Name: Protein Purification méthode sans la détermination de laffinité de liaison par thermophorèse Microscale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez comment déterminer l'affinité de liaison protéine-ligand par thermophorèse microscale (MST) directement à partir de lysats cellulaires sans purification. Cette méthode utilise des protéines fusionnées à la GFP pour des analyses rapides et fiables.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été partiellement financé par le Programme de recherche intra-muros des NIH, l&#39;Institut national du cancer, Centre de recherche sur le cancer; accord de recherche collaborative entre le NCI et Calidris Therapeutics; American Cancer Society subvention IRG 97-152-17 à OT, et les fonds fédéraux de l&#39; National Cancer Institute, NIH, sous HHSN26120080001E du contrat.

1. Préparation de lysat cellulaire Ce protocole est destiné aux cellules adhérentes exprimant une protéine GFP fusionnée. Nombre de cellules nécessaire peut varier entre un minimum de 10 6 à moins de 20 x 10 6 cellules, en fonction du niveau d&#39;expression de la protéine. Par exemple, lysat de cellules HEK surexprimant GFP-STAT3 a été préparé par le traitement des cellules cultivées dans 10 flacons T75 à près de 70% de confluence avec le tampon de lyse 1 ml. Cependant, ce lysat devait être dilué 150 fois pour fournir un niveau optimal de fluorescence pour l&#39;expérience MST. protocole de lyse cellulaire dépend fortement des propriétés et la localisation intracellulaire de la protéine à l&#39;étude. Si vous utilisez des détergents n&#39;est pas souhaitable en raison de l&#39;instabilité des protéines, ultrasons décrit ci-dessous, pourrait être le meilleur choix. Différents additifs peuvent être ajoutés à la mémoire tampon de lyse pour éviter les réactions de modification de protéines: EDTA empêche la phosphorylation, le vanadate de sodium inhibe protéines phosphatases de tyrosine, de sorte quefluorure de sodium est un inhibiteur de Ser / Thr phosphatases. <ol><li> Préparer un tampon de lyse. Pour à extraire faciles protéines cytoplasmiques la composition suivante fonctionne bien: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, et un inhibiteur de protéase cocktail diluées 100 fois (Sigma-Aldrich P2714, composé de 2 mM AEBSF, 0,3 um aprotinine, 130 uM bestatine, 1 mM EDTA, 14 pm E-64, 1 uM leupeptine). Sinon, pour les protéines moins solubles, on peut utiliser un tampon RIPA commercial avec les inhibiteurs de protéase cocktail et des détergents non dénaturants. Gardez le tampon sur la glace. </li><li> Laver les cellules brièvement avec PBS glacé avec 10 ml de tampon par flacon T75. Gardez les cellules sur la glace pendant 5 min ou jusqu&#39;à ce que les cellules commencent à se détacher du flacon. Grattez les cellules avec un grattoir à cellules à se détacher si nécessaire. </li><li> Remettre les cellules dans 10 ml PBS glacé et transférer dans un tube à centrifuger pré-refroidi 14 ml de fond rond. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 400-600 xg à 4 ° C pendant 5 min. Combiner des cellules provenant de plusieurs flacons à ce point if nécessaire. </li><li> Retirer PBS surnageant et remettre le culot dans 200 ul de tampon de lyse glacé, le transfert de suspension à un pré refroidie 1,5 ml tube Eppendorf. </li><li> Gardez les cellules sur la glace pour réduire la surchauffe locale. Lyse des cellules avec 3x 10 sec impulsions de sonication à 30% d&#39;amplitude, à l&#39;aide d&#39;un 2-3 mm de pointe pré-réfrigérés. Gardez la pointe en dessous de la surface de minimiser l&#39;écume. Omettre cette étape en utilisant des produits contenant du tampon et incuber sur de la glace pendant 30 min à la place. </li><li> Corrigez la solution de lysat pour contenir la concentration de sérum physiologique (NaCl 100 mM), si nécessaire en utilisant 5 M de NaCl. </li><li> Recueillir lysats par centrifugation à environ 26.000 xg à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Déterminer la dilution du lysat optimal (tel que décrit dans la section 3 ci-dessous) et la quantité de lysat nécessaire pour une titration (généralement autour de 300 pl de lysat pré-dilué). </li><li> Aliquote du lysat et stocker à température appropriée pour la protéine à l&#39;étude (-80 ° C, dans la plupart des cas). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. MST sélection de la mémoire tampon et préparation <ol><li> Depuis les interactions protéine-ligand sont tributaires des conditions tampons, la composition du tampon MST est choisie en fonction des propriétés d&#39;un système particulier. Il est généralement avantageux de tester au moins deux tampons différents. </li><li> Préparer 2 tampons MST 5x. Nous avons eu de bonnes expériences avec ces deux compositions: HEPES (250 mM d&#39;HEPES, pH 7,4, MgCl2 25 mM, NaCl 500 mM, 0,25% de NP-40) et Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, NaCl 750 mM; 50 mM de MgCl2, 0,05% de Tween-20). Ajout de BSA (5% dans le mélange liant final) peut aider à prévenir l&#39;adhérence des protéines à des tubes en plastique et en verre capillaires. NaN3 (0,5 mM) peut également être prévu pour empêcher la croissance de micro-organismes. </li></ol> 3. Détermination de la dilution de lysat optimale <ol><li> Sélectionnez la source d&#39;excitation LED avec la longueur d&#39;onde λ = 470 nm sur l&#39;instrument MST. </li><li> Chargez capillaires avec la CEll extrait dilué 2 et 10x avec un tampon MST. </li><li> Exécutez l&#39;opération &quot;Trouvez Capillaires&quot; sur le logiciel de contrôle d&#39;instrument MST. La plage optimale de fluorescence dans lysat dilué est de 400 à 1500 unités de fluorescence. </li></ol> 4. Détermination du ligand Optimal gamme de concentration <ol><li> La plus forte concentration du ligand doit être au moins 20 fois supérieure à la constante de dissociation attendue. </li><li> La concentration de ligand plus faible doit être inférieure à la concentration molaire de la protéine fluorescente. </li></ol> Reportez-vous à l&#39;outil de recherche Technologies de concentration NanoTemper pour l&#39;estimation de la gamme de concentration de ligand. 5. Préparation de lysat cellulaire et les dilutions de ligands <ol><li> Placer une grille de tube avec un nombre nécessaire (généralement 10-16) de 0,5 ml tubes à centrifuger de LoBind sur la glace. Pipette 25 ul de tampon MST au fond de chaque tube. Ajouter 25 pl de la solution mère de ligand à la première baignoiree (n ​​° 1, un ligand plus forte concentration) et d&#39;effectuer en série deux fois la dilution du ligand en utilisant le reste des tubes. Gardez le rack avec des échantillons de ligands sur la glace. </li><li> cellule de dégel lysat lentement sur la glace. </li><li> Diluer lysat cellulaire avec un tampon MST à fournir le niveau optimal de la protéine cible fluorescente dans les réactions de liaison. Concentration de protéine finale devrait être proche de prévue K D ou inférieur. Il doit être ajusté pour obtenir le numéro de compte nécessaire de fluorescence dans la solution finale. Pour la détermination de la GFP-STAT3 concentration dans le lysat, l&#39;instrument a été calibré avec une aide de fluorescéine. La concentration molaire de la GFP dans le lysat a été déterminée en utilisant respectivement le rapport de la fluorescéine et EGFP rendements quantiques, 0,85 et 0,61 15. </li></ol> 6. Microscale thermophorèse Etudes de liaison <ol><li> Sélectionnez la source d&#39;excitation LED avec λ = 470 nm sur l&#39;instrument MST. </li><li> Placer les tubes de 0,5 ml LoBind dans la tube porte en face de tubes avec des échantillons de dilution en série de ligands. Ajouter avec précaution 15 pl du lysat de cellules au fond de chaque tube. Essayez de ne pas toucher les parois du tube pour éviter la perte de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 15 ml de l&#39;échantillon de ligand avec la plus forte concentration (n ° 1) dans le tube correspondant n ° 1 avec le lysat cellulaire. Mélangez bien et changer une pointe de pipette. Répéter cette étape avec le reste des tubes à l&#39;exception de la dernière, qui doit contenir aucun ligand. </li><li> Ajouter 15 ul de tampon MST au dernier tube et bien mélanger. </li><li> Remplir environ 2/3 du premier capillaire avec le mélange de liaison de tubes n ° 1, inclinaison de se déplacer de la solution vers le centre, et de placer le tube capillaire sur le plateau capillaire à la position n ° 1 (la position la plus proche de l&#39;ouverture du bac) . Répétez cette étape avec le reste capillaires. Extrémités capillaires peuvent être branchés à la cire pendant de longues expériences. </li><li> Placez le bac à l&#39;intérieur de l&#39;instrument MST et fermer la porte de l&#39;appareil. </li><li> Effectuer &quot;Trouvez capillaires&quot;commande de laisser l&#39;instrument trouver les positions exactes des capillaires et mesurer la fluorescence des échantillons. </li><li> Sur la base de l&#39;intensité du signal de fluorescence, régler la puissance LED (10-100%) pour le mettre en 400-1,500 unités intervalle. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Démarrer&quot; pour réaliser l&#39;expérience de thermophorèse. Plus d&#39;une énergie laser infrarouge peut être choisie pour l&#39;expérience, afin de trouver le gradient de température optimale pour le système particulier. Collecter des données 2-3 pistes pour le même ensemble de capillaires afin d&#39;assurer la reproductibilité des mesures. Il faut 10-12 minutes pour exécuter une série de 16 capillaires. </li></ol> 7. Micro-analyse des données de thermophorèse <ol><li> Ouvrez le logiciel d&#39;analyse. </li><li> Chargez le dossier du projet. Dans les informations Run Viewer apparu sélectionner collectées à une puissance laser IR spécifiques courbes thermophorétiques. Il ya une option d&#39;ouvrir toutes les traces thermophorétiques recueillies dans diverses conditions telles que la puissance du laser IR, LED peurs, température, concentration, etc. à la fois, puis en choisissant toutes les courbes d&#39;analyse par les allumer et éteindre (cliquez sur le nom de l&#39;expérience). </li><li> Dans la fenêtre graphique des points d&#39;évaluation, sélectionnez le thermophorèse ou thermophorèse avec T-jump. Veiller à ce que les lignes bleues et rouges sont correctement positionnés. Pour obtenir les points moyens des écarts types, sélectionner &quot;Utiliser moyenne» ou «Distinguer tourne&quot; pour analyses différentes. </li><li> Pour tracer une forme constante de dissociation, sélectionner &quot;Utiliser moyenne&quot;, entrez et fixer la valeur de la concentration en molécule marquée (cochez la case «concentration» dans le menu de la fenêtre en forme), et ajuster la courbe. La valeur K D avec son écart-type apparaît dans une dénonciation distincte fenêtre pop-up. Pour tracer un ajustement par la méthode Hill, sélectionnez &quot;moyenne&quot;, méthode Hill, puis ajuster la courbe. La valeur d&#39;affinité EC 50 avec son écart-type est indiqué dans ce cas. La caractéristique de K D ou Hill &quot;frontière&quot; peut également être utilisé lorsque la saturationdans un état lié n&#39;est pas atteint. </li><li> Sauvegarder les données d&#39;ajustement moyens dans un fichier texte et transférer vers Excel. </li><li> Terrain F norme (fluorescence normalisée), AF norme (différence de fluorescence normalisée si différentes expériences sont comparées), ou fraction liée (voir formule ci-dessous) en fonction de la concentration en molécule non marquée (titré). </li></ol> Fraction liée (fraction de molécules dans un complexe) = (Therm (C) non lié) / (lié non lié), où Therm (C) est thermophorèse mesuré la concentration C, liée est thermophorèse pour l&#39;état non lié (lorsque les molécules sont pas dans un complexe), et lié est thermophorèse pour l&#39;état complètement lié.

<ol><li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li>
<li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li>
<li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+assays+at+equilibrium%3A+validation+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li>
<li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li>
<li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-protein+binding%3A+a+critical+review+of+analytical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li>
<li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science%3A+a+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li>
<li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li>
<li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein%3A+nucleic+acid+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100(2010).</li>
<li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK-STAT+pathway+at+twenty%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li>
<li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li>
<li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li>
<li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li>
<li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li>
<li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents. Le contenu de cette publication ne reflètent pas nécessairement les vues ou la politique du Département des services de santé et humains, ni mention des noms commerciaux, des produits commerciaux ou des organisations n&#39;implique pas l&#39;approbation par le gouvernement américain.

expression et purification de protéines est une étape laborieuse et coûteuse, ce qui est, cependant, nécessaire pour la détermination de K D interactions par la méthode la plus couramment utilisée. Application des MST permet d&#39;éviter la purification de protéines ce qui simplifie considérablement l&#39;accélération et la caractérisation quantitative des interactions. Il présente des avantages particulièrement importants dans le cas de difficile à exprimer et purifier des protéines telles que des protéines ...

Caractérisation quantitative de l&#39;affinité des interactions intermoléculaires est important dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale. Reliure constante de dissociation (K D) est essentiel non seulement dans la découverte de médicaments, mais est également un paramètre important dans la caractérisation d&#39;une interaction binaire dans un système biologique. Méthodes biochimiques utilisées pour la détection des interactions protéine-protéine, comme immunoprécipitation et de la levure de deux écrans hybrides, ne nous informent pas sur la façon dont ces interactions sont serrés, tout en affinité définit si ce complexe particulier existe dans des conditions données in vivo. En processus de découverte de médicaments, le développement de test de liaison est l&#39;un des nécessaire et fréquemment étapes les plus fastidieuses. La plupart des méthodes couramment utilisées pour la détermination K D incluent la polarisation de fluorescence, 1 surface technologie résonance de plasmon (SPR), 2 radioligand contraignant, 3 isotherme calorimétrie de titration, 4 Equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltration (UF), 5 et ultracentrifugation (UC). 6 Chacun d&#39;entre eux nécessitent des quantités importantes de protéine cible purifiée. Thermophorèse Microscale (MST) est un procédé en plein développement qui détecte un mouvement dirigé de molécules dans un gradient de température microscopique. Toute modification de la couche d&#39;hydratation des biomolécules entraînent un changement relatif du mouvement le long du gradient de température. 7 MST est utilisé pour déterminer les affinités de liaison et a été appliquée pour l&#39;étude de la liaison du ligand à des protéines marquées par fluorescence ou ligands fluorescents pour une protéine cible. 8, 9 MST permet de mesurer les interactions directement en solution sans la nécessité d&#39;immobilisation sur une surface (immobilisation sans technologie). Pratiquement, toute liaison est accompagnée d&#39;un changement dans le signal MST, même si la taille du changement diffère d&#39;un système à façon significative. Pour la détection de mouvement de la molécule par MST, ils doivent être fluorescentnt. Cette limitation majeure de la méthode peut être transformé en un avantage. Si une protéine est exprimée comme une fusion de la GFP dans tout système, il sera la seule molécule fluorescente et peut donc être étudié sans les isoler du lysat cellulaire ou un système d&#39;expression acellulaire. Génération de lysats de cellules qui permettent de conditions contraignantes avec le minimum d&#39;artefact est le défi majeur. Nous décrivons ici un protocole de préparation de lysat cellulaire et l&#39;expérimentation MST qui peut être utilisé pour de nombreuses protéines solubles et membranaires. Protéines STAT sont latents facteurs de transcription cytoplasmiques activés par phosphorylation sur tyrosine en réponse à des signaux extracellulaires et sont impliqués dans de nombreux processus biologiques, y compris l&#39;immunité, l&#39;hématopoïèse, l&#39;inflammation et le développement. 10 Chez les mammifères, la famille STAT se compose de STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B et 6. Toutes les stats activés sont connus pour se lier à la même séquence d&#39;ADN, dite motif de GAZ, IFN-gamma activé séquence. Toutefois, le transcriptionnel effets de différentes stats sont très différents. 11 En dépit de l&#39;implication dans de nombreux processus pathologiques et des études approfondies produisant plus de 17.000 publications, le K D d&#39;interactions STAT avec différentes séquences d&#39;ADN n&#39;ont pas été déterminées. Seulement affinité relative des différentes variantes de stats pour motif de gaz a été caractérisé. 11 Difficultés d&#39;expression et purification des protéines sont les principaux obstacles à la caractérisation de sélectivité de liaison de l&#39;ADN stats. Bien que la majorité des études se sont concentrées sur le rôle des stats &quot;activés&quot;, qui est devenu synonyme de facteur de transcription Tyr phosphorylée, le rôle de STATS non phosphorylée (U-STAT) dans la régulation de la transcription émerge rapidement. 12 Cependant, ces mécanismes sont encore mal compris, et il était difficile de savoir si U-stats lie effectivement à l&#39;ADN ou d&#39;agir à travers des interactions avec d&#39;autres facteurs de transcription. Nous avons récemment montré que U-STAT3 peut se lier à l&#39;ADN séquentielleCES différente de motifs de gaz avec une affinité encore plus élevé 13. L&#39;découverte a des implications importantes pour notre compréhension des fonctions biologiques de cette protéine importante. Nous avons appliqué thermophorèse microscopique afin de déterminer les affinités relatives de STAT3 au gaz et au riche oligonucléotide S +100 (Figure 4). Protocole pratiquement identique a été utilisée pour la détermination de K D pour la liaison d&#39;un ligand STAT3 différent, un inhibiteur de lipopeptides. 14 Aucune liaison pour un facteur de transcription liée, GFP-STAT1 qui a été utilisé comme contrôle négatif a pu être détecté confirmant ainsi la sélectivité d&#39;interaction. 14

<table><tbody><tr><td>Tampon RIPA</td><td>Millipore</td><td>20-188</td> Les <td>tampons d’autres fabricants fonctionnent également Cocktail d’inhibiteurs</td></tr><tr>de<td>protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>G008</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115 Plateau capillaire</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>T001</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115 Traité standard Capillaires</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>K002</td><td></td></tr><tr><td>NT Logiciel de contrôle</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>2.0.2.29</td><td></td></tr><tr><td>NT Logiciel d’analyse</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>1.4.27</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée de table</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Autres centrifugeuses réfrigérées à microtubes fournissant </td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431064</td><td></td></tr></tbody></table>

protein purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse microscale

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Caractérisation quantitative des interactions protéine est essentielle dans pratiquement tous les domaines des sciences de la vie, en particulier la découverte de médicaments. La plupart des méthodes actuellement disponibles de détermination K D nécessitent un accès à la protéine d&#39;intérêt, la production de ce qui peut être fastidieux et coûteux purifiée. Nous avons mis au point un protocole qui permet de déterminer l&#39;affinité de liaison par thermophorèse microscopique (MST) sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le procédé implique une surexpression de la protéine GFP-condensé et la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes. Application de la méthode de STAT3-GFP exprimé de manière transitoire dans les cellules HEK293 ont permis de déterminer pour la première fois l&#39;affinité du facteur de transcription bien étudiée pour des oligonucléotides avec des séquences différentes. Le protocole est simple et peut avoir une variété d&#39;applications pour l&#39;étude des interactions des protéines avec de petites molécules, les peptides, ADN, ARN, et proteins.

Mesure de l&#39;affinité de non-phosphorylée protéine STAT3 liaison à oligonucléotides. Cellules HEK293 exprimant STAT3-GFP ont été utilisés comme source d&#39;marqué par fluorescence STAT3 pour dosage de liaison ADN. lysats cellulaires ont été préparés en utilisant un tampon RIPA (20x10 6 cellules / ml). Pour les études de liaison, les lysats ont été dilués 150x avec MST tampon liaison à l&#39;ADN pour assurer le niveau optimal de la protéine fluorescente dans la ré...

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l&#39;affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer l'affinité de liaison d'une interaction entre une protéine et un ligand sans purifier la protéine à partir d'un lysat cellulaire. Cela est réalisé en exprimant d'abord la protéine d'intérêt fusionnée à la GFP dans une lignée cellulaire adhérente quelconque. Après préparation du lysat cellulaire et des dilutions de ligand, des mélanges de lysat cellulaire et de ligand sont préparés puis chargés dans des capillaires.Ensuite, la thermorésistance de la protéine fusionnée à la GFP en présence de concentrations variables de ligand est mesurée. La dernière étape consiste en l'analyse des données de thermophorèse à l'échelle microscopique, ou MST. En définitive, la thermorésistance à l'échelle microscopique est utilisée pour déterminer les affinités de liaison des interactions entre les protéines fusionnées à la GFP et divers ligands.Le principal avantage de cette technique par rapport à des méthodes existantes telles que le titrage, la calorimétrie ou la résonance plasmonique de surface est qu'elle évite la purification des protéines, simplifiant ainsi de manière significative et accélérant la caractérisation quantitative des interac

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

ITC est un outil puissant pour étudier la liaison d'un ligand à son hôte. Dans les systèmes complexes cependant, plusieurs modèles peuvent ajuster les données aussi bien. La méthode décrite ici fournit un moyen d'élucider le modèle approprié contraignante pour les systèmes complexes et d'extraire les paramètres thermodynamiques correspondants.

Collecte variable de concentration isotherme ensembles de données de titrage calorimétrique afin de déterminer des mécanismes de liaison

Un protocole général pour l'utilisation de la calorimétrie de titration isotherme pour surveiller la thermodynamique contraignante pour les systèmes biologiques avec les modérés affinités de liaison est présenté.

Calorimétrie titration isotherme pour Mesure macromolécules-ligand d&#39;affinité

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de chromatographie d’affinité au nickel pour purifier les enzymes pyrophosphokinases marquées à l’histidine des bactéries Clostridium difficile.

Purification de protéines basée sur la chromatographie d’affinité du nickel : une technique pour purifier des protéines recombinantes marquées à la polyhistidine à partir d’un lysat de cellules bactériennes

Cette vidéo démontre la thermophorèse à l’échelle microscopique pour l’étude de l’interaction protéine-lipide. Le test détecte l’interaction entre les molécules en quantifiant le mouvement thermophorétique des protéines marquées par fluorescence en réponse à un gradient de température. La molécule fluorescente est mélangée à différentes concentrations de molécules lipidiques non fluorescentes, et le mélange de molécules dans la solution est chargé dans des capillaires. Un gradient de...

Thermophorèse à l’échelle microscopique pour étudier les interactions protéine-lipide en solution

La fluorimétrie différentielle à balayage est une méthode largement utilisée pour cribler des bibliothèques de petites molécules pour les interactions avec les protéines. Nous présentons ici une méthode simple pour étendre ces analyses afin de fournir une estimation de la constante de dissociation entre une petite molécule et son partenaire protéique.

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

La thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) est une technologie sensible pour caractériser les interactions aptamère-cible. Ce manuscrit décrit un protocole MST pour caractériser les interactions aptamère-petites molécules.

La cartographie du site de liaison d&#39;un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Une procédure est présentée pour le repliement de la domaine de liaison du ligand périplasmique dCACHE de Campylobacter jejuni zone chémoréceptrice Tlp3 de corps d’inclusion et de la purification pour produire des quantités de milligramme de protéine.

Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

Nous présentons ici un protocole pour la production et la purification des protéines qui sont marqués avec des isotopes stables et ultérieure caractérisation des interactions protéine-protéine à l’aide de la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et micro-échelle Expériences de thermophorèse (MST).

Mesurer les Interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et thermophorèse a petite Echelle (MST)

La thermophorèse à micro-échelle permet d’obtenir rapidement des constantes de liaison à faible coût matériel. La thermophorèse micro-échelle étiquetée ou sans étiquette est disponible dans le commerce; cependant, la thermophorèse sans étiquette n’est pas capable de la diversité des mesures d’interaction qui peuvent être effectuées à l’aide d’étiquettes fluorescentes. Nous fournissons un protocole pour les mesures de thermophorèse marquées.

Utilisation de la thermophorèse à micro-échelle pour mesurer les interactions protéine-lipide

Un adaptateur de plaque multicolonne permet aux colonnes de chromatographie d’être interfacées avec des plaques de collecte multi-puits pour une affinité parallèle ou une purification par échange d’ions, offrant une méthode de purification de protéines économique à haut débit. Il peut être utilisé sous gravité ou sous vide donnant des quantités de milligrammes de protéines via une instrumentation abordable.

Un système de purification de protéines à haut débit économique et polyvalent à l’aide d’un adaptateur de plaque multicolonne

Découvrez comment déterminer l'affinité de liaison protéine-ligand par thermophorèse microscale (MST) directement à partir de lysats cellulaires sans purification. Cette méthode utilise des protéines fusionnées à la GFP pour des analyses rapides et fiables.

Protein Purification méthode sans la détermination de l'affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Explorer plus de vidéos