Mesure de l’activité neuronale dans une tranche de cerveau de souris après une incubation prolongée

Fixez une tranche de cerveau de souris dans une chambre d’enregistrement, perfusée avec de l’aCSF oxygéné après une incubation prolongée.

Les cellules de la tranche sont chargées d’un indicateur de calcium, ce qui facilite les mesures de calcium intracellulaire.

Prenez une pipette d’enregistrement comprenant une électrode dans une solution d’électrolyte.

Identifiez un neurone cible. Positionnez la pipette enregistreuse avec une pression positive sur la membrane cellulaire, créant ainsi une fossette.

Appliquez une pression négative pour créer un joint étanche.

De plus, appliquez des impulsions de pression négative, rompant la membrane et établissant une configuration de cellule entière.

Perfuser un LCR à haute concentration en potassium, qui dépolarise la membrane du neurone.

La dépolarisation ouvre les canaux sodiques, déclenchant un potentiel d’action, qui à son tour active les canaux calciques voltage-dépendants et permet l’afflux de calcium.

Les ions calcium se lient à l’indicateur, améliorant la fluorescence, qui peut être visualisée sous un éclairage approprié.

L’augmentation de la fluorescence intracellulaire, causée par l’afflux de calcium après l’application de potassium, indique la viabilité neuronale après une incubation prolongée.

Pour l’enregistrement, placez le tissu dans une chambre d’enregistrement immergée sous un microscope et perfusez-le avec de l’aCSF oxygéné à un débit de 4 à 5 millilitres par minute. Maintenez le tissu à l’aide d’une harpe sur mesure. Ensuite, préparez quelques pipettes d’enregistrement à l’aide d’un extracteur de micropipettes pour obtenir une résistance finale de 5 à 6 méga ohms.

Remplissez la pipette avec 3 à 4 microlitres de solution interne, puis placez la solution sur de la glace. Ensuite, visualisez les cellules à l’aide d’une caméra CCD sous IR-DIC. Positionnez la pipette sur la membrane cellulaire à l’aide d’un micromanipulateur. Maintenez une pression positive grâce à un orifice d’aspiration sur le porte-pipette. Une fois la pipette sur la cellule, appliquez une légère pression négative sur la pipette pour obtenir une étanchéité gigaohm.

Ensuite, rompez la membrane cellulaire avec une brève pression négative. Par la suite, démarrez l’enregistrement par pince de courant ou de tension de la cellule entière. Pour une longueur d’onde d’excitation unique de flux 4, filtrez la lumière d’excitation à travers un filtre passe-bande de 460 à 490 nanomètres et la lumière émise à travers un filtre passe-bande de 515 à 550 nanomètres.