Évaluation de l’internalisation de protéines de surface cibles à l’aide d’un dérivé de la biotine

Traitez les astrocytes corticaux de souris avec un dérivé de la biotine clivable.

Incuber à basse température pour empêcher l’internalisation des protéines et faciliter la fixation de la biotine aux protéines de surface cibles.

Laver et ajouter un milieu chaud, puis incuber pour induire l’internalisation des protéines biotinylées.

Laver et traiter avec un agent réducteur imperméable à la membrane pour cliver la biotine non internalisée.

Ajoutez un réactif de trempe pour arrêter la réaction et lavez.

Récoltez les cellules et centrifugez. Retirez le surnageant.

Ajoutez un tampon de lyse pour lyser les cellules, libérant les protéines biotinylées non biotinylées et internalisées.

Centrifugeuse pour granuler les débris de la cellule.

Prélevez le surnageant contenant des protéines, ajoutez des billes de streptavidine-agarose et mélangez pour capturer les protéines biotinylées.

Centrifuger pour granuler les billes et jeter le surnageant.

Ajoutez un tampon de chargement et de la chaleur pour dénaturer et libérer les protéines des billes.

Exécutez la protéine sur un gel et transférez-la sur une membrane de buvard.

Détectez à l’aide d’anticorps primaires et secondaires pour visualiser une b