Imagerie du trafic de la protéine GLUT4 dans les neurones hypothalamiques primaires de souris à l’aide de la microscopie à déconvolution

Commence avec des neurones hypothalamiques primaires de souris de type sauvage et CCR5-knock-out cultivés sur des lamelles enrobées de poly-D-lysine dans une plaque multi-puits.

Ces neurones expriment le transporteur de glucose 4 marqué par une protéine fluorescente verte (GFP-GLUT4) dans le cytoplasme.

Transférez les lamelles sur des lames de verre et essuyez doucement l’excès de support pour assurer la stabilité lors de l’acquisition de l’image.

Place une lame sur la platine du microscope à déconvolution avec la lamelle vers le bas.

Visualisez les neurones sous un éclairage en fond clair, puis traitez-les avec la chimiokine CCL5 et l’insuline séquentiellement.

Passez à l’éclairage par fluorescence pour identifier les neurones cibles exprimant GFP-GLUT4 et ajustez les paramètres d’imagerie pour capturer des images fluorescentes en direct.

Dans les neurones de type sauvage, l’insuline et la CCL5 se lient respectivement au récepteur de l’insuline et au CCR5, activant les voies de signalisation en aval qui entraînent la translocation membranaire GFP-GLUT4.

Dans les neurones knock-out CCR5, CCL5 ne parvient pas à se lier, ce qui entraîne une réduction de la translocation GFP-GLUT4.

Capturez les images et appliquez un algorithme de déconvolution pour réduire la lumière floue, améliorant ainsi la clarté et la résolution de l’image.

Pour préparer les cellules à l’imagerie en direct, retirez soigneusement les lamelles à l’aide de pinces à l’aide d’une pince et placez-les avec précaution sur la lame de verre. Ensuite, retirez l’excès de fluide avec des lingettes délicates en les pliant deux fois et en les plaçant soigneusement sur la lamelle sans la déplacer.

Il est essentiel d’enlever l’excès de fluide pour éviter tout mouvement inutile sur la lamelle.

Ensuite, traitez les échantillons de cellules sélectionnés avec du CCL5 à 10 nanogrammes par millilitre ou de l’insuline à 10 unités par millilitre pendant une minute. Ensuite, ajoutez 1,5 microlitre d’insuline diluée sur le bord des lamelles. Ensuite, ajoutez de l’huile d’immersion sur un objectif à 60 fois grossissement de 1,52 NA.

Ensuite, placez les lamelles sur la platine du microscope à déconvolution avec les lamelles vers le bas et correctement fixées. Utilisez un éclairage en fond clair ou à fluorescence pour identifier les cellules cibles. Ensuite, ajustez la mise au point jusqu’à ce que les cellules cibles soient clairement observées. Ne déplacez pas la lentille de l’objectif en dehors de la zone de la lamelle pour éviter des rayures inutiles.

Ensuite, identifiez GFP-GLUT4 par le signal GFP. Identifiez ensuite les cellules cibles souhaitées pour l’acquisition d’images. Par la suite, définissez les paramètres expérimentaux appropriés sur chaque cellule cible, notamment le nombre de pixels, la longueur d’onde d’excitation, le pourcentage de transmission, le temps d’exposition, l’épaisseur de la pile, l’intervalle de temps et le temps total d’imagerie. Ajustez le paramètre d’exposition à environ 2 000 à 3 000 points pour obtenir une intensité de pixel maximale.

Pour minimiser le photoblanchiment par fluorescence, réduisez autant que possible le pourcentage de transmission de la lumière d’excitation, tout en maintenant le temps d’exposition inférieur à 1 seconde. Réglez les limites supérieure et inférieure de l’empilement z sur chaque cellule cible en déplaçant la platine du microscope jusqu’à ce que le haut et le bas de la cellule cible soient tous deux légèrement flous.