Mesure de l’activité du protéasome dans différents compartiments subcellulaires du cerveau du rat

Commençons par des fractions nucléaires et synaptiques subcellulaires recueillies dans l’amygdale latérale du cerveau de rats témoins et de rats conditionnés par la peur.

Chaque fraction subcellulaire contient des concentrations variables de protéasomes 20S, le noyau catalytique du complexe de protéasomes responsable de la dégradation des protéines cellulaires indésirables.

Ajouter un tampon de dosage contenant de l’ATP et un substrat peptidique fluorogène aux échantillons et incuber.

En présence d’ATP, le protéasome clive le peptide fluorogène, libérant des molécules fluorogéniques libres.

À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez l’intensité de la fluorescence à intervalles réguliers.

Quantifiez la fluorescence en la comparant aux concentrations standard connues de la molécule fluorogénique.

L’intensité de fluorescence est proportionnelle à l’activité du protéasome dans l’échantillon.

L’augmentation de l’activité du protéasome dans la fraction nucléaire des rats conditionnés par la peur suggère des changements dans l’expression des gènes liés à la mémoire, tandis qu’une diminution de l’activité dans la fraction synaptique indique des changements dans l’expression des protéines synaptiques nécessaires au maintien de la mémoire à long terme.

Pour mettre en place le test, préchauffez le lecteur de plaques à 37 degrés Celsius et maintenez-le pendant toute la durée. Réglez l’excitation sur 360 nanomètres et l’émission sur 460 nanomètres. Si la plaque à 96 puits utilisée est claire, réglez la position de l’optique sur le bas. Si une plaque sombre à 96 puits est utilisée, réglez la position de l’optique sur Haut. Programmez une course cinétique avec un temps de 2 heures, en balayant toutes les 30 minutes.

Reconstituez le tampon de dosage 20s 10x fourni dans le kit avec 13,5 millilitres d’eau ultrapure. Ajoutez 14 microlitres de 100 millimolaires d’ATP au tampon maintenant 1x. Cela augmente considérablement l’activité du protéasome dans les échantillons et améliore la fiabilité du dosage. Reconstituez la norme AMC fournie dans le kit avec 100 microlitres de DMSO. Effectuez des étapes à l’aide de la norme AMC dans l’obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, car la norme est sensible à la lumière.

Créez une courbe standard d’AMC à partir d’une série de concentrations d’AMC élevées à faibles. Cette courbe sera utilisée pour l’étalonnage du lecteur de plaques et l’analyse de l’activité du protéasome dans les échantillons homogénéisés. Reconstituez le substrat de protéasome fourni dans le kit avec 65 microlitres de DMSO. Effectuez également cette étape dans l’obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, car le substrat est sensible à la lumière.

Créez ensuite une dilution de 1 à 20 du substrat du protéasome dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, à l’aide d’un tampon de dosage 20 S. Ajoutez une quantité normalisée des échantillons souhaités à une plaque de 96 puits. Exécutez chaque échantillon en double. La quantité d’échantillon nécessaire varie en fonction de la préparation des tissus. Généralement, 10 à 20 microgrammes sont suffisants pour toute fraction subcellulaire.

Amenez le volume du puits d’échantillon à 80 microlitres avec de l’eau ultra-pure. La quantité ajoutée dépend du volume d’échantillon ajouté. Dans deux puits séparés, ajoutez 80 microlitres d’eau seule. Il s’agira des blancs de dosage. Ajouter 10 microlitres de tampon d’analyse 20 S dans chaque puits, y compris les blancs d’analyse. Utilisez un répéteur ou une pipette automatisée pour assurer un volume d’analyse constant dans tous les puits.

Éteignez les lumières ou entrez dans une pièce sombre. Ajoutez les 100 microlitres d’étalons AMC dilués dans un nouveau puits, en utilisant un seul puits pour chaque étalon. Dans l’obscurité, utilisez un répéteur ou une pipette automatisée pour ajouter 10 microlitres de substrat de protéasome dilué dans les puits contenant des échantillons et des blancs de dosage, mais pas la norme AMC. Placez la plaque dans le lecteur de plaques et démarrez le cycle cinétique.