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Commençons par les cellules cancéreuses porteuses d’IdU, un substitut synthétique du nucléotide de thymidine, déjà intégré dans leur ADN. Lorsque ces cellules sont confrontées à un stress de réplication, la synthèse de leur ADN s’arrête, révélant l’IdU dans les régions d’ADN monocaténaire exposées.
Fixez les cellules et ajoutez des molécules de détergent pour rendre la membrane cellulaire perméable.
Ajoutez BSA pour bloquer les sites de liaison des anticorps non cibles.
Introduire des anticorps anti-IdU qui interagissent avec l’ADN simple brin marqué IdU.
Ajoutez des anticorps secondaires marqués au fluorophore vert qui ciblent les anticorps anti-IdU. Retirez les anticorps non liés.
Placez la lamelle sur une lame contenant un support de montage avec un colorant fluorescent - qui tache les noyaux.
Sous un microscope à fluorescence, observez les noyaux bleus.
Les foyers de fluorescence verts représentent des anticorps se liant à l’ADN simple brin.
Comptez le nombre de foyers pour quantifier le niveau de stress de réplication.
Ajouter 1 millilitre de suspension cellulaire sur des lamelles de poly-L-lysine placées dans les puits d’une plaque de 24 puits et faire croître les cellules dans le milieu de culture dans des conditions standard. Après un doublement de population, aspirez le milieu existant de la plaque et pulsez les cellules avec 10 micromolaires d’IdU pour les deux doublements de population suivants.
Pour récolter les cellules, remplacez le milieu par du PBSTx 0,5 % glacé sur de la glace pendant 5 minutes. Pour la fixation des cellules, aspirez PBSTx et incubez les cellules pendant 15 minutes avec 3 % de paraformaldéhyde à température ambiante. Après 3 à 4 lavages avec PBS, maintenez les cellules fixes à 4 degrés Celsius jusqu’à la prochaine utilisation.
Après la fixation, perméabilisez les cellules à l’aide de 0,5 % de PBSTx sur de la glace pendant 5 minutes, en veillant à couvrir toute la lamelle. Après avoir lavé les cellules 3 à 4 fois avec 1 millilitre de PBST à 0,2 % à température ambiante, aspirez le PBST et bloquez les échantillons, en utilisant du BSA à 5 % fabriqué dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante.
Pour l’immunocoloration, préparez une chambre humidifiée en plaçant une serviette en papier humide sur un Tupperware à fond plat. Couvrez le couvercle de la plaque à 24 puits avec du parafilm. Placez-le dans la chambre humidifiée et déposez les lamelles sur le couvercle de la plaque. Ajoutez 60 microlitres d’anticorps primaire de souris anti-BrdU dilué, sur le dessus de la lamelle.
Alternativement, pour réduire le séchage de l’anticorps et utiliser moins de volume, placez une goutte d’anticorps dilué sur le parafilm et retournez la lamelle dessus dessus. Ensuite, incubez pendant 1 heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, aspirez l’anticorps primaire.
Remettez les lamelles dans une plaque à 24 puits et lavez-les 4 fois avec du PBST à 0,2 %. Ajouter l’anticorps secondaire dilué sur la lamelle, comme démontré précédemment, et incuber pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante. Étiquetez une lame de microscope et fixez la lamelle sur les lames avec un support de montage DAPI. Stockez les lames dans l’obscurité à température ambiante pendant 24 heures si le support de montage doit être durci ou durci.