Chargement et déchargement du colorant FM médié par des microélectrodes dans les cellules nerveuses des larves de drosophile

Commencez par des larves de drosophile, avec les fibres musculaires et nerveuses exposées immergées dans une solution contenant des vésicules de colorant à membrane fluorescente, ou colorant FM.

Le colorant FM se lie aux lipides de la membrane cellulaire, formant un revêtement fluorescent sur celle-ci.

À l’aide d’un micromanipulateur, placez la pointe de la microélectrode d’aspiration sous un microscope.

Focus sur les fibres nerveuses et la microélectrode.

Utilisez une pression négative pour aspirer une boucle de la fibre nerveuse dans la microélectrode.

Appliquez des impulsions de courant pour stimuler la fibre nerveuse.

Cela déclenche la jonction neuromusculaire, où un motoneurone se connecte à une fibre musculaire, pour initier l’endocytose de la vésicule synaptique.

Au cours de ce processus, la cellule engloutit la membrane recouverte de colorant FM pour former des vésicules endocytaires colorées, idéales pour visualiser les stades présynaptiques de la neurotransmission.

Lavez le colorant FM et remplacez la solution externe.

Appliquez des impulsions de courant pour décharger les vésicules colorées au colorant FM hors de la cellule.

Pour la stimulation électrique, préparez une pipette d’aspiration à l’aide de l’extracteur de microélectrodes pour obtenir le cône et la taille de pointe requis. Ensuite, polissez au feu la pointe de la microélectrode avec une microforge pour créer un ajustement serré lors de l’aspiration d’un seul nerf moteur.

Faites glisser la pipette d’aspiration sur le porte-électrode d’un micromanipulateur, qui est fixé à un long tube en plastique flexible et à une seringue. Ensuite, placez la préparation avec un colorant FM sur la platine du microscope et soulevez la platine jusqu’à ce que la larve et la pipette d’aspiration soient nettes.

Ensuite, aspirez une boucle de nerf moteur coupé, innervant l’hémi-segment sélectionné avec une pression d’air négative générée par la seringue dans l’électrode d’aspiration. Par la suite, stimulez le nerf moteur à l’aide des paramètres sélectionnés pour stimuler l’endocytose SV et l’absorption du colorant FM1-43.

L’étape la plus critique à ce stade de la procédure consiste à aspirer un seul axone moteur dans l’électrode d’aspiration avec un ajustement serré. Cela peut prendre quelques essais et erreurs. Une fois qu’une électrode d’aspiration adéquate est trouvée, utilisez la même pour toutes les conditions comparées afin d’assurer une force de stimulation constante.

Pour le déchargement du colorant FM, aspirez le même nerf moteur dans la même électrode, puis stimulez le nerf moteur pour activer l’exocytose SV et la libération du colorant FM1-43.