Évaluation de la formation de connexions neuronales dans une co-culture à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques

Placer une lamelle contenant une co-culture dans une chambre d’enregistrement imprégnée d’une solution extracellulaire oxygénée.

La co-culture se compose d’astrocytes, de neurones corticaux de rat exprimant des canaux ioniques sensibles à la lumière fusionnés à une protéine fluorescente et de neurones dérivés d’iPSC exprimant une autre protéine fluorescente.

À l’aide d’un microscope confocal, identifiez un neurone fluorescent dérivé d’iPSC.

Avancez une pipette d’enregistrement remplie d’une solution intracellulaire vers le neurone pour établir une configuration de cellule entière.

Maintenir un potentiel de membrane négatif constant pour des mesures de courant précises.

Éclairer la co-culture avec de la lumière pour activer les canaux ioniques sensibles à la lumière dans les neurones corticaux, générant ainsi un potentiel d’action.

Le potentiel d’action provoque la libération de neurotransmetteurs dans la fente synaptique.

S’ils sont connectés synaptiquement, les neurotransmetteurs se lient aux récepteurs du neurone dérivé de l’iPSC patché, ouvrant des canaux ioniques et générant des courants postsynaptiques.

L’augmentation des courants postsynaptiques dans les neurones dérivés d’iPSC après stimulation lumineuse confirme les connexions synaptiques avec les neurones corticaux.

Utilisez un microscope confocal équipé d’une lentille d’immersion dans l’eau 60x. Perfuser les cellules à température ambiante dans une solution externe, bouillonnée constamment avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone. Utilisez une solution interne pour remplir la micropipette enregistreuse.

Pour effectuer une stimulation optogénétique, patchez une cellule tdTomato-positive en mode cellule entière et réglez la pince de tension à moins 70 millivolts. Avec la lampe au mercure plein champ et un filtre d’excitation 480 sur 40, stimulez tout le champ pendant 30 secondes. Enregistrer les courants postsynaptiques, ou PSC, d’une cellule patchée induits par la photostimulation des neurones corticaux présynaptiques exprimant ChR2.