Combiné optogénétiques et Cryo-fracture Replica immunomarquage examiner l'aménagement spécifique à l'entrée de Glutamate Receptors dans l'amygdale Souris

L’objectif de cette procédure, qui combine l’optogénétique avec la technique d’immunomarquage de la réplique par congélation-fracture, est d’analyser la densité des récepteurs ionotropiques du glutamate au niveau des synapses de l’amygdale de souris avec des éléments pré-synaptiques et post-synaptiques identifiés. La haute reproductibilité et la polyvalence de cette technique d’immunomarquage par congélation, lorsqu’elle est combinée à l’optogénétique, offrent une approche très puissante pour l’analyse corrélée des propriétés structurelles et fonctionnelles des synapses. Les principaux avantages de cette procédure sont : la vue plane des éléments pré et post-synaptiques, et l’analyse quantitative des protéines dans ces micro-domaines spécialisés.

Différentes techniques peuvent être adaptées à une variété de tissus différents pour étudier la distribution et l’organisation des protéines membranaires intégrales. En général, cette approche optogénétique combinée FRIL est difficile pour les débutants en raison de la large gamme d’appareils et de machines différents requis. Il est essentiel de commencer la modulation avec une méthode différente, car certaines autres étapes sont difficiles à apprendre.

Comme la fracturation et la reproduction de spécimens congelés Pour commencer cette procédure, collez un bloc coronal de cerveau de souris sur le support du vibro-trancheur. Orientez le bloc de tissu de manière à ce que le néo-cortex fasse face à la lame vibrante. Ensuite, coupez les sections coronales contenant l’amygdale à une épaisseur de 140 micromètres en point zéro une molaire, PB glacé. Et rassemblez-les dans un plat à six puits dans le même tampon.

Sous un stéréomicroscope, coupez la région d’intérêt des tranches, dans une boîte de Pétri recouverte d’élastomère de silicone et remplie de point zéro une molaire PB. Ensuite, transférez le bloc coupé dans la solution de cryoprotection et conservez-le toute la nuit à six degrés Celsius. Dans cette étape, préparez les supports en cuivre pour une utilisation dans les étapes successives de la procédure FRIL, en les polissant avec une feuille de peau de chambranle comme dissolvant de ternissement. Sous le microscope, fixez un anneau de ruban adhésif double face au support en cuivre, qui servira de puits de maintien pour le bloc coupé.

Ensuite, placez le bloc coupé dans le trou du ruban adhésif double face à l’aide d’une boucle de fil de platine. Retirez l’excès de solution cryoprotectrice à l’aide d’un papier filtre ou d’une brosse. Ensuite, couvrez le support de maintien avec un autre support.

Pour que le bloc de tissu soit pris en sandwich entre les deux supports. Pour congeler l’échantillon, insérez le sandwich de transport dans le porte-échantillon. Ensuite, insérez le porte-échantillon dans l’unité de congélation à haute pression.

Lancez le cycle de congélation en appuyant sur le bouton jet-auto, retirez immédiatement le porte-échantillon et plongez la pointe dans une boîte isotherme avec de l’azote liquide. Ensuite, retirez délicatement le sandwich de support du porte-échantillon et placez-le dans un cryoflacon pré-réfrigéré. Conservez les cryoflacons contenant les supports dans un réservoir cryogénique jusqu’à la réplication.

Avant d’insérer le pistolet à faisceau d’électrons, retirez le bouclier avec la plaque déflectrice. Placez la jauge de réglage, pour centrer le filament, dans le mandrin à pince à travers le couvercle inférieur de la cathode. Ensuite, faites glisser le nouveau filament sur le manomètre, jusqu’à ce que les lames de pression serrent les extrémités du filament.

Ensuite, retirez la jauge de réglage et insérez la tige de carbone. Fixez-le en serrant la pince de serrage du porte-tige de l’évaporateur. S’assurer que la hauteur de l’extrémité de la tige se trouve au milieu de la deuxième bobine à partir du bas.

Après cela, remplacez la plaque déflectrice et insérez le pistolet à faisceau d’électrons dans l’unité de congélation-fracture. Dans cette procédure, ajustez le courant et la tension pour l’évaporation. Ensuite, insérez le sandwich de transport congelé dans la table à double réplique dans de l’azote liquide.

Ensuite, transférez la table à double réplique dans le récipient Dewar et fixez-la au récepteur de l’étage de l’échantillon à un angle de 45 degrés. Prenez la table à double réplique à l’aide d’un manipulateur de table. Insérez-le dans l’unité de congélation-fracture sur la platine froide et attendez environ 20 minutes pour permettre à la température de la table à double réplique de s’ajuster à moins 115 degrés Celsius.

Ensuite, fracturez le tissu en tournant manuellement la roue dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, qui est reliée au carénage au-dessus de la table à double réplique. Lorsque le carénage tourne, il force l’ouverture de la table à double réplique, ce qui entraîne la fracture du tissu. Une couche de carbone à un angle de 90 degrés est appliquée sur les faces fracturées.

Par la suite, retirez les spécimens répliqués de la table de réplication double et transférez-les sur une plaque de céramique à 12 puits remplie de TBS. À l’aide d’une boucle de fil machine en platine, retirez le tissu répliqué du support d’échantillon. Pour la digestion par SMS, transférez une réplique dans un flacon en verre de quatre millilitres rempli d’un millilitre de tampon de digestion SDS.

Laissez-le digérer pendant 18 heures à 80 degrés Celsius en le secouant. Pour l’immunomarquage, laver la réplique pendant 10 minutes dans un tampon de digestion SDS frais. Ensuite, incubez-le avec des anticorps primaires et secondaires, dilués dans 2 % de BSA-TBS, dans une chambre humide à 15 degrés Celsius pendant 24 à 72 heures.

Après cela, montez la réplique sur une grille de barres parallèles de 100 lignes. Imagez la réplique avec un microscope électronique à transmission à 80 ou 100 kilovolts. Ensuite, acquérez les images numériques à l’aide d’une caméra CCD.

Lorsqu’il est hors ligne, recherchez les régions correspondantes sur l’image à partir de la réplique, à l’aide de différents points de repère. Quatre semaines après l’injection d’AAV, pour exprimer la Channelrhodopsin-2 dans le groupe nucléaire thalamique postérieur, la Channelrhodopsin-2 est efficacement transportée antérograde le long des axones thalamiques pour atteindre les masses cellulaires intercalées de l’amygdale. La spécialisation post-synaptique des synapses glutamatergiques peut être reconnue dans une réplique sous la forme d’un amas de particules intramembranaires sur la face E de la membrane plasmique, et est souvent accompagnée de la face P de son élément présynaptique.

Ici, les récepteurs de la channelrhodopsine-2 et du glutamate ont été visualisés à l’aide de particules d’or de différentes tailles conjuguées aux anticorps secondaires. En raison du manque d’outils structurels ou moléculaires pour détecter sur une même réplique si la membrane postsynaptique appartenait aux neurones intercalés. La réplique correspondante a été marquée pour les récepteurs opioïdes mu, un marqueur de ces neurones.

À titre d’exemple de l’analyse quantitative de la densité des récepteurs du glutamate au niveau de ces synapses, voici les diagrammes de dispersion du nombre de particules d’or pour les récepteurs ampa par rapport à la zone synaptique des épines et des dendrites. Ce qui révèle une corrélation positive dans les deux structures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les étapes individuelles sont fortement interdépendantes.

Par conséquent, une erreur dans l’une des étapes peut mettre en péril l’ensemble de la procédure. L’observation d’une grande partie des spécialisations de la membrane plasmique sur une surface bidimensionnelle de la réplique permet d’inspecter la distribution spatiale et la continuité physique des molécules d’intérêt sans reconstruire laborieusement et fastidieusement les coupes d’artrophine en série. Cette approche peut être utilisée par d’autres chercheurs pour mieux comprendre les relations structure-fonction de synapses spécifiques dans les circuits neuronaux.

Où il s’agit de démêler l’origine des entrées et la nature des éléments postsynaptiques. C’est crucial, mais problématique.