Name: Workflow pour haut-contenu, cellule individuelle quantification des marqueurs fluorescents de Data Universal Microscope, pris en charge par Open Source Software (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez un flux de travail informatique pour quantifier les marqueurs fluorescents nucléaires et cytoplasmiques à l'échelle cellulaire individuelle. Cette méthode utilise Cell Profiler et R Studio pour analyser les réponses cellulaires au knockdown génique.

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Ce travail a été financé par des subventions CRUK 15 043 et 14 251 CRUK. Nous remercions Daniel Wetterskog et Ka Ho Kei pour l&#39;assistance technique et la lecture critique du manuscrit.

1. expérimentale Perturbation et Cell étiquetage pour les marqueurs de réponse (écran arrière transfection siRNA) <ol><li> Dans une culture de tissu hotte pipette stérile 70 pi de 200 nM de siRNA tampon 1x siRNA dans les puits d&#39;une plaine plaque de 96 puits stérile. Diluer transfection lipide dans 40 volumes de milieu de DMEM sans sérum et dispenser 105 pi dans chaque puits contenant un ARNsi. NOTE: La dilution 262,5 pi lipides dans 10,5 ml de DMEM sans sérum donne un mélange maître approprié pour l&#39;ensemble plaque de 96 puits de siRNA, délivrant 2,6 pi de lipides par puits. Utilisation de 200 nM siRNA concentration à partir de cette étape donnera une concentration de travail de 20 nM dans l&#39;étape 1.3, mais les procédures travaillera pour des concentrations en descendant à 5 nM, avec la concentration de départ ajustée en conséquence (soit 50 nM). Concentration de travail inférieure peut réduire scores positifs faux hors-cible, mais ils peuvent réduire l&#39;ampleur de la réponse sur la cible, conduisant à une augmentation du sur-target taux de faux négatifs. </li><li> Mélanger la plaque de vibration douce pendant dix minutes à la température ambiante. Sous-diviser les 175 pi résultant en trois répétitions par 50 pi cible sur une culture de tissu opaque traité, plaque de 96 puits avec une base transparente. </li><li> Transfecter inversée en distribuant 8000 cellules par puits dans 150 ul de DMEM contenant du sérum à 10% directement sur les complexes de lipides siRNA 50 ul. Cellules colorectales humaines utilisation HCT116 exprimant de manière stable un marqueur GFP-tagged déclarant l&#39;activité CDK2 5,8. Aucune autre mélange est nécessaire. Sceller la plaque avec un adhésif membrane respirante stérile pour contrôler l&#39;humidité et prévenir les bords effets &#39;plaque et placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 48 heures. </li><li> Aspirer les médias tels qu&#39;une petite quantité résiduelle de médias reste dans les puits. Fixer les cellules par addition de 100 pl de 4% de formaldehyde tamponnée à chaque puits et incuber dans une hotte de laboratoire pendant 10 min à t ambianteempérature. </li><li> Retirer la solution de fixation par aspiration la plaque. À ce stade, soit arrêter l&#39;expérience en lavant la plaque trois fois avec 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis stocker scellé, moins de 100 pi de PBS dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine, ou procéder à la perméabilisation des cellules. NOTE: Nous recommandons plaques de traitement dès que possible après la fixation, et généralement préfèrent le stockage de plaques entièrement transformés. Des conservateurs tels que des biocides thimérosal, l&#39;azoture de sodium, ou alternatives commerciales peuvent être ajoutés pour empêcher la croissance micoroganismal. Addition d&#39;inhibiteurs de phosphatase aide à préserver phospho-épitopes, et d&#39;autres moyens de préserver états de modification de la protéine peut être utile dans des contextes d&#39;analyse pertinents </li><li> Retirer la plaque de PBS et perméabiliser les cellules par addition de 100 ul de solution de perméabilisation. Incuber pendant 10 min à température ambiante, sans agitation. Aspirer la solution de perméabilisation utilisant un Multichpipette Annel. Répétez cette étape trois fois. </li><li> Bloquer les cellules en ajoutant une solution du bloc 100 ul par puits pendant 30 minutes à température ambiante. Retirer la solution de bloc en aspirant la plaque, puis sonder avec 50 ul d&#39;anticorps RB1 P-S780 lutte contre dilué 500 fois dans la solution de bloc pendant 2 heures dans l&#39;obscurité à la température ambiante. </li><li> Laver la plaque trois fois avec 100 ul de solution de lavage de plaque, en laissant la solution sur la plaque pendant 5 minutes à chaque fois. Sonde de la plaque pendant une nuit dans l&#39;obscurité à 4 ° C avec 50 dilué 1000 fois ul marqué par fluorescence de l&#39;anticorps secondaire dans une solution de bloc supplémenté avec 2 uM de colorant de l&#39;ADN spécifique de la chromatine bisbenzimide. Laver la plaque trois fois avant et magasin étanche, moins de 100 pi de PBS dans l&#39;obscurité à 4 ° C. Image de la plaque dans les deux semaines. </li></ol> 2. Imagerie et segmentation d&#39;images <ol><li> Utilisez un microscope confocal ou à disque rotatif fluorescence avec un objectif 20X à prendre séparée 16bits, les images TIFF en niveaux de gris en trois canaux correspondant au colorant d&#39;ADN, la GFP et les fluorophores immuno-coloration. Capturez le nombre de jeux d&#39;images non-chevauchement, appelé ici cadres, à l&#39;image d&#39;environ 1.000-2.000 cellules par puits. </li><li> Nommez les fichiers d&#39;image systématiquement de sorte que chaque nom de fichier est une combinaison unique de &#39;nom de l&#39;expérience »,« adresse bien »,« numéro d&#39;image »et« identificateur de canal », dans cet ordre (Figure 3). L&#39;ensemble des données de l&#39;exemple utilise &quot;Bleu&quot; (chromatine coloration de l&#39;ADN) ou «vert» (GFP) ou «Red» (le fluorophore immuno-colorés) comme identificateurs de canal. L&#39;adresse de puits, numéro de châssis et le canal identifiant sont plus loin appelé les métadonnées de l&#39;image. Utilisez le symbole de soulignement pour éviter bien et le cadre métadonnées confusion. </li><li> Nommez les fichiers avec ces éléments de métadonnées dans l&#39;ordre spécifié. Cela est nécessaire pour se assurer que les étapes ultérieures de logiciels Correjeux de groupe cte d&#39;images pour l&#39;analyse. </li><li> Téléchargez et installez la cellule Profiler freeware, Active Perl Community Edition, environnement de programmation statistique R et RStudio. Acceptez toutes les options par défaut lors de l&#39;installation; PC utilisateurs installant Active Perl devraient permettre toutes les options relatives à PATH, association extension de fichier et le mappage de script où vous êtes invité. Active Perl est facultative pour les utilisateurs de Mac, mais ils autrement besoin pour exécuter le script Perl à l&#39;étape 3.2 de la ligne de commande Terminal plutôt que d&#39;utiliser l&#39;icône clic. </li><li> Ouvrez le logiciel Cell Profiler, cliquez sur «Fichier», «importation Pipeline», puis «À partir du fichier&quot; et sélectionnez le fichier 3_channels_pipeline.cppipe (figures S1A et S1B). Le fichier contient les instructions nécessaires pour le logiciel d&#39;interpréter l&#39;image métadonnées du fichier de la convention de nom de fichier décrit. Cellule Profiler concerne maintenant les images, des extraits d&#39;ADN nucléaire et intensités anticorps de eese et utilise le canal de la GFP pour calculer le ratio de l&#39;énergie nucléaire par rapport intensité de cytoplasme pour chaque cellule détectés (figures 4 et 5). </li><li> Cliquez sur le bouton «Afficher les paramètres de sortie» dans le coin inférieur gauche de la fenêtre Cell Profiler. Au sommet de la nouvelle écran sont encadrés portant la mention «Dossier d&#39;entrée par défaut» et «Dossier de sortie par défaut &#39;. Un à la fois, cliquez sur le dossier icônes à droite de ces cases et sélectionnez l&#39;emplacement des fichiers d&#39;image pour l&#39;analyse et la destination des données extraites, respectivement (figure S1C). </li><li> Commencer l&#39;analyse d&#39;image en appuyant sur le bouton &#39;analyser les images de dans le coin inférieur gauche de Cell Profiler. Au bas de l&#39;écran observer le temps restant pour l&#39;extraction de données, la «Analyse Stop &#39;et boutons de la« pause ». Si nécessaire pause l&#39;analyse en sélectionnant le bouton &#39;Pause&#39; à tout moment, ce qui est utilelorsque vous regardez les images en cours d&#39;analyse (décrit dans l&#39;étape 2.8). </li><li> Eventuellement, ouvrir les fenêtres pour l&#39;une des étapes d&#39;analyse d&#39;images en cliquant sur ​​les oculaires icônes dans le panneau à l&#39;extrême gauche de la fenêtre du programme (Figure S1D). Observez la fenêtre &#39;&#39; IdentifyPrimaryObjects et ceux pour «secondaires» et «objets tertiaire» pour vérifier que les paramètres actuels cellulaire Profiler pour effectuer la segmentation d&#39;image sont adaptés (voir la figure 1 et de discussion pour des conseils sur la modification de ces paramètres). </li><li> Cliquez sur «OK» dans la boîte de message qui se affiche lorsque l&#39;analyse est terminée. Allez à l&#39;emplacement &#39;Default Folder de sortie »où tous les fichiers de données avec les résultats sont enregistrés en tant que séparés par des virgules valeur (.csv) (Figure S2A). </li></ol> 3. Extraction des données <ol><li> Trouver le nouveau fichier &#39;Nuclei.csv&#39;, qui est inclus parmi lessortie de cellule Profiler. Ce fichier contient des données de cellules individuelles pour fluorescente intensité d&#39;anticorps nucléaire, l&#39;intensité de l&#39;ADN nucléaire et des valeurs de rapport rapporteur GFP-CDK2 (figures 6A et S2A). REMARQUE: Différents laboratoires voudront traiter ce type de données en fonction de la nature de leurs propres essais. Suggérée pour les données en cours est le déclenchement des cellules de chaque condition de traitement en fonction des données d&#39;anticorps et les valeurs de rapporteur GFP CDK2 en utilisant le script Perl disponible &#39;de 2_gate_classifier.pl. </li><li> Copiez le fichier de script Perl fourni &quot;de 2_gate_classifier.pl» dans le même dossier que le fichier de données du &#39;Nuclei.csv&#39; (Figure S2A). Double-cliquez sur l&#39;icône pour le script Perl et, lorsque vous êtes invité, tapez le nom complet du fichier de données suivie d&#39;une &#39;.csv&#39; nom de nom du fichier dans lequel les cellules doivent être fermée et enfin les valeurs à la ferme pour l&#39;anticorpsfluorescence et données rapporteurs GFP-CDK2. NOTE: Comment faire pour déterminer principalement les paramètres de grille et de les appliquer à l&#39;analyse des données sont discutés ci-dessous dans la section des données représentatives et la figure 6 (pour analyser les données fournies utilisation &#39;0,004&#39; et &#39;1.5&#39;, respectivement). Les utilisateurs de Mac doivent exécuter le script Perl à partir de la ligne de commande Terminal en tapant: «perl 2_gate_classifier.pl &#39;. </li><li> Observez le fichier nouvellement créé qui combine les valeurs individuelles premières d&#39;analyse cellulaire à partir des données Cell Profiler originaux avec des étiquettes des sous-populations qui montrent comment chaque cellule de chaque puits effectue contre les deux portes (Figure 6C). </li><li> Tracer les données pour chaque condition expérimentale en utilisant les étiquettes individuelles de sous-populations de cellules en ouvrant le logiciel RStudio. Cliquez sur «Fichier» et «Open File», puis sélectionnez le fichier fourni &quot;de analysis.r &#39;. Respecter les commandes pour tracer les figures 6B, <strong&gt; 7 et 8 dans la fenêtre supérieure gauche de RStudio (Figure S2B). Dans la fenêtre en haut à gauche, entre les symboles de citation doubles sur les lignes 5 et 6, tapez l&#39;adresse de l&#39;ordinateur du dossier contenant les données gated. Inclure la lettre de lecteur et le nom du fichier lui-même, respectivement (par exemple, &quot;C: / dossier d&#39;analyse / sortie d&#39;analyse» et «nuclei_gated.csv&quot;). NOTE: Si RStudio est utilisé pour la première fois sur un ordinateur donné, le logiciel graphique de R &#39;de ggplot2&#39; devra être installé en premier. Ce est une étape qu&#39;une seule fois pour une nouvelle installation de RStudio, après quoi cette étape devient redondant. Pour installer &#39;ggplot2&#39;, cliquez sur l&#39;onglet appelé «paquets» dessus de la fenêtre dans le coin inférieur droit de RStudio, cliquez sur le bouton &quot;installer des paquets» qui apparaît sous cette. Une nouvelle fenêtre apparaît. Type &#39;ggplot2&#39; (des citations omettant) dans le s &#39;paquets&#39;le rythme dans cette nouvelle fenêtre et enfin cliquez sur le bouton «Installer» pour fermer la fenêtre, installer les fonctions de ggplot2 nécessaires et revenir à la fenêtre principale de RStudio de continuer de l&#39;étape 3.6. </li><li> Faits saillants des lignes 1 à 17 dans la fenêtre en haut à gauche de RStudio, puis cliquez sur le bouton &quot;Exécuter&quot;. Ce entrera les données expérimentales, les valeurs de seuil et les détails de localisation de bien dans R (Figure S2C). R va maintenant détenir temporairement les données pertinentes pour le traçage. </li><li> Mettez en surbrillance les blocs individuels du code restant sous la ligne 17 et de créer les parcelles correspondantes en cliquant sur le bouton &quot;Exécuter&quot; comme avant. Respecter les parcelles dans la fenêtre dans le coin inférieur droit de RStudio et économisez nombre de formats en cliquant sur ​​le bouton &#39;Export&#39; (Figure S2D). </li><li> Lors de la fermeture RStudio, cliquez sur «Ne pas enregistrer&quot; lorsque vous êtes invité. Cela évite la confusion sur la prochaine utilisation de RStudio, qui autrement détenir des donnéesde la session précédente. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer

Le flux de travail décrit constitue une procédure de perturbance multipuits de cellules en utilisant des siRNA, la détection de marqueur ultérieur et enfin l&#39;utilisation d&#39;une série d&#39;étapes de logiciels pris en charge pour faciliter l&#39;extraction de données quantitatives à partir des images de microscopie à fluorescence résultant. L&#39;approche est axée sur la prestation de valeurs d&#39;intensité nucléaires et cytoplasmiques de cellules individuelles, qui a une large application pratique dans de nombreuses applications à base de cellules. Les données d&#39;exemple utilisées ici ont été générés dans un cadre d&#39;écran siRNA dans lequel deux essais de fluorescence pour le transit du cycle cellulaire en phase G1 sont testés et corrélés retour à une mesure biophysique plus directe de la teneur en ADN nucléaire. L&#39;utilisation d&#39;un ADN colorant fluorescent à l&#39;ADN nucléaire de l&#39;image est une étape indispensable dans le processus de segmentation d&#39;image car elle permet l&#39;identification de cellules individuelles et résultant &#39;masque noyaux »sert de point de départ pour identifier cytoplasmi correspondantc régions. La CDK2 rapporteur GFP-étiqueté, qui est exprimé de façon stable dans les cellules, donne encore une variable systématiquement plus élevée que le signal de fond dans le cytoplasme par lequel ce compartiment peut être délimitée. La même pipeline d&#39;analyse devrait être applicable à l&#39;analyse des événements protéines de translocation utilisant d&#39;autres journalistes de fluorescence liée appropriées et leur réponse à perturbance. En outre, la substitution du rapporteur GFP-CDK2 avec des colorants fluorescents spécifiques à cytoplasme permettrait l&#39;utilisation alternative de cet algorithme pour mesurer les dimensions du cytoplasme et les tailles relatives des cellules dans les images. Une autre considération de conception dans la stratégie de segmentation d&#39;image décrit ici est l&#39;utilisation de cellules Profiler pour fournir des valeurs d&#39;intensité intégrés pour la quantification de l&#39;ADN. Intégration des valeurs d&#39;intensité pour l&#39;ADN nucléaire des données de coloration permettent de variations possibles dans la taille noyau, et représente un match serré pour les profils de quantification vuspour l&#39;iodure de propidium teinté FACS données. Cependant, l&#39;intensité intégrée peut ne pas donner les moyens appropriés pour évaluer la fonction de la protéine où la concentration moyenne, illustré par l&#39;intensité moyenne de l&#39;antigène fluorescence, est biologiquement plus pertinent que le montant total intégrée de protéines (et fluorescence associée) dans un compartiment cellulaire. Par conséquent, les valeurs moyennes d&#39;intensité ont été utilisés pour la P-S780 RB1 et des données de GFP. L&#39;option de modifier entre les deux modes (moyenne ou intégrée) de l&#39;évaluation des données se trouve sur le panneau &#39;ExportToSpreadsheet&#39; du logiciel Cell Profiler. Les paramètres d&#39;analyse dans le fichier 3_channels_pipeline.cppipe sont optimisés pour les images de l&#39;ensemble des données d&#39;exemple. Analyse des nouvelles images ensembles avec ce protocole, il faudra que les noms de fichiers adopter la convention de nommage décrite ci-dessus (Figure 3). En outre, la sensibilité valeurs en fonction de la luminosité de la coloration et des seuils d&#39;ADN nucléaire pour le fondintensités dans les nouveaux ensembles d&#39;image peuvent avoir besoin d&#39;être ajusté dans les paramètres Cell Profiler. Étant donné le rôle clé de la coloration de l&#39;ADN détient pour la construction des différents masques de segmentation d&#39;image, l&#39;application des réglages de sensibilité correctes pour ce canal est la clé du succès de l&#39;analyse de nouvelles données d&#39;image avec le logiciel Cell Profiler. Le fichier de paramètres fourni de Profiler de cellule (3_channels_pipeline.cppipe) contient des notes sur les paramètres les plus fréquemment utile pour adapter l&#39;analyse de nouvelles données. Ces notes sont dans la zone de texte en haut de l&#39;écran dans la Cellule fenêtre principale Profiler et comprennent des conseils sur la modification des réglages de sensibilité et en ajustant le nombre de canaux à analyser. Comme inculpé dans la section Protocole 2.8, pour tester les paramètres pour les nouvelles données d&#39;image, il peut être nécessaire d&#39;observer la segmentation d&#39;image lors de l&#39;analyse d&#39;image en cliquant sur ​​Ouvrir les icônes «oculaires» pour chacun des «Identifier ... Objets de protocole les étapes (Figure S1D </strong&gt;). En particulier, la visualisation des données d&#39;image à travers des «IdentifyPrimaryOjects &#39;indique si le masque noyaux est correctement identifié à partir d&#39;images de la coloration de l&#39;ADN. Sur la page de logiciel Cell Profiler pour le module &#39;de IdentifyPrimaryOjects est le facteur de correction de seuil. Essais et erreurs réglage de cette valeur sera corriger la plupart des erreurs de reconnaissance nucléaires. Les valeurs Solde le canal d&#39;ADN contre l&#39;intensité de fond pour chaque image. valeurs de facteur de correction de seuil charnière autour de 1, où plus de cela est plus rigoureuse (bon pour des images claires) et moins de 1 est clémente (adapté aux images avec moins de contraste entre la coloration et le fond). Le résultat brut des données de cellule individuelle auprès de Cell Profiler peut être analysée de différentes façons pour répondre aux besoins d&#39;autres études. Montré ici est l&#39;utilisation d&#39;un script Perl pour appliquer portes à deux des paramètres mesurés par cellule afin d&#39;aider à extraire les tendances biologiques de l&#39;un de donnéesd permis renvois des sous-populations identifiées avec des mesures supplémentaires. Bien qu&#39;il soit également possible d&#39;inclure des éléments de déclenchement dans le cadre de Cell Profiler, la route alternative utilisée ici fournit une plus grande flexibilité et la vitesse, surtout si de grands ensembles de données doivent être évaluées. L&#39;étape la plus lente dans les phases de post-acquisition de l&#39;image de l&#39;actuel protocole est le fonctionnement du logiciel Cell Profiler. Cellule profiler ici est exécuté sans imposer portes pour produire une première série de données de l&#39;ONU-fermée qui peut être réanalysé avec le script Perl ultérieure plus rapidement et, si nécessaire, de manière itérative avec différentes valeurs de grille. Toutes les études ne sauront à l&#39;avance les valeurs de grille appropriés que cela peut varier avec des réactifs sur ne importe quel ensemble de données, et potentiellement au fil du temps. Il est donc recommandé de générer des histogrammes représentant la distribution de données brutes obtenues à partir de cellules Profiler pour les contrôles positifs et les cellules maquette perturbés afin d&#39;identifier porte valu appropriéees pour les paramètres d&#39;intérêt. Les scripts Perl sont écrits à accepter une structure de données provenant de cellules Profiler de colonne définis de façon rigide et peuvent cesser de fonctionner si un utilisateur modifie le nombre de sortie des paramètres par Cell Profiler aide des paramètres du &#39;ExportToSpreadsheet&#39;. Pour aider à mettre en œuvre la modification des paramètres notes sont incluses dans les fichiers de script Perl. Pour voir ces voir le script dans un éditeur de texte, de préférence l&#39;éditeur de texte d&#39;un programmeur fixé aux éléments de Perl de code de couleur (par exemple, http://www.activestate.com/komodo-edit). Ces notes indiquent où régler le script pour se adapter aux changements dans le format de données. Comme pour les scripts Perl, le fichier R-code fourni (analysis.r), contenant les instructions pour tracer les chiffres à partir des données d&#39;analyse d&#39;image, peut être lu dans un éditeur de texte ou le logiciel RStudio pour voir les notes supplémentaires sur l&#39;utilisation et l&#39;adaptation. Ces notes peuvent être complétées avec des détails sur les expressions régulières Perl et &lt;sup&gt; 12 et le paquet ggplot2 13 R, les deux qui forment la base de la façon dont les données sont lues, annotées et tracée, respectivement. De nouvelles études utilisant la microscopie de fluorescence, ainsi que des données brutes déposés auprès publications open source se prêtent à des méthodes d&#39;analyse tels que ceux décrits ici. La nature même des données à haut contenu se prête à l&#39;analyse récursive avec des accents différents analytiques en fonction des intérêts de recherche de tout observateur donné. Bien que les questions qui peuvent être posées des données sont limitées par les sondes utilisées à l&#39;origine, des données d&#39;image peuvent souvent être réanalysés significative au-delà de la portée des études qui les ont générés.

Le travail présenté ici décrit l&#39;utilisation du logiciel portable disponible gratuitement Profiler pour effectuer répartition algorithme guidée d&#39;images de microscopie de fluorescence de cellules adhérentes pour identifier des cellules individuelles et des régions subcellulaires définies. Cette approche, appelée segmentation d&#39;image, permet l&#39;analyse multi-paramétrique ultérieur des cellules imagées par la quantification des marqueurs marqués par fluorescence localisées à chaque cellule ou de la région subcellulaire (ci-objets segmentés). Ce flux de travail constitue une base pour permettre une analyse de haut-contenu et est destiné à servir comme un outil qui peut être encore développé et modifié pour répondre multi-paramétrique, cellule individuelle analyses dans les laboratoires, sans accès à des instruments de haut contenu spécialisés ou des logiciels propriétaires. Les fichiers fournis avec ce manuscrit comprennent un ensemble de données d&#39;images brutes pertinentes, les paramètres de l&#39;algorithme et son appui test pour générer l&#39;analyse décrit. Les réglages de l&#39;algorithme fourni fou cellulaire Profiler sont optimisés pour l&#39;ensemble de données d&#39;exemple et les détails de la section Discussion quels ajustements peuvent être nécessaires pour permettre l&#39;utilisation de données d&#39;image d&#39;autres études. Une fois les données quantitatives a été extrait en utilisant cellulaire Profiler, les laboratoires peuvent avoir des exigences différentes pour savoir comment utiliser l&#39;information présentée par les valeurs des cellules individuelles dans les données brutes; montré ici est une méthode par laquelle les portes sont appliquées aux données brutes pour chaque dosage. L&#39;utilisation de ces portes, les données sont transformées en termes binaires de réponse, permettant la visualisation de l&#39;évolution des traitements différents de liaison avec les sous-populations de cellules subissant une réponse définie par les barrières. Les portes sont fixés en fonction des observations des distributions de données obtenues pour les contrôles négatifs et positifs appropriés pour chaque mesure pertinente. L&#39;utilisation de portes ne est qu&#39;un exemple de la façon de gérer les premières mesures, à base de cellules. Également montré ici est l&#39;utilisation de l&#39;intensité de l&#39;ADN nucléaire moiasurements dans leur forme brute comme une plage continue de valeurs en combinaison avec les données gated. D&#39;autres approches pour la gestion des données d&#39;analyse d&#39;image doivent être envisagés, en fonction de la nature de l&#39;étude; alternatives à l&#39;utilisation de statistiques portes pour affecter les cellules à des sous-populations ont été signalés 2 et systématiques des comparaisons de stratégies pour résumer les données à haute teneur sur un grand nombre de paramètres ont été signalés 3. Analyses Haute-contenu de données d&#39;image ont trouvé une utilisation dans les études cellulaires de drogues-réponse, la génétique inverse et le stress environnemental signalisation 4-6. Le mérite de tiges analyse à haute teneur du fait que l&#39;analyse algorithmique de données de microscopie à fluorescence permet des paramètres quantitatifs et spatiales à prendre en compte simultanément dans des cellules individuelles 7. De cette manière, les résultats de plusieurs essais cellulaires peuvent être recoupées comportement, de dosage différentiel-dsous-populations de cellules efined peuvent être suivis dans des conditions expérimentales et les essais peuvent inclure l&#39;examen des variables morphologiques. L&#39;analyse des stratégies et des flux de travail a discuté ici, comme pour d&#39;autres approches à haut contenu, sont capables de fournir des données multiplexées qui sont des renvois à des cellules individuelles. Des études de haut contenu méthodes costume qui génèrent des images de microscope à fluorescence et sont applicables à l&#39;analyse des données allant de quelques dizaines d&#39;images produites en microscopie de fluorescence à base conventionnelle faible débit grâce aux milliers d&#39;images produites en utilisant des plates-formes de criblage à haut contenu automatisés. Le workflow est illustré ici avec des exemples de données à partir de laquelle essais séparés sont mesurés en termes de soit intensités de marqueurs fluorescents nucléaires ou translocation cytoplasmique / nucléaire d&#39;une protéine rapporteur fluorescent, respectivement. Le flux de travail est souple en ce que ces dosages peuvent être considérées séparément ou en combinaison en fonction de l&#39;EACh donnée question de recherche par différents enquêteurs. Les données d&#39;exemple sont produites dans le cadre d&#39;une interférence ARN (ARNi) expérience (Figure 1). Les petits oligonucléotides d&#39;ARN interférents (siARN) sont utilisés pour knockdown protéines spécifiques dans HCT116 cellules de carcinome de côlon humain qui se traduisent par des changements pour deux rapporteurs fluorescents de kinase (CDK) l&#39;activité de la cycline-dépendante. La phosphorylation de la CDK6 dépendante de la protéine du rétinoblastome nucléaire à serine 780 (P-S780 RB1) est évaluée par coloration d&#39;anticorps. Dans les mêmes cellules, un fluorescent reporter vert de la protéine à étiquette de l&#39;activité CDK2 (GFP-CDK2 reporter) est évaluée par sa nucléaire rapport cytoplasmique où en l&#39;absence de l&#39;activité de CDK2 le rapporteur réside dans le noyau et sur les navettes d&#39;activation de CDK2 dans le cytoplasme 8. En outre, l&#39;ADN nucléaire de chaque cellule est coloré en utilisant un colorant intercalant de l&#39;ADN, bisbenzimide, qui sert en tant que moyen pour identifier les cellules et définir les frontières des noyaux dans les images ainsi unemesure de sa abondance de l&#39;ADN de fournir des informations sur la position de cycle cellulaire de la cellule (figure 2). Les activités de la CDK2 et de la CDK6 peuvent être détectés comme des cellules de transit G1 à la phase S du cycle cellulaire et 5 se succèdent 9,10 et, de ce fait, la concordance étroite entre les deux rapporteurs dans des cellules individuelles est attendue. L&#39;ensemble de données de démonstration utilisée ici analyse comme un exemple de l&#39;effet de siRNA ciblant CDK6, protéine du rétinoblastome (RB1) et un contrôle négatif non-ciblage (tableau 1). Knockdown de CDK6 doit obtenir à la fois une diminution de l&#39;épitope RB1 P-S780 et une accumulation de cellules en phase G1 du cycle cellulaire. Le knockdown de RB1 sert de témoin de réactif pour la spécificité de l&#39;anticorps phospho-S780. Des images de microscopie à fluorescence de la formaline 11 fixés, les cellules de culture de tissu de HCT116 colorées par fluorescence sont utilisés pour l&#39;analyse d&#39;image algorithmique. Les données numériques résultant est ensuite utilisé pourréférence croisée les journalistes et juger de l&#39;impact des différents états knockdown. La taille potentielle des données produites par ce type d&#39;analyse peut présenter un défi aux outils d&#39;analyse normales. Par exemple, les données de cellules individuelles peuvent être plus grand que certains logiciels de tableur accueillir. Inclus sont des scripts Perl qui effectuent hautement répétitif, de traitement simple, supervisé des données pour faciliter l&#39;analyse de grands ensembles de données. Les scripts Perl sont écrits spécifiquement pour les fichiers de sortie produits par Cell Profiler, lors du traitement des fichiers d&#39;image avec un fichier convention de nommage spécifique (figure 3), et permettent un nombre variable de champs par puits pour être utilisées dans l&#39;analyse. Il est souvent important de données de titrage porte de cellule individuelle pour suivre les tendances dans les sous-populations de cellules 5 et représenté ici est l&#39;utilisation d&#39;un script Perl pour marquer chaque cellule basée sur un ensemble porte prédéterminé pour chaque type d&#39;essai. Sont également inclus les scripts Perl optionnelsqui résument les résultats de données pour des puits individuels (ou conditions), la prestation: pourcentage de cellules dans la grille de jeu et les valeurs moyennes des scores de dosage premières. Ce dernier moyen, plus homogène de la visualisation des données, est valable lorsque des réponses affectent la totalité ou la majorité des cellules à l&#39;intérieur d&#39;un puits. Comme discuté ci-dessus, cette évaluation est moins utile que celle conférée par l&#39;individu déclenchement de données de cellule dans laquelle la réponse est limitée à un sous-ensemble de cellules dans une population. L&#39;utilité du flux de travail décrite ne est pas limitée à une perturbation par siRNA ou les dosages de marqueurs décrits. Des études ont utilisé cette méthode pour évaluer la réponse dans les expériences de culture de tissu en utilisant des combinaisons de siRNA, inhibiteurs chimiques et des traitements de radiothérapie et d&#39;évaluation des marqueurs autres que CDK6 et l&#39;activité de CDK2 5. Conceptuellement, la stratégie expérimentale permet une variété de régions subcellulaires biologiquement utiles pour être automatiquement enregistrédans des cellules individuelles présentes dans les images au microscope à fluorescence. En tant que tel, cette approche peut produire des données multiplexées révélant des informations quantitatives, biologique qui peut être manquée par des techniques qui mettent l&#39;accent sur les populations plutôt que des cellules individuelles. Avec des modifications mineures, l&#39;approche et l&#39;analyse flux décrit peut produire des données de cellules quantitatives, individuelles pour toutes les sorties de dosage basés sur la fluorescence et les réponses des cellules biologiques, où l&#39;évaluation quantitative de la teneur en ADN, la quantification de la fluorescence nucléaire ou cytoplasmique ou le mouvement alternatif des marqueurs entre ceux-ci deux compartiments individuellement ou d&#39;une manière multiplexée est d&#39;intérêt. Comme les exigences de publication tendent plus vers la présentation de données brutes librement accessibles, l&#39;accès et la familiarité avec les outils gratuits pour l&#39;analyse d&#39;images de microscopie telles que celles décrites ici sera également un intérêt direct pour les laboratoires qui cherchent à réanalyser les données publiées.

<table><tbody><tr><td>SiRNA à contrôle négatif AllStars</td><td>Qiagen</td><td>1027280</td><td>SiRNA à contrôle négatif.</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/ Synthèse personnalisée</td><td>NA</td><td>Séquence antisens : 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/ Synthèse personnalisée</td><td>NA</td><td>Séquence antisens : 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x tampon siRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>À diluer avec de l’eau traitée sans nucléase et non DEPC.</td></tr><tr><td>Eau sans Nulcease (non-DEPC)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>Pour la dilution du tampon siRNA.</td></tr><tr><td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>Transfection lipidique.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>milieux de culture tissulaire enrichis en pyruvate et en glucose.</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire 96 puits</td><td>Falcon</td><td>3072</td><td>Plain, plaque de culture tissulaire 96 puits pour le mélange parallèle et compartimenté de complexes de transfection.</td></tr><tr><td>Packard Viewplate</td><td>Perkin Elmer LAS</td><td>6005182</td><td>plaque TC à 96 puits avec base optique sur laquelle les cellules sont transfectées, cultivées, fixées et finalement imagées. Fourni avec des joints de plaque adhésifs opaques, qui sont utilisés lors du stockage des plaques usagées.</td></tr><tr><td>Membrane respirante</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>Membrane adhésive stérile, perméable aux gaz.</td></tr><tr><td>Fixateur de formol tamponné neutre, 10 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td><td>10 % de formol (4 % de formaldéhyde) utilisé pur dans le protocole.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>Détergent</td></tr><tr> non ionique<td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Base Trizma (tris(hydroxyméthyl)aminométhane)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Pour solution de lavage des plaques.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-P-S780 RB1</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>Monoclonal de lapin</td></tr><tr><td>AlexaFluor647 Anti-lapin</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>Anticorps secondaire fortement adsorbé par adsorbage croisé, marqué par fluorescence.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Colorant d’ADN fluorescent, intercalant la chromatine.</td></tr><tr><td>Solution de perméabilisation</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0,1 % Triton X-100 en solution saline 50 mM tamponnée Tris, pH 8,0.</td></tr><tr><td>Solution de lavage des plaques</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween-20.</td></tr><tr><td>Solution en bloc</td><td>NA</td><td>NA</td><td>5 % de lait en poudre dans une solution saline tamponnée au Tris et 0,1 % Tween-20. Pour le blocage de la plaque avant l’immuno-coloration et la dilution des anticorps.</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl Community Edition</td><td>ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>R environnement de programmation</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

workflow pour haut-contenu, cellule individuelle quantification des marqueurs fluorescents de data universal microscope, pris en charge par open source software

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Les progrès dans la compréhension des mécanismes de contrôle régissant le comportement des cellules dans les modèles de culture de tissus de mammifères adhérentes sont de plus en plus dépendante des modes d&#39;analyse unicellulaire. Méthodes qui fournissent des données composites reflétant les valeurs moyennes des biomarqueurs de populations de cellules risquent de perdre la dynamique des sous-populations qui reflètent l&#39;hétérogénéité du système biologique étudié. Dans cet esprit, les approches traditionnelles sont remplacées par, ou soutenus avec des formes plus sophistiquées de dosage cellulaire développés pour permettre une évaluation par microscopie à haute teneur. Ces analyses génèrent potentiellement un grand nombre d&#39;images de biomarqueurs fluorescents, ce qui a permis en accompagnant des logiciels propriétaires, permet des mesures multi-paramétriques par cellule. Toutefois, les coûts d&#39;investissement relativement élevés et la surspécialisation de plusieurs de ces dispositifs ont empêché leur accessibilité à de nombreux enquêteurs. Décrit ici est unflux de travail universellement applicable pour la quantification des intensités multiples marqueurs fluorescents provenant de régions sous-cellulaires spécifiques de cellules individuelles appropriées pour une utilisation avec des images de la plupart des microscopes à fluorescence. La clé de ce flux de travail est la mise en œuvre du logiciel Cell Profiler disponible gratuitement 1 à distinguer les cellules individuelles dans ces images, les segmenter en régions subcellulaires définies et livrer l&#39;intensité de marqueur de fluorescence des valeurs spécifiques à ces régions. L&#39;extraction des valeurs individuelles d&#39;intensité de la cellule à partir de données d&#39;image est l&#39;objectif central de ce flux de travail et sera illustrée par l&#39;analyse des données de contrôle à partir d&#39;un écran de siRNA pour G1 régulateurs de points de contrôle dans les cellules humaines adhérentes. Cependant, le flux de travail présenté ici peut être appliquée à l&#39;analyse des données provenant d&#39;autres moyens de perturbation cellulaire (par exemple, les écrans de composés) et d&#39;autres formes de marqueurs cellulaires de fluorescence en fonction et devrait donc être utile pour un large éventail de laboratoires.

Présenté informatique est un workflow flexible permettant multiplexé analyse basée sur l&#39;image de cellules marquées par fluorescence. Le workflow quantifie marqueurs nucléaires et cytoplasmiques et calcule marqueur translocation entre ces compartiments. Des procédures sont prévues pour perturbation de cellules en utilisant siRNA et la méthodologie fiable pour la détection du marqueur par immunofluorescence indirecte dans des formats de 96 puits.

Workflow pour haut-contenu, cellule individuelle quantification des marqueurs fluorescents de Data Universal Microscope, pris en charge par Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

L’objectif général de cette procédure est de mesurer objectivement les réponses de cellules individuelles en quantifiant des intensités spécifiques de marqueurs fluorescents à partir d’images microscopiques. Ceci est accompli en soumettant d’abord des cellules de culture tissulaire adhérentes à l’inactivation génique médiée par l’ARN. Dans un deuxième temps, les cellules sont colorées par fluorescence, puis imagées pour plusieurs marqueurs d’intérêt.Dans la dernière étape, l’expression des marqueurs dans des régions subcellulaires spécifiques est définie algorithmiquement, ce sont des cellules individuelles. En fin de compte, les réponses cellulaires aux signaux biologiques de l’inactivation des gènes peuvent être analysées en mesurant les niveaux d’expression fluorescente des marqueurs d’intérêt et leur translocation subcellulaire. Bien que cette procédure donne un aperçu de la régulation du transit du cycle cellulaire G en réponse aux siRNA.Il peut également être appliqué à des études générant des images cellulaires fluorescentes, à l’étude du transport nucléaire et de l’homéostasie des protéines. Daniel Wek et Car K, boursiers postdoctoraux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure en distribuant 70 microlitres de 200 nanomolaires d’irna, dilués dans les puits appropriés d’une plaque stérile à 96 puits dans une hotte de culture de tissus stériles. Ajoutez ensuite 105 microlitres de lipide de transfection dilué dans 40 volumes de milieu DMEM sans sérum dans chaque puits de sir, puis mélangez la plaque en vibrant doucement à température ambiante, puis après 10 minutes, subdivisez les 175 microlitres résultants en trois réplicats de 50 microlitres par cible dans une plaque opaque traitée par culture tissulaire à 96 puits avec une base transparente.Ensuite, distribuez 8 000 cellules par puits dans 150 microlitres de DMEM avec 10 % de sérum directement sur les complexes lipidiques de 50 microlitres d’irna sans mélanger. Ensuite, scellez la plaque avec une membrane respirante adhésive stérile et placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. 48 heures plus tard, aspirez le support des plaques.Fixez ensuite les cellules dans 100 microlitres de formaldéhyde tampon à 4 % dans une hotte à température ambiante Après 10 minutes, aspirez le fixateur et effectuez trois lavages de 100 microlitres avec du PBS après le dernier lavage. Retirez le PBS et perforez les cellules avec trois cycles d’incubation de solution de perméation de 100 microlitres chacun de 10 minutes à température ambiante sans agitation. Après la dernière incubation, retirez la solution de perméation, puis ajoutez 100 microlitres de solution en bloc par puits pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, aspirez la solution en bloc et sondez les cellules avec 50 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dans les deux semaines suivant le marquage au microscope confocal uc avec un objectif de 20 x pour prendre des images TIFF séparées en échelle de gris de 16 bits dans trois canaux correspondant au colorant ADN, à la GFP et à l’immuno-marquage. Les quatre de Flora capturent de nombreux ensembles d’images ou cadres non superposés pour imager environ 1000 à 2000 cellules par puits. Nommer systématiquement le fichier image avec les informations de métadonnées afin que chaque nom de fichier soit une combinaison unique de nom d’expérience, d’adresse de puits, de numéro de cadre et d’identificateur de canal.Ouvrez ensuite le logiciel de profilage de cellules et cliquez sur Fichier et importer le pipeline. Ensuite, sous À partir d’un fichier, sélectionnez le fichier CP pipeline à trois canaux du fichier pipe, qui contient les instructions nécessaires pour que le logiciel interprète le fichier image Les métadonnées du nom de fichier enregistré Convention Cell Profiler peut maintenant être utilisé pour relier les images, extraire les intensités d’ADN nucléaire et d’anticorps des fichiers, et utiliser le canal GFP pour calculer le rapport entre l’intensité nucléaire et l’intensité du cytoplasme. Pour chaque cellule détectée, cliquez sur le bouton Afficher les paramètres de sortie, puis cliquez sur les dossiers d’entrée et de sortie par défaut.Sélection de l’emplacement des fichiers image pour l’analyse et de la destination des données extraites, respectivement. Ensuite, dans la fenêtre des modules d’analyse, cliquez sur les icônes en forme d’œil appropriées pour observer les fenêtres d’identification des objets primaires et des objets tertiaires pendant l’analyse et cliquez sur analyser les images lorsque l’analyse est terminée. Cliquez sur OK dans la boîte de message et accédez au dossier de sortie par défaut Emplacement, où tous les fichiers de données sont enregistrés sous forme de fichiers de valeurs séparées par des virgules.Pour effectuer l’extraction des données, recherchez le nouveau fichier CSV de noyaux inclus dans la sortie du profileur de cellules, qui contient les données de chaque cellule pour l’intensité des anticorps nucléaires fluorescents, l’intensité de l’ADN nucléaire et les valeurs du rapport GFP CDK deux rapporteurs. Copiez le fichier de script d’impulsion fourni pour le classificateur de marche PL dans le même dossier que le fichier de données CSV des noyaux. Double-cliquez ensuite sur l’icône de Pearl Script.Et lorsque vous y êtes invité, tapez le nom complet du fichier de données suivi d’un nom de fichier CSV DOT pour le fichier dans lequel les cellules doivent être contrôlées et des valeurs de porte pour la fluorescence de l’anticorps et les données déclarantes G FP CDK two. Vérifiez que le fichier nouvellement créé combine les valeurs brutes de test de cellules individuelles du profil de cellule d’origine des données avec les étiquettes de sous-population montrant les performances de chaque cellule de chaque puits par rapport aux deux portes. Ouvrez maintenant le logiciel R Studio pour tracer les données de chaque condition expérimentale à l’aide des étiquettes de sous-population de cellules individuelles en cliquant sur Fichier et en ouvrant le fichier, puis en sélectionnant le point d’analyse fourni : le fichier r.Tapez l’adresse de l’ordinateur du dossier contenant les données contrôlées, y compris la lettre du lecteur et le nom du fichier lui-même. Mettez ensuite en surbrillance les lignes un à 17 dans la fenêtre supérieure gauche de notre studio, puis cliquez sur le bouton Exécuter pour entrer les valeurs seuils des données expérimentales et les détails de l’emplacement du puits. Enfin, mettez en surbrillance les blocs individuels du code restant sous la ligne 17 et cliquez sur le bouton Exécuter pour créer les tracés correspondants.Observez les tracés dans la fenêtre dans le coin inférieur droit de notre studio, puis cliquez sur le bouton d’exportation pour les enregistrer dans une variété de formats. Le flux de travail décrit ici analyse les images du microscope fluorescent pour produire des données brutes sous la forme d’une liste détaillant chaque cellule identifiée et ses valeurs de dosage correspondantes. De nombreuses options existent pour l’analyse de ces données.Par exemple, dans ces graphiques d’histogrammes, les valeurs de dosage pour les cellules traitées avec des ARN de contrôle permettent d’identifier les portes appropriées pour seuilr chaque test. Les seuils de contrôle sont ensuite appliqués à l’aide d’un script d’impulsion pour étiqueter chaque cellule dans les données brutes en fonction du résultat du test. Cette approche de marquage facilite l’évaluation visuelle préliminaire ainsi que l’évaluation automatisée des relations entre les traitements et la distribution en sous-population de très grands ensembles de données cellulaires individuelles.Par exemple, dans cette expérience représentative, trois conditions d’inactivation de l’ARNi ont entraîné des distributions contrastées des cellules par rapport aux portes des deux essais. Les tracés R utilisent les étiquettes pour calculer les distributions en pourcentage des cellules dans chaque quadrant. Les étiquettes permettent également de croiser des mesures fluorescentes supplémentaires avec les données d’analyse.Dans cette expérience, les sous-populations de cellules traitées avec SI CDK six ont été regroupées en fonction de leurs marqueurs de test respectifs et tracées sous forme d’histogrammes de coloration de l’ADN nucléaire. Cette utilisation des étiquettes de données cellulaires révèle la relation entre les deux tests cellulaires et le contenu en ADN des cellules. Lors de l’exécution de cette procédure, il est toujours important de ne pas oublier de tester et d’ajuster les paramètres de segmentation d’image lors de l’utilisation du profileur de cellule.Ceci est particulièrement important lorsque vous utilisez pour la première fois des fichiers image nouveaux ou non testés. D’accord.

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