Workflow pour haut-contenu, cellule individuelle quantification des marqueurs fluorescents de Data Universal Microscope, pris en charge par Open Source Software

L’objectif général de cette procédure est de mesurer objectivement les réponses de cellules individuelles en quantifiant des intensités spécifiques de marqueurs fluorescents à partir d’images microscopiques. Ceci est accompli en soumettant d’abord des cellules de culture tissulaire adhérentes à l’inactivation génique médiée par l’ARN. Dans un deuxième temps, les cellules sont colorées par fluorescence, puis imagées pour plusieurs marqueurs d’intérêt.

Dans la dernière étape, l’expression des marqueurs dans des régions subcellulaires spécifiques est définie algorithmiquement, ce sont des cellules individuelles. En fin de compte, les réponses cellulaires aux signaux biologiques de l’inactivation des gènes peuvent être analysées en mesurant les niveaux d’expression fluorescente des marqueurs d’intérêt et leur translocation subcellulaire. Bien que cette procédure donne un aperçu de la régulation du transit du cycle cellulaire G en réponse aux siRNA.

Il peut également être appliqué à des études générant des images cellulaires fluorescentes, à l’étude du transport nucléaire et de l’homéostasie des protéines. Daniel Wek et Car K, boursiers postdoctoraux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure en distribuant 70 microlitres de 200 nanomolaires d’irna, dilués dans les puits appropriés d’une plaque stérile à 96 puits dans une hotte de culture de tissus stériles. Ajoutez ensuite 105 microlitres de lipide de transfection dilué dans 40 volumes de milieu DMEM sans sérum dans chaque puits de sir, puis mélangez la plaque en vibrant doucement à température ambiante, puis après 10 minutes, subdivisez les 175 microlitres résultants en trois réplicats de 50 microlitres par cible dans une plaque opaque traitée par culture tissulaire à 96 puits avec une base transparente.

Ensuite, distribuez 8 000 cellules par puits dans 150 microlitres de DMEM avec 10 % de sérum directement sur les complexes lipidiques de 50 microlitres d’irna sans mélanger. Ensuite, scellez la plaque avec une membrane respirante adhésive stérile et placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. 48 heures plus tard, aspirez le support des plaques.

Fixez ensuite les cellules dans 100 microlitres de formaldéhyde tampon à 4 % dans une hotte à température ambiante Après 10 minutes, aspirez le fixateur et effectuez trois lavages de 100 microlitres avec du PBS après le dernier lavage. Retirez le PBS et perforez les cellules avec trois cycles d’incubation de solution de perméation de 100 microlitres chacun de 10 minutes à température ambiante sans agitation. Après la dernière incubation, retirez la solution de perméation, puis ajoutez 100 microlitres de solution en bloc par puits pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, aspirez la solution en bloc et sondez les cellules avec 50 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dans les deux semaines suivant le marquage au microscope confocal uc avec un objectif de 20 x pour prendre des images TIFF séparées en échelle de gris de 16 bits dans trois canaux correspondant au colorant ADN, à la GFP et à l’immuno-marquage. Les quatre de Flora capturent de nombreux ensembles d’images ou cadres non superposés pour imager environ 1000 à 2000 cellules par puits. Nommer systématiquement le fichier image avec les informations de métadonnées afin que chaque nom de fichier soit une combinaison unique de nom d’expérience, d’adresse de puits, de numéro de cadre et d’identificateur de canal.

Ouvrez ensuite le logiciel de profilage de cellules et cliquez sur Fichier et importer le pipeline. Ensuite, sous À partir d’un fichier, sélectionnez le fichier CP pipeline à trois canaux du fichier pipe, qui contient les instructions nécessaires pour que le logiciel interprète le fichier image Les métadonnées du nom de fichier enregistré Convention Cell Profiler peut maintenant être utilisé pour relier les images, extraire les intensités d’ADN nucléaire et d’anticorps des fichiers, et utiliser le canal GFP pour calculer le rapport entre l’intensité nucléaire et l’intensité du cytoplasme. Pour chaque cellule détectée, cliquez sur le bouton Afficher les paramètres de sortie, puis cliquez sur les dossiers d’entrée et de sortie par défaut.

Sélection de l’emplacement des fichiers image pour l’analyse et de la destination des données extraites, respectivement. Ensuite, dans la fenêtre des modules d’analyse, cliquez sur les icônes en forme d’œil appropriées pour observer les fenêtres d’identification des objets primaires et des objets tertiaires pendant l’analyse et cliquez sur analyser les images lorsque l’analyse est terminée. Cliquez sur OK dans la boîte de message et accédez au dossier de sortie par défaut Emplacement, où tous les fichiers de données sont enregistrés sous forme de fichiers de valeurs séparées par des virgules.

Pour effectuer l’extraction des données, recherchez le nouveau fichier CSV de noyaux inclus dans la sortie du profileur de cellules, qui contient les données de chaque cellule pour l’intensité des anticorps nucléaires fluorescents, l’intensité de l’ADN nucléaire et les valeurs du rapport GFP CDK deux rapporteurs. Copiez le fichier de script d’impulsion fourni pour le classificateur de marche PL dans le même dossier que le fichier de données CSV des noyaux. Double-cliquez ensuite sur l’icône de Pearl Script.

Et lorsque vous y êtes invité, tapez le nom complet du fichier de données suivi d’un nom de fichier CSV DOT pour le fichier dans lequel les cellules doivent être contrôlées et des valeurs de porte pour la fluorescence de l’anticorps et les données déclarantes G FP CDK two. Vérifiez que le fichier nouvellement créé combine les valeurs brutes de test de cellules individuelles du profil de cellule d’origine des données avec les étiquettes de sous-population montrant les performances de chaque cellule de chaque puits par rapport aux deux portes. Ouvrez maintenant le logiciel R Studio pour tracer les données de chaque condition expérimentale à l’aide des étiquettes de sous-population de cellules individuelles en cliquant sur Fichier et en ouvrant le fichier, puis en sélectionnant le point d’analyse fourni : le fichier r.

Tapez l’adresse de l’ordinateur du dossier contenant les données contrôlées, y compris la lettre du lecteur et le nom du fichier lui-même. Mettez ensuite en surbrillance les lignes un à 17 dans la fenêtre supérieure gauche de notre studio, puis cliquez sur le bouton Exécuter pour entrer les valeurs seuils des données expérimentales et les détails de l’emplacement du puits. Enfin, mettez en surbrillance les blocs individuels du code restant sous la ligne 17 et cliquez sur le bouton Exécuter pour créer les tracés correspondants.

Observez les tracés dans la fenêtre dans le coin inférieur droit de notre studio, puis cliquez sur le bouton d’exportation pour les enregistrer dans une variété de formats. Le flux de travail décrit ici analyse les images du microscope fluorescent pour produire des données brutes sous la forme d’une liste détaillant chaque cellule identifiée et ses valeurs de dosage correspondantes. De nombreuses options existent pour l’analyse de ces données.

Par exemple, dans ces graphiques d’histogrammes, les valeurs de dosage pour les cellules traitées avec des ARN de contrôle permettent d’identifier les portes appropriées pour seuilr chaque test. Les seuils de contrôle sont ensuite appliqués à l’aide d’un script d’impulsion pour étiqueter chaque cellule dans les données brutes en fonction du résultat du test. Cette approche de marquage facilite l’évaluation visuelle préliminaire ainsi que l’évaluation automatisée des relations entre les traitements et la distribution en sous-population de très grands ensembles de données cellulaires individuelles.

Par exemple, dans cette expérience représentative, trois conditions d’inactivation de l’ARNi ont entraîné des distributions contrastées des cellules par rapport aux portes des deux essais. Les tracés R utilisent les étiquettes pour calculer les distributions en pourcentage des cellules dans chaque quadrant. Les étiquettes permettent également de croiser des mesures fluorescentes supplémentaires avec les données d’analyse.

Dans cette expérience, les sous-populations de cellules traitées avec SI CDK six ont été regroupées en fonction de leurs marqueurs de test respectifs et tracées sous forme d’histogrammes de coloration de l’ADN nucléaire. Cette utilisation des étiquettes de données cellulaires révèle la relation entre les deux tests cellulaires et le contenu en ADN des cellules. Lors de l’exécution de cette procédure, il est toujours important de ne pas oublier de tester et d’ajuster les paramètres de segmentation d’image lors de l’utilisation du profileur de cellule.

Ceci est particulièrement important lorsque vous utilisez pour la première fois des fichiers image nouveaux ou non testés. D’accord.