Développement d’un modèle 3D de tissu neural polarisé à base de collagène de soie

Placez des échafaudages en soie poreuse en forme de beignet, enduits de poly-D-lysine, dans une assiette à plusieurs puits.

Ajoutez du milieu de culture pour hydrater les échafaudages, facilitant ainsi la fixation des cellules.

Aspirez les fluides en excès. Ensemencez les échafaudages avec une suspension de cellules neuronales et incubez.

La surface enduite et les pores de l’échafaudage offrent une grande surface pour la fixation des cellules à haute densité et facilitent la diffusion efficace des nutriments et des déchets.

Retirez les cellules non attachées et ajoutez du collagène, une protéine de la matrice extracellulaire.

Incuber pour la polymérisation du collagène. Ce processus intègre les cellules dans une matrice 3D semblable à un gel sur l’échafaudage poreux.

Ajouter des médias. Cultivez, et remplacez régulièrement la moitié du milieu de culture pour reconstituer les nutriments sans perturber les cellules.

Au sein de la culture, les corps cellulaires neuronaux restent ancrés à l’échafaudage de soie tandis que les axones se développent à travers la matrice de collagène, formant des réseaux axonaux 3D.

Cette localisation compartimentée du corps cellulaire et des axones aboutit à la formation d’un modèle de tissu neural polarisé en 3D, semblable à un cerveau.

À l’intérieur d’une hotte de culture cellulaire, placez une paire de pinces stérilisées, des milieux de culture cellulaire et les échafaudages autoclavés. Retirez une assiette de 96 puits de son emballage et placez-la à l’intérieur. Pour ensemencer les échafaudages, placez d’abord un échafaudage stérile par puits dans la plaque à 96 puits. Ajoutez un milieu de culture cellulaire pour immerger les échafaudages et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire pour les équilibrer pendant au moins 30 minutes.

Après l’incubation, aspirez l’excédent de milieu des échafaudages. Ensuite, ajoutez 2 fois 10 aux 6 cellules neuronales corticales du rat dans 100 microlitres de milieu neurobasal par échafaudage. Remettez la plaque dans l’incubateur et laissez reposer toute la nuit pour permettre aux cellules de se fixer à l’échafaudage. Le lendemain matin, aspirez soigneusement les cellules non attachées et remplacez-les par 200 microlitres de milieu de culture cellulaire frais. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une brève période.

Ensuite, aspirez le fluide des puits. À l’aide d’une pince stérile, transférez les échafaudages contenant les cellules dans les puits vides de la plaque à 96 puits. Ensuite, à chaque échafaudage, ajoutez 100 microlitres de solution de collagène de queue de rat fraîchement diluée et glacée à 3 milligrammes par millilitre.

Remettez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pour permettre la polymérisation du collagène pendant 30 minutes. Retirez la plaque de l’incubateur et ajoutez 100 microlitres de milieu de culture cellulaire préchauffé par puits. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant la période souhaitée de croissance cellulaire, en remplaçant la moitié du milieu de chaque puits par du milieu frais chaque jour pendant une semaine maximum.