Enregistrement de l’activité électrophysiologique du réseau neuronal dans une co-culture neurone-astrocytes

Commencez avec une plaque multi-électrodes, ou MEA. Chaque puits contient un réseau d’électrodes positionné au centre.

Le réseau est recouvert d’un substrat de culture pour faciliter l’adhésion cellulaire.

Ajoutez une suspension de motoneurones et d’astrocytes sous forme de gouttelettes sur le réseau.

Incuber pour permettre la fixation cellulaire, puis ajouter un milieu de co-culture chaud complété par une petite molécule qui maintient la viabilité cellulaire.

Au cours de l’incubation, les astrocytes sécrètent des facteurs qui favorisent la maturation neuronale et la formation des synapses, ce qui entraîne un réseau neuronal.

Placez le MEA dans un appareil d’enregistrement dans des conditions physiologiques pour surveiller l’activité neuronale.

Les neurones transmettent des signaux électriques, appelés potentiels d’action, qui se déplacent le long de leurs axones.

Lorsqu’il atteint la synapse, le signal déclenche la libération de neurotransmetteurs, propageant le signal au neurone suivant.

Des électrodes à l’intérieur de chaque puits enregistrent extracellulairement les signaux générés par les neurones synaptiquement connectés.

La détection de signaux électriques rythmiques synchronisés confirme la mise en place d’un réseau neuronal.

Le jour du placage ou avant, commencez à enduire les plaques MEA à 24 puits en diluant d’abord PLO dans de l’eau ou du PBS. Ensuite, ajoutez 15 à 20 microlitres de PLO dans chaque puits, en formant une gouttelette au centre du puits, couvrant la zone de l’électrode, en veillant à ne pas endommager les électrodes avec la pointe de la pipette.

Ajoutez de l’eau dans les puits environnants des compartiments, en veillant à ce qu’ils soient suffisamment humides, et incubez PLO à 37 degrés Celsius pendant 1 à 2 heures. Ensuite, à l’aide d’une pointe de micropipette en plastique, aspirez autant de PLO que possible sans toucher les électrodes. Ensuite, lavez le puits avec 250 microlitres d’eau, trois fois.

À l’aide d’une pointe de pipette, retirez autant d’eau que possible et laissez sécher la surface avec le couvercle retiré. Ensuite, ajoutez 15 à 20 microlitres de laminine diluée pour couvrir chaque réseau d’électrodes. Après avoir ajouté de l’eau dans les compartiments d’humidité et remis le couvercle, incuber à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures jusqu’à toute la nuit.

Le jour du placage, après avoir rincé les motoneurones et les cultures d’astrocytes une fois avec du PBS, ajoutez 0,05 % de trypsine et incubez à 37 degrés Celsius pendant environ 5 minutes pour soulever les cellules. Collectez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres, contenant un inhibiteur de la trypsine, et lavez les plaques avec un milieu ou une base pour vous assurer que toutes les cellules sont collectées.

Granulez les cellules par centrifugation, puis à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, remettez en suspension les motoneurones et les astrocytes avec un milieu de co-culture contenant 20 micromolaires d’inhibiteur de ROCK pour générer 1 millilitre d’une suspension unicellulaire. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les motoneurones et les astrocytes et, pendant que vous comptez, refermez les suspensions cellulaires et placez-les dans un support en polystyrène à 4 degrés Celsius.

Centrifugez 1 millilitre des deux suspensions cellulaires à 300 fois g pendant 5 minutes. Calculez le volume souhaité et remettez les granulés en suspension. Combinez le volume requis de suspensions de neurones et d’astrocytes dans des proportions égales, et mélangez doucement en pipetant deux fois pour bien combiner.

Ensuite, retirez la laminine de chaque puits de la plaque et transférez 10 microlitres de la suspension cellulaire combinée finale dans chaque puits, formant une petite gouttelette recouvrant le réseau d’électrodes. Incuber les plaques avec une gouttelette cellulaire non perturbée à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour former les premières attaches sur les plaques.

Ensuite, pipetez 250 microlitres de milieu de co-culture chaud contenant un inhibiteur de ROCK sur la paroi de chaque puits, et pipetez le même volume sur la paroi opposée de chaque puits, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 à 36 heures. Le lendemain, examinez les plaques à la recherche de débris ou de cellules mortes et, si nécessaire, remplacez le milieu par un milieu de co-culture frais contenant un inhibiteur de ROCK.

Sinon, effectuez des échanges de demi-milieu deux fois par semaine en utilisant un milieu de co-culture sans inhibiteur de ROCK, à partir du jour 2 de la co-culture. Pour effectuer l’enregistrement, commencez dès que possible après le jour 1 de la co-culture en réglant la température à 37 degrés Celsius et le dioxyde de carbone à 5 %. Ensuite, transférez les plaques dans l’appareil d’enregistrement et équilibrez-vous pendant au moins cinq minutes avant d’enregistrer. Enregistrez l’activité de base tous les deux jours ou toutes les semaines pendant 1 à 15 minutes, selon le plan expérimental.