Protein Purification méthode sans la détermination de l'affinité de liaison par thermophorèse Microscale

L'objectif général de cette procédure est de déterminer l'affinité de liaison d'une interaction entre une protéine et un ligand sans purifier la protéine à partir d'un lysat cellulaire. Cela est réalisé en exprimant d'abord la protéine d'intérêt fusionnée à la GFP dans une lignée cellulaire adhérente quelconque. Après préparation du lysat cellulaire et des dilutions de ligand, des mélanges de lysat cellulaire et de ligand sont préparés puis chargés dans des capillaires.

Ensuite, la thermorésistance de la protéine fusionnée à la GFP en présence de concentrations variables de ligand est mesurée. La dernière étape consiste en l'analyse des données de thermophorèse à l'échelle microscopique, ou MST. En définitive, la thermorésistance à l'échelle microscopique est utilisée pour déterminer les affinités de liaison des interactions entre les protéines fusionnées à la GFP et divers ligands.

Le principal avantage de cette technique par rapport à des méthodes existantes telles que le titrage, la calorimétrie ou la résonance plasmonique de surface est qu'elle évite la purification des protéines, simplifiant ainsi de manière significative et accélérant la caractérisation quantitative des interactions binaires. Cette méthode présente des avantages considérables lorsqu'on travaille avec des protéines difficiles à exprimer et à purifier, telles que les protéines membranaires et les facteurs de transcription. L'un des plus grands avantages de la thermophorèse à l'échelle microscopique est qu'elle fonctionne dans une grande variété de tampons et tolère la présence de détergents et de micelles dans le système. Karen Stefka, biologiste de mon laboratoire, démontrera la technique. Pour commencer, lavez brièvement les cellules avec du tampon phosphate salin glacé, ou PBS, en utilisant 10 millilitres de tampon par flacon T 75.

Garder les cellules sur de la glace pendant cinq minutes ou jusqu'à ce qu'elles commencent à se détacher du flacon. Racler les cellules avec un grattoir à cellules pour les détacher si nécessaire. Résuspendre les cellules dans 10 millilitres de PBS glacé et transférer dans un tube à centrifuger conique de 14 millilitres prérefroidi.

Centrifuger les cellules à 400 à 600 G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 200 microlitres de tampon de lyse glacé. Transférer la suspension dans un tube einor de 1,5 millilitre prérefroidi pour l'extraction des protéines cytosoliques.

Placer les cellules sur de la glace afin de minimiser la surchauffe locale et lyser les cellules à l’aide de trois impulsions de dix secondes de sonication à une amplitude de 30 %. À l’aide d’une sonde prérefroidie de deux à trois millimètres, maintenir la sonde sous la surface du liquide pour limiter la formation d’écume. Omettre cette étape lorsqu’un tampon contenant un détergent est utilisé, et incuber sur de la glace pendant 30 minutes.

Au lieu de cela, ajustez la solution de lyssat pour obtenir une concentration physiologique en sel de 100 millimolaire de chlorure de sodium si nécessaire, à partir d'une solution mère de cinq molaire de chlorure de sodium. Enfin, récupérez les lyssats par centrifugation à environ 25 000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Sélectionnez la source d'excitation à diode électroluminescente ou LED dont la longueur d'onde est égale à 470 nanomètres sur l'instrument MST.

Chargez les capillaires avec un extrait cellulaire dilué deux et dix fois dans le tampon MST et placez-les dans l'instrument MST. Effectuez l'opération de recherche des capillaires à l'aide du logiciel de contrôle de l'instrument MST. La plage de fluorescence optimale dans le lysat dilué se situe entre 400 et 1500 unités de fluorescence.

Passez à la détermination de la plage de concentration optimale du ligand, comme décrite dans le protocole écrit. Placez une rack à tubes contenant le nombre nécessaire de tubes de centrifugation basse liaison de 0,5 millilitre sur de la glace, pipetez 25 microlitres de tampon MST au fond de chaque tube, ajoutez 25 microlitres de la solution mère de ligand dans le premier tube, puis effectuez une dilution sérielle par deux du ligand en utilisant les autres tubes. Conservez la rack contenant les échantillons de ligand sur de la glace.

Calculer la dilution du lysat cellulaire afin d'obtenir le niveau optimal de la protéine cible fluorescente dans les réactions de liaison. La concentration finale en protéine doit être proche de la constante de dissociation attendue ou inférieure, et doit être ajustée pour obtenir le nombre nécessaire de comptes de fluorescence. Dans la solution finale, procéder à la dilution du lysat cellulaire avec le tampon MST.

Placer des tubes de faible affinité de 0,5 millilitre dans le porte-tubes en face des tubes contenant les échantillons de dilution sériée du ligand. Ajouter soigneusement 15 microlitres du lysat cellulaire au fond de chaque tube. Éviter de toucher les parois des tubes afin de prévenir la perte d'échantillon.

Ajoutez 15 microlitres de l'échantillon de ligand à la concentration la plus élevée dans le tube correspondant. Numéro un, avec le lysat cellulaire. Mélangez bien et changez la pointe de pipette.

Répétez cette étape avec le reste des tubes, à l'exception du dernier, qui ne doit contenir aucun ligand. Ajoutez 15 microlitres de tampon MST au dernier tube et mélangez. Remplissez environ les deux tiers de la première capillarité avec le mélange de liaison provenant du tube numéro un.

Inclinez-le pour déplacer la solution vers le centre et placez le capillaire sur le plateau à capillaires à la position numéro un. Répétez cette étape avec les autres capillaires. Les extrémités des capillaires peuvent être bouchées avec de la cire pour des expériences plus longues.

Placer le plateau à l'intérieur de l'instrument de MST et fermer la porte de l'appareil. Ensuite, sélectionner la source d'excitation LED dont la longueur d'onde est égale à 470 nanomètres. Sur l'instrument de MST, exécuter la commande de recherche des capillaires afin que l'appareil détecte les positions exactes des capillaires et mesure la fluorescence des échantillons en fonction de l'intensité du signal fluorescent.

Réglez la puissance de la LED pour l'amener dans l'intervalle de 400 à 1500 unités. Cliquez sur le bouton de démarrage pour effectuer l'expérience de Thermo Résistance. Plus d'une puissance de laser infrarouge peut être choisie pour l'expérience.

Pour déterminer le gradient de température optimal pour le système particulier, il faut de 10 à 12 minutes pour exécuter un ensemble de 16 capillaires. Recueillez les données à partir de deux à trois répétitions pour le même ensemble de capillaires afin de garantir la reproductibilité des mesures. Pour commencer l'analyse des données, ouvrez le logiciel d'analyse et chargez le dossier du projet.

Dans le visualiseur d'exécution des informations apparu, sélectionnez les courbes thermorétiques recueillies à une puissance spécifique du laser infrarouge. Une option permettait d'ouvrir simultanément toutes les traces thermorétiques recueillies dans diverses conditions, puis de choisir les courbes à analyser en les activant ou désactivant. Dans la fenêtre du graphique des points d'évaluation, sélectionnez la thermorésis ou la thermophorèse avec les lignes bleue et rouge représentant le saut de température.

Définissez deux régions des courbes expérimentales qui sont sélectionnées manuellement pour l'analyse par le logiciel. Assurez-vous que les lignes bleue et rouge sont correctement positionnées afin d'obtenir la variation maximale de Thermo Resis. Pour obtenir les points moyens avec les écarts types, sélectionnez l'option utiliser la moyenne ou distinguez les essais pour des analyses séparées.

Pour tracer un ajustement de la constante de dissociation, sélectionnez l'option utiliser la moyenne, saisissez et fixez la valeur de concentration de la molécule marquée, puis ajustez la courbe. La constante de dissociation de liaison, ou valeur KD, accompagnée de son écart type, apparaît dans une fenêtre contextuelle d'informations. Enregistrez les données d'ajustement moyennes dans un fichier texte et transférez-les vers Excel.Heck.

Des cellules 293 exprimant STAT3-GFP ont été utilisées comme source de statine trois marquée de manière fluorescente. Pour un test de liaison à l'ADN, la liaison d'oligonucléotides fortement chargés a entraîné des changements importants de la mobilité de STAT trois. Dans le gradient de température.

Le signal thermorétic est tracé en fonction de la concentration en oligonucléotides. Chaque point de données représente la moyenne de trois mesures. Un logiciel d'analyse nanotemporelle a été utilisé pour ajuster les courbes et déterminer les valeurs apparentes de KD.

Les constantes de dissociation apparentes étaient de 37,9 ± 1,0 micromolaire pour la liaison au motif gas, et de 23,3 ± 0,6 micromolaire pour la liaison à l'oligonucléotide riche en A/T s+100. De manière surprenante, les séquences s+100 présentaient une liaison légèrement plus forte que gas. Sur trois répétitions des mesures, la substitution d'une A par une G entraînait une diminution spectaculaire de l'affinité du mutant s+100 un.

Bien que le mutant s plus 100 deux n'ait montré aucune liaison détectable, confirmant ainsi la liaison sélective de la séquence du STAT trois à s plus 100, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures une fois maîtrisée, à condition d'être effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les conditions optimales d'extraction des protéines membranaires varient selon les protéines et nécessitent généralement une optimisation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer l'affinité de liaison d'une protéine à un élément cis-régulateur sans avoir à purifier la protéine à partir du lysat cellulaire.