Name: La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Apprenez la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour analyser la formation et la réparation des cassures double brin de l'ADN dans les cellules tumorales. Cette méthode permet de visualiser les dommages génétiques.

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Le projet a été soutenu par la Fondation allemande José Carreras leucémie (DJCLS 14 R/2017).

toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’éthique II de Mannheim faculté médicale de l’Université de Heidelberg. Écrit le consentement éclairé a été obtenu de tous les individus.
 1. préparation des matériaux <ol><li>solution d’Anticoagulant : préparer une solution anticoagulante de 200 UI héparine par millilitre dans le chlorure de sodium 0,9 %. Remplir chacun des tubes de collection (dessiner volume 9 mL) avec 2 mL de la solution anticoagulante avant retrait des échantillons de sang ou de moelle osseuse.</li>
	<li>Solution de lyse des globules rouges : Prepare le 10 x solution de lyse des globules rouges avec 82,91 g de chlorure d’ammonium, bicarbonate d’ammonium 7,91 g et 2 mL de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique 0,5 M à un pH de 8,0 en dissolvant les agents de eau bidistillée pour un volume total de 1 L.</li>
	<li>Solution de fixation : 8.3 Ajouter µL d’une solution 1 M d’hydroxyde de potassium paraformaldéhyde 360 mg (PFA) dans un tube de microplaques. Remplir le tube avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) jusqu'à la marque de 1 mL du tube et le tube dans un bloc chauffant à 95 ° C pour obtenir 1 mL d’une solution PFA de 36 % de chaleur. Transférer la solution PFA de 36 % de 1 mL dans un tube avec une capacité de 15 mL. Ajoutez 8 mL de PBS à la solution 1 mL des PFA 36 %, pour obtenir 9 mL d’une solution mère de PFA de 4 %. Aliquote de la solution-mère 4 % PFA et conserver à-18 ° C jusqu’au utilisent pour la fixation des cellules. 
	ATTENTION : la solution d’hydroxyde de Potassium 1) est corrosive. Soyez conscient de protection oculaires et cutanées. 2) PFA est cancérigène. Éviter le contact avec la peau et inhalation. Préparer la solution de fixation sous une hotte à.</li>
	<li>Solution perméabilisation : ajouter 50 µL Octoxinol 9 à 50 mL PBS pour obtenir une solution d’environ 0,1 % Octoxinol 9.</li>
	<li>Solution de blocage : préparer 5 % et 2 % des solutions de blocage en mélangeant l’agent bloquant de protéine avec PBS et magasin à 6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. Préparation des échantillons, <ol><li>fibroblastes en culture cellulaire : cultiver des fibroblastes humains de la lignée cellulaire NHDF dans un humidifié 5 % CO 2 atmosphère à 37 ° C dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 4 mM glutamine et 1 % la pénicilline/streptomycine.
	<ol><li>Préparation d’une lame de microscope avec adherent fibroblastes <ol><li>enlever le support du flacon (zone de croissance de 2 75 cm) avec en croissance exponentielle des fibroblastes NHDF. Ajouter 10 mL de PBS dans le ballon. Lavez les fibroblastes adhérents doucement en agitant manuellement pendant 1 min.</li>
			<li>Supprimer le PBS et ajouter la trypsine 1 mL dans le flacon. Agiter le flacon doucement pour s’assurer que toutes les cellules adhérentes sont couverts par la trypsine. Enlever le ballon de la trypsine. Placer la fiole dans l’incubateur pendant 5 min à 37 ° C.</li>
			<li>Prendre le ballon hors de l’incubateur et ajouter 10 mL de milieu RPMI 1640 médium dans le ballon. Déposer le support de haut en bas plusieurs fois pour disperser les fibroblastes.</li>
			<li>0,3 mL des fibroblastes dispersés sur chacun des deux champs de la lame de microscope, déposer et mettre la lame dans l’incubateur pendant 24 h pour que les fibroblastes adhèrent à la diapositive. Pour immunostaining des γH2AX et 53BP1 dans les noyaux des fibroblastes, passez à étape 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Des échantillons de patients <ol><li>des échantillons de sang : utilisez les tubes de prélèvement qui ont été remplis avec 2 mL de la solution anticoagulante et ajoutez 7 mL de sang dans les tubes. Stocker les échantillons pendant une nuit à température ambiante (c.-à-d., 18-20 ° C). Le lendemain, isoler la phase G0/G1 au repos des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité (étape 2.2.3).</li>
		<li>Des échantillons de moelle osseuse : utilisez les tubes de prélèvement qui ont été remplis avec 2 mL de la solution anticoagulante stock (point 1.1) et ajouter la moelle osseuse 7 mL dans les tubes. Stocker les échantillons pendant une nuit à température ambiante (c.-à-d., 18-20 ° C). Le lendemain, isoler la phase G0/G1 au repos des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité (étape 2.2.3). Utilisez CD34 microbilles et cellules de colonnes de séparation pour isoler des cellules CD34 +.</li>
		<li>Isolation des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité 
		Remarque : Les cellules mononucléaires sont isolées du sang et des échantillons de moelle osseuse par centrifugation en gradient de densité 17 , 18 , 19.
		<ol><li>Diluer l’échantillon de sang hépariné dans un rapport de 1:1 avec du PBS et l’échantillon de moelle épinière hépariné dans un ratio de 1:3 avec du PBS. Suspendre les cellules doucement en les dessinant deux fois dans et hors de la pipette.</li>
			<li>Ajouter un volume de milieu de gradient de densité à un nouveau tube. La couche doucement le sang dilué ou la moelle osseuse sur le dessus du milieu de gradient de densité. Prendre soin de ne pas pour mélanger les deux couches.</li>
			<li>Centrifuger le tube pendant 30 min à température ambiante et 400 x g. Retirer la couche de plasma supérieur avec la pipette. Ensuite soigneusement récolter les cellules mononucléées dans la couche au-dessus du milieu de gradient de densité. Transférer les cellules mononucléaires dans un nouveau tube.</li>
			<li>Ajouter au moins trois volumes de PBS aux cellules mononucléaires dans le tube. Suspendre les cellules doucement en dessinant dans et hors de la pipette deux fois. Centrifuger le tube pendant 10 min à température ambiante et 400 x g.</li>
			<li>Le spin, éliminer le surnageant et ajouter 10 mL de 4 ° C, 1 x solution de lyse des globules rouges. Remettre en suspension les cellules doucement en dessinant dans et hors de la pipette deux fois et placer le tube sur la glace pendant 5 min. Ajouter 30 mL de PBS à 4 ° C, puis centrifuger le tube pendant 10 min à température ambiante et 400 x g.</li>
		</ol></li> <li>Préparation de le cytospins <ol><li>préparer deux cytospins avec des cellules mononucléaires des patients échantillons (c'est-à-dire, un cytospin pour γH2AX immunofluorescence souillant et un cytospin pour γH2AX et 53BP1 combiné d’immunofluorescence souillant) par centrifugation (300 x g, 10 min) de 1,0 x 10 5 cellules, pour chaque préparation ( figures 3 et 4).</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX et 53BP1 Immunofluorescence souillant <ol><li>Fixation et permeabilization : fixer les cellules avec 200 µL de 4 % PFA pendant 10 min. Après fixation, laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de PBS de 5 min chacun sur un agitateur de laboratoire. Puis permeabilize les cellules avec 200 µL de 0,1 % 9 Octoxinol pour 10 min. laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de solution de blocage de 5 % de 5 min chacun sur un agitateur de laboratoire. Bloquer les cellules dans 30 mL de frais 5 % bloquant la solution pendant 1 h.</li>
	<li><ol><li>L' incubation avec l’anticorps incuber une préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris (1/500) et l’autre préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris (1/500) et un anticorps anti-53BP1 d’anticorps polyclonal de lapin (1/500) pendant une nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Après incubation des cellules lave doucement 3 fois avec 30 mL de solution de saturation de 2 % pour chaque 5 min sur un agitateur lab.</li>
		<li>Enlever la solution de blocage et incuber la première préparation de cellules avec un anticorps secondaire de conjugué Alexa488 chèvre anti-souris (1/500) et la deuxième préparation des cellules avec un conjugué Alexa488 chèvre anti-souris anticorps secondaire ( 1/500) et d’un âne Alexa555 conjugué anti-lapin anticorps secondaire (1/500) pendant 1 h à température ambiante.</li>
	</ol></li> <li>Milieu de montage : mettre la lame avec les cellules dans un bol et laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de PBS pour chaque 5 min sur un agitateur de laboratoire. Retirez le PBS et montez les cellules avec support de montage contenant 4, 6-diamidino-2-phénylindole. Mettre prudemment un lamelle couvre-objet sur le dessus du milieu de montage, afin qu’aucune bulle d’air ne sont Embedded. Attendre au moins 3 h pour la trempe du milieu de montage avant d’analyser les cellules en microscopie par fluorescence.</li>
</ol> 4. Analyse des γH2AX et 53BP1 foyers <ol><li>la microscopie de Fluorescence : analyser les foyers de γH2AX et 53BP1 dans le noyau de la cellule avec un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI, Alexa 488 et Cy3 pendant la formation image à un objectif X 100 grossissement. Enregistrer des images avec un appareil photo et de traiter les images avec des logiciels d’imagerie appropriées.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
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<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
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<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
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<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 est une méthode utile pour analyser la formation et la réparation de l’ORD dans un large éventail de domaines de recherche. Les paramètres essentiels qui influencent les résultats des expériences sont la phase du cycle cellulaire, les agents utilisés pour la fixation et la perméabilisation des cellules, le choix de l’anticorps et le matériel et les logiciels de la microscopie à fluorescence.
L’influence du cycle cellulaire sur les habitude...

ADN est endommagé en permanence par endogène (par exemple, la réplication stress, espèces réactives de l’oxygène, l’instabilité intrinsèque de l’ADN) et exogènes (par exemple, des radicaux chimiques, irradiation) sources (Figure 1)1,2 ,3,4. Parmi les lésions de l’ADN, cassures double brin de l’ADN (DSB) sont particulièrement graves lésions et peuvent induire la mort cellulaire ou la carcinogenèse. Environ 50 ORD peut-être survenir par cellule et cycle cellulaire5. Dans les cellules de mammifères, la recombinaison (HR) et non-homologues fin-rejoindre (NHEJ) mis au point comme principales voies pour la réparation d’ORD (Figure 2). HR se produit à la fin de la phase S/G2 et utilise une sœur intacte chromatid comme gabarit pour réparation potentiellement exempt d’erreurs. En comparaison, NHEJ est active tout au long du cycle cellulaire et potentiellement mutagènes comme paires de bases peuvent être ajoutés ou réséqués avant la ligature de l’extrémité cassée. En outre, la fin alternative-rejoindre peut être engagé comme un mécanisme lent mutagènes réparation de secours en cas de carence NHEJ6,7.
DSB induit la phosphorylation de l’histone H2AX à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase autour de chaque ORD. Les foyers nucléaires formant sont nommées γH2AX foyers et sont détectés par immunofluorescence microscopie8. ΓH2AX favorise le recrutement des autres protéines sensibles à la DSB et participe au remodelage de la chromatine, la réparation de l’ADN et de transduction de signal9. Comme chaque accent γH2AX est considéré comme un simple ORD, la quantification de l’ORD par microscopie d’immunofluorescence est possible, ce qui a été démontrée dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons de patient10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine clé dans la médiation réparation ORD. Il est impliqué dans le recrutement de DSB-souples protéines, signalisation de point de contrôle et la synapse de DSB se termine15. En outre, 53BP1 joue un rôle essentiel dans le choix de voie de réparation ORD. Il déclenche la réparation d’ORD vers NHEJ, tandis que les RH sont empêchés16. Si l'on considère les véritables fonctions de γH2AX et 53BP1 dans la réparation de l’ORD, l’analyse simultanée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une méthode utile pour l’analyse précise de la formation et la réparation de l’ORD.
Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape pour l’exécution de la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les noyaux des cellules. Plus précisément, la technique est appliquée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF, dans les lymphocytes de radiographie irradié d’une personne en bonne santé et dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë. Les détails de la méthode sont soulignées dans le contexte des résultats présentés.

<table><tbody><tr><td>Milieu RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Milieu pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Héparine sodium</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp ; Héparine 5 000 U.I./mL</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de sodium 0,9 %</td> <td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Composant de la solution mère anticoagulante</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Milieu pour l’isolement des cellules mononucléées</td></tr><tr><td>Solution de trypsine 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Enzyme pour la dissociation des fibroblastes en culture cellulaire</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Isolement des cellules progénitrices myéloïdes CD34+ Lames de</td></tr><tr><td>microscope diagnostiques Thermo</td><td>Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>Lames de microscope</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp ; Centrifugeuse de table&nbsp ;</td></tr><tr><td>Appareil</td><td></td><td></td><td></td>Cytospin</tr><tr><td>Couvercle</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Couvercle pour travailler sans micro-tubes</td></tr><tr><td>Conteneur Cyto</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>Conteneur Cyto avec 2 alésages coniques</td></tr><tr><td>Clip Carrier</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Carrier pour tenir un conteneur Cyto et une glissière</td></tr><tr><td>Insert de support</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>Insert de support pour tenant un support de clip</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Détergent pour la perméabilisation des membranes cellulaires</td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de potassium 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Nécessaire à la préparation de la solution de paraformaldéhyde</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Agent de fixation</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Solution saline équilibrée</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Agent bloquant</td></tr><tr><td>Souris monoclonal anti-&gamma ; Anticorps H2AX (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>Anticorps primaire pour la détection de &gamma ; H2AX</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal anti-53BP1 de lapin (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>Anticorps primaire pour la détection de 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticorps anti-souris conjugué pour chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Anticorps anti-lapin conjugué pour âne</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Vectashield Milieu de montage</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Contient du DAPI pour la coloration de l’ADN</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Microscope à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>490035</td></tr><tr><td>Cool Cube 1 Caméra CCD</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>Système de caméra pour l’enregistrement numérique</td></tr><tr><td>Logiciel Isis</td><td>Metasystems</td><td>Sans objet</td><td>Logiciel de microscope</td></tr></tbody></table>

la microscopie en immunofluorescence de γh2ax et 53bp1 pour l’analyse de la formation et la réparation des cassures double brin de l’adn

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Cassures double brin de l’ADN (DSB) sont de graves lésions de l’ADN. Analyse de la formation et la réparation d’ORD est pertinente dans un large éventail de domaines de recherche, y compris l’intégrité du génome, génotoxicité, radiobiologie, vieillissement, le cancer et le développement de médicaments. En réponse à l’ORD, l’histone H2AX est phosphorylé à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase formant discrètes foyers nucléaires détectables par microscopie d’immunofluorescence. En outre, 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine favorisant l’ORD importante favorisant la réparation de l’ORD par fin-joining non-homologues tout en empêchant la recombinaison homologue. Selon les fonctions spécifiques de γH2AX et 53BP1, l’analyse combinée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une approche raisonnable pour une analyse détaillée de l’ORD. Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape complété par des notes méthodiques pour effectuer la technique. Plus précisément, l’influence du cycle cellulaire sur les habitudes des foyers γH2AX est démontrée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF. En outre, la valeur des foyers γH2AX comme biomarqueur est représentée dans les lymphocytes de radiographie irradié d’un individu sain. Enfin, instabilité génétique est étudiée dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë par microscopie d’immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

Analyse des foyers de γH2AX dans les cellules est plus précis dans la phase G0/G1 et la phase G2 quand γH2AX foyers apparaissent comme des points distincts de fluorescence (Figure 5 a). En revanche, analyse des foyers de γH2AX dans les cellules en phase S est compliquée par taches dispersées γH2AX pan-nucléaire causées par le processus de réplication (Figure 5 b).
Fixat...

Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

L’objectif global de la microscopie d’immunofluorescence gamma-H2AX et 53BP1 est d’analyser la formation et la réparation des cassures double brin de l’ADN dans divers tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur le cancer, telles que la façon dont l’instabilité génétique se produit dans les cellules tumorales. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible de visualiser les cassures de deux cordes d’ADN unique et d’analyser les processus de réparation.Susanne Brendel, technicienne de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez l’expérience en préparant des solutions, en commençant par la solution mère anticoagulante contenant 200 unités internationales d’héparine par millilitre dans du chlorure de sodium à 0,9 %. Remplissez chacun des tubes de prélèvement avec deux millilitres de solution mère d’anticoagulant avant de prélever les échantillons de sang ou de moelle osseuse.Ensuite, préparez la solution de lyse 10X pour les globules rouges avec 82,91 grammes de chlorure d’ammonium, 7,91 grammes de bicarbonate d’ammonium et deux millilitres de solution d’acide éthylènediamenetetracedique à un pH de 8,0 en dissolvant les agents dans de l’eau doublement distillée pour un volume total d’un litre. Ensuite, préparez la solution de fixation en ajoutant 8,3 microlitres d’une solution molaire d’hydroxyde de potassium à 360 milligrammes de paraformaldéhyde, ou PFA, dans un tube de microtitration. Remplissez le tube d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à ce qu’il atteigne le millilitre du tube et chauffez le tube dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pour obtenir un millilitre d’une solution de PFA à 36 %.Transférez le millilitre de solution de PFA à 36 % dans un tube de 15 millilitres. Et ajoutez huit millilitres de PBS pour obtenir une solution mère de PFA de neuf millilitres à quatre pour cent. Aliquote la solution mère de PFA à quatre pour cent et conserve-la à moins 18 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour la fixation des cellules.Ensuite, préparez la solution de perméabilisation en ajoutant 50 microlitres d’octoxynol 9 à 50 millilitres de PBS pour obtenir une solution d’environ 0,1 % d’octoxynol 9. Enfin, préparez des solutions bloquantes à cinq pour cent et à deux pour cent en mélangeant l’agent bloquant protéique avec du PBS. Pour préparer les échantillons de sang ou de moelle osseuse, récupérez les tubes remplis de deux millilitres de solution mère d’anticoagulant.Prélever sept millilitres de sang ou de moelle osseuse par tube dans des conditions stériles par ponction veineuse ou ponction de la moelle osseuse respectivement. Conservez les échantillons pendant la nuit à température ambiante. Après l’entreposage pendant la nuit, diluer l’échantillon de sang hépariné un à un avec le PBS et l’échantillon de moelle osseuse héparinée dans un rapport de un à trois avec le PBS.Suspendez doucement les cellules en les aspirant deux fois dans et hors de la pipette. Ensuite, ajoutez un volume de milieu à gradient de densité dans un tube frais. Superposez délicatement le sang ou la moelle osseuse diluée sur le milieu à gradient de densité et veillez à ne pas mélanger les deux couches.Centrifugez le tube pendant 30 minutes à température ambiante et 400 G.Prélevez la couche supérieure de plasma à l’aide d’une pipette. Ensuite, récoltez soigneusement les cellules mononucléées dans la couche au-dessus du milieu à gradient de densité. Transférez les cellules mononucléées dans un tube frais et ajoutez au moins trois volumes de PBS.Suspendez doucement les cellules en les aspirant deux fois dans et hors de la pipette. Centrifugez le tube. Après l’essorage, retirez le surnageant.Ajouter 10 millilitres de quatre degrés Celsius 1x solution de lyse pour les globules rouges. Remettez doucement les cellules en suspension en les aspirant deux fois dans et hors de la pipette et placez le tube sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de PBS à quatre degrés Celsius et centrifugez le tube.Utilisez des microbilles CD34 et des colonnes de séparation cellulaire pour l’isolement des cellules CD34 positives. Préparer deux cytospins avec des cellules mononucléées des échantillons de patients par centrifugation d’un fois 10 les cinq cellules pour chaque préparation. Fixez les cellules avec 200 microlitres de PFA à quatre pour cent pendant 10 minutes.Après la fixation, lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de PBS pendant cinq minutes chacune sur un agitateur. Ensuite, perméabilisez les cellules avec 200 microlitres d’octoxynol 9 à 0,1 % pendant 10 minutes. Lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de solution bloquante à cinq pour cent pendant cinq minutes chacune sur un agitateur de laboratoire.Bloquez les cellules dans 30 millilitres de solution de blocage fraîche à cinq pour cent pendant une heure. La fixation et la perméablation des cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans 0,1 % d’octoxynol 9 préservent nettement les foyers gamma-H2AX et 53BP1. Incuber une préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-gamma-H2AX de souris et l’autre préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-gamma-H2AX de souris et un anticorps polyclonal de lapin anti-53BP1 pendant une nuit à quatre degrés Celsius.L’utilisation d’anticorps anti-gamma-H2AX et anti-53BP1 éprouvés est fortement recommandée. Après l’incubation, laver doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de solution bloquante à deux pour cent toutes les cinq minutes sur un agitateur de laboratoire. Ensuite, incubez la première préparation des cellules avec un anticorps secondaire conjugué de chèvre anti-souris Alexa 488 dilué un sur 500 dans une solution bloquante à deux pour cent.Incuber la deuxième préparation des cellules avec un anticorps secondaire conjugué contre la chèvre Alexa 488 et un anticorps secondaire anti-lapin conjugué Alexa 555 dilué un sur 500 dans une solution bloquante à deux pour cent. Lavez doucement les cellules trois fois avec 30 millilitres de PBS sur un agitateur de laboratoire. Retirez le PBS et montez les cellules avec un support de montage.Placez avec précaution une lamelle sur le support de montage afin qu’aucune bulle d’air ne s’incruste. Attendez au moins trois heures que le milieu de montage durcisse avant d’analyser les cellules par microscopie à fluorescence. Enfin, analysez les foyers gamma-H2AX et 53BP1 dans les noyaux cellulaires avec un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI, Alexa 488 et Cy3 pendant l’imagerie à un grossissement objecté de 100x.L’analyse des foyers gamma-H2AX dans les cellules est plus précise dans la phase G0, G1 et la phase G2, lorsque les foyers gamma-H2AX apparaissent comme des points fluorescents distincts, comme le montre cette image représentative des fibroblastes. En revanche, l’analyse des foyers gamma-H2AX dans les cellules pendant la phase S est compliquée par des taches gamma-H2AX pannucléaires dispersées causées par le processus de réplication. La coloration par immunofluorescence de gamma-H2AX a été utilisée pour quantifier les cassures double brin de l’ADN dans les tissus irradiés et a permis d’élucider que les niveaux de foyers gamma-H2AX dans les lymphocytes irradiés sont proportionnels à la dose d’irradiation.La co-localisation des foyers gamma-H2AX et 53BP1 dans les cellules CD34 positives d’un patient atteint de leucémie myéloïde aiguë indique la promotion de mécanismes de réparation non homologues médiés par 53BP1 aux sites de cassures double brin de l’ADN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la microscopie d’immunofluorescence gamma-H2AX et 53BP1 pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunoblotting de l’ATM phosphoryrelated, de l’ATR, de la kinase de point de contrôle un, de la kinase de point de contrôle deux et de la TP53 peuvent être effectuées dans les cellules tumorales afin d’analyser les altérations de la réponse aux dommages de l’ADN.

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Recherche sur le cancer

La quantification de l'ADN double-brin de stries en utilisant la formation γH2AX comme marqueur moléculaire est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous démontrons l'utilisation d'un test d'immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers après exposition des cellules aux radiations.

Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes

La quantification de l'ADN double-brin de brise sur la base de γH2AX foyers est devenu un outil précieux, en particulier dans la radiobiologie, pour l'évaluation de la radiosensibilité des tissus et des effets des rayonnements composés de modification. Ici nous démontrons l'utilisation d'un test d'immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers dans des échantillons de tissus.

La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus

L'analyse microscopique des γH2AX foyers, qui forment la suite de la phosphorylation de H2AX à Ser-139, en réponse à l'ADN des cassures double brin, est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous avons utilisé un anticorps mono-méthylé histone H3 lysine à 4 comme un marqueur épigénétique de la transcription euchromatine active, afin d'évaluer la distribution spatiale du rayonnement induit par la formation γH2AX au sein du noyau.

Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX

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Microscopie d’immunofluorescence pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN

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Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

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Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN

Apprenez la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour analyser la formation et la réparation des cassures double brin de l'ADN dans les cellules tumorales. Cette méthode permet de visualiser les dommages génétiques.

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN (Vidéo) | JoVE Journal

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

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