU. Retirez les anticorps non liés.

Placez la lamelle sur une lame contenant un support de montage avec un colorant fluorescent - qui tache les noyaux.

Sous un microscope à fluorescence, observez les noyaux bleus.

Les foyers de fluorescence verts représentent des anticorps se liant à l’ADN simple brin.

Comptez le nombre de foyers pour quantifier le niveau de stress de réplication.

Ajouter 1 millilitre de suspension cellulaire sur des lamelles de poly-L-lysine placées dans les puits d’une plaque de 24 puits et faire croître les cellules da