La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

L’objectif global de la microscopie d’immunofluorescence gamma-H2AX et 53BP1 est d’analyser la formation et la réparation des cassures double brin de l’ADN dans divers tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur le cancer, telles que la façon dont l’instabilité génétique se produit dans les cellules tumorales. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible de visualiser les cassures de deux cordes d’ADN unique et d’analyser les processus de réparation.

Susanne Brendel, technicienne de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez l’expérience en préparant des solutions, en commençant par la solution mère anticoagulante contenant 200 unités internationales d’héparine par millilitre dans du chlorure de sodium à 0,9 %. Remplissez chacun des tubes de prélèvement avec deux millilitres de solution mère d’anticoagulant avant de prélever les échantillons de sang ou de moelle osseuse.

Ensuite, préparez la solution de lyse 10X pour les globules rouges avec 82,91 grammes de chlorure d’ammonium, 7,91 grammes de bicarbonate d’ammonium et deux millilitres de solution d’acide éthylènediamenetetracedique à un pH de 8,0 en dissolvant les agents dans de l’eau doublement distillée pour un volume total d’un litre. Ensuite, préparez la solution de fixation en ajoutant 8,3 microlitres d’une solution molaire d’hydroxyde de potassium à 360 milligrammes de paraformaldéhyde, ou PFA, dans un tube de microtitration. Remplissez le tube d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à ce qu’il atteigne le millilitre du tube et chauffez le tube dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pour obtenir un millilitre d’une solution de PFA à 36 %.

Transférez le millilitre de solution de PFA à 36 % dans un tube de 15 millilitres. Et ajoutez huit millilitres de PBS pour obtenir une solution mère de PFA de neuf millilitres à quatre pour cent. Aliquote la solution mère de PFA à quatre pour cent et conserve-la à moins 18 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour la fixation des cellules.

Ensuite, préparez la solution de perméabilisation en ajoutant 50 microlitres d’octoxynol 9 à 50 millilitres de PBS pour obtenir une solution d’environ 0,1 % d’octoxynol 9. Enfin, préparez des solutions bloquantes à cinq pour cent et à deux pour cent en mélangeant l’agent bloquant protéique avec du PBS. Pour préparer les échantillons de sang ou de moelle osseuse, récupérez les tubes remplis de deux millilitres de solution mère d’anticoagulant.

Prélever sept millilitres de sang ou de moelle osseuse par tube dans des conditions stériles par ponction veineuse ou ponction de la moelle osseuse respectivement. Conservez les échantillons pendant la nuit à température ambiante. Après l’entreposage pendant la nuit, diluer l’échantillon de sang hépariné un à un avec le PBS et l’échantillon de moelle osseuse héparinée dans un rapport de un à trois avec le PBS.

Suspendez doucement les cellules en les aspirant deux fois dans et hors de la pipette. Ensuite, ajoutez un volume de milieu à gradient de densité dans un tube frais. Superposez délicatement le sang ou la moelle osseuse diluée sur le milieu à gradient de densité et veillez à ne pas mélanger les deux couches.

Centrifugez le tube pendant 30 minutes à température ambiante et 400 G.Prélevez la couche supérieure de plasma à l’aide d’une pipette. Ensuite, récoltez soigneusement les cellules mononucléées dans la couche au-dessus du milieu à gradient de densité. Transférez les cellules mononucléées dans un tube frais et ajoutez au moins trois volumes de PBS.

Suspendez doucement les cellules en les aspirant deux fois dans et hors de la pipette. Centrifugez le tube. Après l’essorage, retirez le surnageant.

Ajouter 10 millilitres de quatre degrés Celsius 1x solution de lyse pour les globules rouges. Remettez doucement les cellules en suspension en les aspirant deux fois dans et hors de la pipette et placez le tube sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de PBS à quatre degrés Celsius et centrifugez le tube.

Utilisez des microbilles CD34 et des colonnes de séparation cellulaire pour l’isolement des cellules CD34 positives. Préparer deux cytospins avec des cellules mononucléées des échantillons de patients par centrifugation d’un fois 10 les cinq cellules pour chaque préparation. Fixez les cellules avec 200 microlitres de PFA à quatre pour cent pendant 10 minutes.

Après la fixation, lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de PBS pendant cinq minutes chacune sur un agitateur. Ensuite, perméabilisez les cellules avec 200 microlitres d’octoxynol 9 à 0,1 % pendant 10 minutes. Lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de solution bloquante à cinq pour cent pendant cinq minutes chacune sur un agitateur de laboratoire.

Bloquez les cellules dans 30 millilitres de solution de blocage fraîche à cinq pour cent pendant une heure. La fixation et la perméablation des cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans 0,1 % d’octoxynol 9 préservent nettement les foyers gamma-H2AX et 53BP1. Incuber une préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-gamma-H2AX de souris et l’autre préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-gamma-H2AX de souris et un anticorps polyclonal de lapin anti-53BP1 pendant une nuit à quatre degrés Celsius.

L’utilisation d’anticorps anti-gamma-H2AX et anti-53BP1 éprouvés est fortement recommandée. Après l’incubation, laver doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de solution bloquante à deux pour cent toutes les cinq minutes sur un agitateur de laboratoire. Ensuite, incubez la première préparation des cellules avec un anticorps secondaire conjugué de chèvre anti-souris Alexa 488 dilué un sur 500 dans une solution bloquante à deux pour cent.

Incuber la deuxième préparation des cellules avec un anticorps secondaire conjugué contre la chèvre Alexa 488 et un anticorps secondaire anti-lapin conjugué Alexa 555 dilué un sur 500 dans une solution bloquante à deux pour cent. Lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de PBS sur un agitateur de laboratoire. Retirez le PBS et montez les cellules avec un support de montage.

Placez avec précaution une lamelle sur le support de montage afin qu’aucune bulle d’air ne s’incruste. Attendez au moins trois heures que le milieu de montage durcisse avant d’analyser les cellules par microscopie à fluorescence. Enfin, analysez les foyers gamma-H2AX et 53BP1 dans les noyaux cellulaires avec un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI, Alexa 488 et Cy3 pendant l’imagerie à un grossissement objecté de 100x.

L’analyse des foyers gamma-H2AX dans les cellules est plus précise dans la phase G0, G1 et la phase G2, lorsque les foyers gamma-H2AX apparaissent comme des points fluorescents distincts, comme le montre cette image représentative des fibroblastes. En revanche, l’analyse des foyers gamma-H2AX dans les cellules pendant la phase S est compliquée par des taches gamma-H2AX pannucléaires dispersées causées par le processus de réplication. La coloration par immunofluorescence de gamma-H2AX a été utilisée pour quantifier les cassures double brin de l’ADN dans les tissus irradiés et a permis d’élucider que les niveaux de foyers gamma-H2AX dans les lymphocytes irradiés sont proportionnels à la dose d’irradiation.

La co-localisation des foyers gamma-H2AX et 53BP1 dans les cellules CD34 positives d’un patient atteint de leucémie myéloïde aiguë indique la promotion de mécanismes de réparation non homologues médiés par 53BP1 aux sites de cassures double brin de l’ADN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la microscopie d’immunofluorescence gamma-H2AX et 53BP1 pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunoblotting de l’ATM phosphoryrelated, de l’ATR, de la kinase de point de contrôle un, de la kinase de point de contrôle deux et de la TP53 peuvent être effectuées dans les cellules tumorales afin d’analyser les altérations de la réponse aux dommages de l’ADN.