Évaluation d’une jonction neuromusculaire fonctionnelle par stimulation optique et enregistrement vidéo simultanés

Commencez par un bioréacteur doté d’une chambre musculaire contenant du tissu musculaire inclus dans du collagène soutenu sur les piliers de la chambre.

Le canal de la neurosphère contient une neurosphère dans une matrice de collagène. Les motoneurones de la neurosphère expriment des canaux sensibles à la lumière.

Ajoutez un milieu de différenciation contenant des facteurs de croissance neuronale qui stimulent les neurones à étendre leurs projections.

Échangez régulièrement le milieu pour assurer une extension continue des neurones vers le tissu musculaire, formant des jonctions neuromusculaires.

Observez le bioréacteur à l’aide d’un microscope équipé d’une caméra et d’une source de lumière bleue.

Appliquez des impulsions de lumière bleue pour ouvrir les canaux sensibles à la lumière dans les neurones, permettant aux ions du milieu de circuler et de stimuler les neurones à générer des signaux électriques.

Ces signaux voyagent via les projections neuronales vers les jonctions neuromusculaires, transmettant le signal électrique au tissu musculaire.

Enregistrez une vidéo simultanément. Une contraction progressive de la fibre musculaire confirme le développement d’une jonction neuromusculaire fonctionnelle.

Préparez un mélange de 4 pour 1 de 3 milligrammes par millilitre de collagène I et de matrice de membrane basale solubilisée. Ensuite, mettez les myoblastes en suspension dans ce mélange de collagène fraîchement préparé.

Ensuite, ajoutez 15 microlitres de cette suspension de collagène cellulaire dans chaque chambre musculaire du bioréacteur, en veillant à répartir la suspension sur les deux piliers à l’aide de la pointe de la pipette. Laissez le mélange de gel cellulaire polymériser à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, remplissez bien chaque bioréacteur avec 450 microlitres de milieu de croissance myotonique.

Au 11e jour de la différenciation des motoneurones, transférez les cellules et les milieux dans un tube de 50 millilitres et laissez les neurosphères se déposer au fond pendant 5 minutes. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 15 millilitres de milieu de culture en suspension de motoneurones complété par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau et 10 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales.

Au 14e jour des protocoles de différenciation, ensemencez les motoneurones dans la plateforme. Préparez un mélange de gel 4 pour 1 de 2 milligrammes par millilitre de collagène I et de matrice de membrane basale solubilisée. Utilisez une passoire cellulaire de 400 nanomètres pour sélectionner de grandes neurosphères et les remettre en suspension dans le mélange de gel préparé.

Soigneusement, aspirez le milieu du réservoir et de la neurosphère bien. Ensuite, ajoutez 15 microlitres du mélange de gel dans le canal de la neurosphère. Chargez une pipette de 10 microlitres avec 10 microlitres de gel et choisissez une neurosphère. Déposez la neurosphère dans le canal de la neurosphère, en vous assurant qu’elle se trouve dans la chambre. Ensuite, soulevez lentement la pipette tout en libérant le gel restant une fois la neurosphère déposée.

Laissez le gel polymériser pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 450 microlitres de NbActiv4 complétés par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau et 10 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales dans les réservoirs.

Pour l’imagerie, utilisez un microscope à fluorescence inversée avec un logiciel de caméra scientifique à semi-conducteur à oxyde métallique. Réglez le binning sur 2 par 2, l’exposition sur 20 millisecondes, l’obturateur roulant activé, le taux de lecture sur 540 mégahertz, la plage dynamique sur 12 bits et le gain 1, et le mode capteur sur superposition. Utilisez un objectif 2x sur le microscope pour imager les microtissus et fixez une chambre de cellules vivantes à la platine du microscope.

Sélectionnez la région d’intérêt qui contient les tissus squelettiques innervés afin de minimiser la taille du fichier et le temps de traitement. Ensuite, placez un filtre d’émission passe-long de 594 nanomètres entre l’échantillon et l’objectif d’imagerie pour filtrer les impulsions de lumière bleue de la caméra. Ensuite, placez une plaque rectangulaire à quatre puits contenant quatre bioréacteurs dans la chambre de la cellule vivante. Ensuite, cliquez sur Live View, centrez et concentrez l’image avec le retour sur investissement souhaité.

Téléchargez le macrocode personnalisé à partir du dossier GitHub pour contrôler la position de la scène, la carte Arduino et l’acquisition vidéo. Ensuite, définissez le film de sortie sur day_tissuegroup_tissuename_experiment. ND2. Exécutez le macrocode avec les coordonnées x et y souhaitées définies sur la scène et obtenez un time-lapse rapide avec 1 700 images à 50 images par seconde.

Après l’imagerie, remplacez le milieu et remettez les échantillons dans l’incubateur. Prévoyez au moins 24 heures entre les séances d’acquisition d’images pour éviter la fatigue des tissus.