Imagerie et quantification des agrégats protéiques dans les cerveaux de drosophiles génétiquement modifiés

Commençons par des cerveaux de drosophile génétiquement modifiés. Ces cerveaux expriment une protéine mutante marquée fluorescente rouge dans le neurone qui peut se propager à la cellule gliale environnante, exprimant la protéine normale marquée fluorescente jaune, provoquant leur agrégation.

Ajoutez une solution fixatrice qui préserve l’intégrité cellulaire.

Retirez le fixateur et lavez-le avec un tampon.

Ajoutez un réactif anti-décoloration et incubez pour éviter la décoloration des signaux fluorescents.

Transférez les cerveaux sur une lame et retirez l’excès de liquide.

Laissez le cerveau adhérer à la lame.

À l’aide de petits morceaux d’une lamelle comme entretoises, placez une lamelle sur eux. Ajoutez le réactif anti-décoloration et scellez-le.

Sous un microscope confocal, capturez des images en utilisant différentes longueurs d’onde d’excitation pour la fluorescence rouge et jaune.

À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, quantifiez les agrégats de protéines.

La co-localisation de la fluorescence rouge et jaune indique la propagation des protéines mutantes.

Une fois que tous les cerveaux ont été disséqués, transférez le tube de prélèvement dans un nutator à température ambiante et secouez-les pendant environ 5 minutes. Après la période de fixation, retirez la majorité de la solution fixatrice à l’aide d’une pipette P1000 et jetez-la, en faisant très attention de laisser les cerveaux dans les tubes. Cela nécessite une aspiration douce et une observation attentive.

Ensuite, ajoutez 1 millilitre de PBST frais dans le cerveau. Couvrez le tube et laissez-le basculer sur le nutateur pendant environ une minute pour laver le fixateur restant. Ensuite, retirez la solution et répétez cette courte étape de lavage.

Faites suivre les deux courts lavages d’un lavage de 5 minutes, puis de trois lavages de 20 minutes et, enfin, d’un seul lavage de 1 heure. Après le dernier lavage, retirez soigneusement la majeure partie du PBST et plongez les cerveaux dans 30 microlitres de réactif anti-décoloration à base de glycérol. Ensuite, incubez les cerveaux à 4 degrés Celsius dans l’obscurité sans bouger pendant 1 à 24 heures.

Plus tard, retirez les cerveaux du tube de prélèvement à l’aide d’une pointe de pipette émoussée et transférez-les sur une lame de microscope. Ensuite, orientez doucement le cerveau au besoin pour l’imagerie à l’aide d’une pince. Plusieurs échantillons peuvent être montés sur la même lame en rangées séparées.

Ensuite, retirez l’excès de réactif anti-décoloration de la lame à l’aide du coin d’un tissu de laboratoire plié. Ne laissez pas les tissus entrer en contact avec le cerveau. Ensuite, laissez les échantillons dans l’obscurité pendant 5 à 10 minutes pour laisser les cerveaux adhérer à la lame.

Ensuite, prenez de petits morceaux de verre de couverture brisé et placez-les autour du cerveau, couvrant une zone d’environ 19 millimètres carrés. Ensuite, abaissez doucement un verre de couverture de 22 millimètres carrés sur la mosaïque de cerveaux et de verre pour faire un pont. Ensuite, distribuez lentement un réactif anti-décoloration frais sous la lamelle afin qu’il remplisse les espaces vides. Faites-le très soigneusement pour que la cervelle et le verre restent en place. Ensuite, scellez la lamelle avec du vernis à ongles. Tout d’abord, il suffit de l’appliquer dans les coins. Laissez sécher les tampons d’angle 5 à 10 minutes avant de terminer l’étanchéité le long des bords. Les cerveaux doivent être imagés dès que possible.

Imagez les cerveaux montés à l’aide d’un microscope confocal équipé d’un objectif à huile 40x ou 63x pour collecter des coupes z dans la région du cerveau où les transgènes sont exprimés. Ensuite, analysez les données en quantifiant les points dans les tranches z individuelles ou, alternativement, après avoir rendu les tranches en trois dimensions.

Pour quantifier les agrégats mutants de Huntington qui sont bien séparés et ont peu de signal de fond, ouvrez la série z confocale en mode de visualisation 3D. Ensuite, utilisez l’assistant d’analyse pour identifier des points individuels dans un canal sélectionné.

Dans les paramètres, ajustez le seuillage et les filtres pour représenter avec précision tous les agrégats de taille hétérogène en tant qu’objets individuels dans l’image. Ensuite, activez l’option Fractionner les objets sous le préfiltre de traitement binaire pour séparer les agrégats étroitement associés. Les informations quantitatives sur les objets identifiés par le logiciel sont rapportées sous Mesures.

Après avoir compté les points de contrôle, caractérisez-les davantage dans un logiciel d’analyse d’images. Par exemple, prenez des mesures pertinentes des taches ou des surfaces pour obtenir des informations sur le diamètre, le volume ou l’intensité de l’agrégat. Certains agrégats de Huntington de type sauvage peuvent être quantifiés en se déplaçant manuellement dans la pile z et en comptant les points verts qui se distinguent du signal diffus environnant.

Veillez à ne pas compter deux fois les agrégats simples lorsqu’ils apparaissent dans plus d’une tranche. Une autre analyse intéressante consiste à déterminer la fréquence de co-localisation entre les agrégats Huntington Q25-YFP et Huntington Q91-mCherry. Pour ce faire, utilisez le comptage manuel en déplaçant tranche par tranche dans une pile z confocale.