Évaluation de l’internalisation de protéines de surface cibles à l’aide d’un dérivé de la biotine

Traitez les astrocytes corticaux de souris avec un dérivé de la biotine clivable.

Incuber à basse température pour empêcher l’internalisation des protéines et faciliter la fixation de la biotine aux protéines de surface cibles.

Laver et ajouter un milieu chaud, puis incuber pour induire l’internalisation des protéines biotinylées.

Laver et traiter avec un agent réducteur imperméable à la membrane pour cliver la biotine non internalisée.

Ajoutez un réactif de trempe pour arrêter la réaction et lavez.

Récoltez les cellules et centrifugez. Retirez le surnageant.

Ajoutez un tampon de lyse pour lyser les cellules, libérant les protéines biotinylées non biotinylées et internalisées.

Centrifugeuse pour granuler les débris de la cellule.

Prélevez le surnageant contenant des protéines, ajoutez des billes de streptavidine-agarose et mélangez pour capturer les protéines biotinylées.

Centrifuger pour granuler les billes et jeter le surnageant.

Ajoutez un tampon de chargement et de la chaleur pour dénaturer et libérer les protéines des billes.

Exécutez la protéine sur un gel et transférez-la sur une membrane de buvard.

Détectez à l’aide d’anticorps primaires et secondaires pour visualiser une bande protéique distincte, confirmant ainsi la réussite de l’internalisation des protéines.

Tout d’abord, retirez les cultures d’astrocytes de l’incubateur et aspirez le milieu. Ensuite, lavez trois fois les cellules avec 4 millilitres de CM-PBS réfrigéré et placez la vaisselle sur de la glace pilée. Aspirez le CM-PBS, puis pipetez 3 millilitres de tampon de biotine dans chaque plat. Inclinez les plats d’avant en arrière plusieurs fois pour vous assurer que le tampon est bien réparti et laissez-les sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez le tampon de biotine et remplacez-le par 5 millilitres de milieu chaud. Incuber une boîte de culture à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes et une deuxième boîte à la même température pendant 30 minutes. Laissez un autre plat à 4 degrés Celsius comme échantillon de zéro minute.

À la fin de la période d’incubation, jetez le milieu et lavez les cellules trois fois avec 4 millilitres de CM-PBS réfrigéré. Ensuite, aspirez le CM-PBS, puis pipetez 6 millilitres de tampon réducteur sur les cellules et laissez l’échantillon sur de la glace pendant 15 minutes.

Ensuite, remplacez le milieu par 6 millilitres de tampon réducteur frais et placez l’échantillon sur de la glace pendant 15 minutes supplémentaires.

Cette étape est essentielle car le glutathion contenu dans le tampon réducteur cliva les fractions de biotine restantes à la surface de la cellule. Cela garantit que seules les protéines internalisées seront biaisées et étiquetées.

Ensuite, retirez la solution réductrice et remplacez-la par 6 millilitres de tampon de trempe. Laissez l’échantillon sur de la glace pendant encore 15 minutes et répétez l’étape de trempe une fois de plus. Ensuite, jetez le tampon de trempe et lavez les cellules trois fois avec 4 millilitres de PBS réfrigéré.

Aspirez le CM-PBS, puis raclez les cellules dans 1 millilitre de PBS réfrigéré à l’aide d’un élévateur de cellules, puis transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation. Granulez les cellules par centrifugation à 100 g pendant trois minutes. Au bout de trois minutes, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse.

Laissez l’échantillon sur de la glace pendant 30 minutes et faites un tourbillon toutes les cinq minutes. Centrifugez le lysat à 14 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius pour granuler le détergent et les matières solubles. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation.

À l’aide d’une pointe de pipette coupée, ajoutez 150 microlitres de la suspension d’agarose streptavidine au lysat et incubez-le à 4 degrés Celsius pendant trois heures sur un agitateur. Après trois heures, granulez les billes d’agarose streptavidine par centrifugation à 1 500 g pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius. Remettez les billes en suspension dans 1 millilitre de tampon de lavage et balancez-les pendant trois minutes à 4 degrés Celsius. Granulez les perles et jetez le surnageant.

Répétez ce processus quatre fois de plus pour minimiser la liaison non spécifique des protéines cytosoliques non biotinylées. Ensuite, granulez les billes par centrifugation à 1 500 g pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius. Jetez le tampon de lavage sus-jacent et ajoutez 50 microlitres de 1x tampon de chargement.

Libérez la biotine et la streptavidine des billes en les dénaturant à 95 degrés Celsius. Cette fraction ne doit contenir que des protéines de surface cellulaire internalisées. Ensuite, séparez les fractions d’entrée, de surface cellulaire et non liées par SDS-PAGE et analysez-les par Western blot.