Isolement et culture de neurones embryonnaires de poussin sur un réseau à plusieurs électrodes

Prenez un œuf de poule fécondé contenant un embryon à un stade précoce.

Stérilisez la coquille et ouvrez-la soigneusement.

Retirez l’embryon. Disséquez et transférez la tête dans une plaque de culture contenant un tampon. Retirez le globe oculaire.

Faites une incision et retirez les couches de peau, exposant le cerveau antérieur et le mésencéphale.

Retirez la couche membraneuse interne et les vaisseaux sanguins. Disséquez et transférez le cerveau antérieur dans une plaque de culture avec un tampon.

Coupez le tissu en petits fragments et transférez-les dans un tube conique. Une fois que les fragments se déposent, retirez le tampon.

Ajouter une solution enzymatique protéolytique. Incuber pour digérer la matrice extracellulaire du tissu et desserrer les neurones.

Retirez les milieux riches en enzymes, lavez-les avec des milieux neurobasaux, en éliminant toutes les enzymes restantes.

Ajouter un milieu neurobasal. Dissocier mécaniquement le tissu pour obtenir une suspension neuronale.

Ensemencez ces neurones sur un système de réseau multi-électrodes recouvert d’une matrice extracellulaire. Ajouter un milieu neurobasal et incuber.

Les neurones attachent et étendent les projections, formant un réseau neuronal.

Le jour de l’installation des neurones, retirez un flacon de matrice extracellulaire du congélateur à -20 degrés Celsius. Vaporisez avec de l’éthanol à 70 % et placez sur de la glace. Assurez-vous de décongeler la matrice extracellulaire sur de la glace. Ne pas décongeler à température ambiante, car l’ECM polymérise au-dessus de 0 degré Celsius.

Travailler dans la hotte BSL-2 pour diluer la matrice extracellulaire à 25 % en ajoutant 300 microlitres de milieu neurobasal froid à l’aliquote de 100 microlitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 microlitres de solution de matrice extracellulaire à 25 % au centre du réseau de multiélectrodes, en prenant soin de ne pas toucher les électrodes. Retirez immédiatement l’ECM en laissant une fine pellicule sur la surface.

Couvrez le réseau de multiélectrodes et placez-le dans l’incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce qu’il soit prêt à plaquer les neurones. Commencez l’isolement des neurones de poussin en stérilisant la coquille externe d’un œuf E7 avec de l’éthanol à 70 %. Il est important de maintenir des conditions stériles à partir de ce moment. Assurez-vous que tous les instruments sont stérilisés avec de l’éthanol à 70 % et que les solutions sont stériles. Il est utile d’utiliser une cagoule de dissection, mais ce n’est pas absolument nécessaire pour les dissections, si elle est effectuée rapidement.

Ensuite, après avoir récupéré et décapité l’embryon, coupez autour des yeux et retirez les globes oculaires. Ensuite, utilisez une pince fine Dumont numéro 5 et des ciseaux à ressort pour faire une incision sur le côté ventral et retirez les couches externes de la peau pour exposer le cerveau antérieur et le tectum optique. Pelez et retirez soigneusement la membrane de la peau.

Transférez le cerveau antérieur dans une autre boîte de Pétri contenant du HBS et coupez-le en petits morceaux d’environ 2 millimètres avec des ciseaux à ressort. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, transférez les morceaux de cerveau antérieur dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Une fois que les morceaux de cerveau antérieur ont coulé au fond du tube de centrifugation, retirez autant de HBS que possible.

Ensuite, ajoutez 1 millilitre de trypsine-EDTA préchauffée à 0,5 % et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette Pasteur, vous pourrez retirer délicatement la trypsine sans déranger les morceaux de tissu. Ajoutez 1 millilitre de milieu neurobasal et laissez les morceaux de tissu couler au fond. Après avoir retiré le milieu et répété le lavage, ajoutez 2 millilitres de milieu neurobasal et triturez doucement jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de morceaux de tissu.

Diluez les cellules 1 à 10 remises en suspension avec un milieu neurobasal et comptez les cellules viables à l’aide d’un colorant bleu trypan et d’un hémocytomètre. Après le comptage, plaquez les cellules associées sur des réseaux de multiélectrodes recouverts d’ECM à une densité de 2 200 cellules par millimètre carré.