Analyse de la libération et de la clairance du glutamate au niveau d’une synapse d’un seul neurone dans une tranche de cerveau de souris

Commençons par une configuration d’électrophysiologie contenant une tranche de cerveau antérieur de souris immergée dans un aCSF oxygéné.

Le LCR contient un inhibiteur des canaux ioniques qui inhibe sélectivement les canaux ioniques sodiques, empêchant ainsi l’excitation neuronale induite par le sodium.

Les neurones corticaux expriment des protéines fluorescentes de détection du glutamate.

Localisez un seul bouton axonal de neurone présynaptique capable de libérer du glutamate, un neurotransmetteur excitateur, au niveau de la synapse, une jonction où il se connecte aux neurones postsynaptiques.

Positionnez une électrode de stimulation près de ce bouton et appliquez des courants dépolarisants.

Cela excite le neurone présynaptique, provoquant un afflux d’ions calcium et facilitant la libération de glutamate.

Démarrez l’enregistrement de l’intensité de fluorescence autour du bouton sélectionné.

Le glutamate libéré interagit avec les protéines capteurs et les récepteurs sur les neurones post-synaptiques.

Pendant ce temps, éclairez la zone sélectionnée avec une lumière laser, provoquant la fluorescence des protéines du capteur liées au glutamate ; une intensité de fluorescence croissante indique la libération de glutamate.

Au fil du temps, le glutamate se dissocie des protéines du capteur et pénètre dans l’astrocyte, provoquant une diminution de l’intensité de la fluorescence, indiquant la clairance du glutamate.

Pour visualiser la libération et l’élimination du glutamate à l’aide des entraînements du microscope XY, placez le bouton positif du capteur de glutamate testé près du centre du champ de vision. Après avoir arrêté l’acquisition, cliquez sur l’image avec le bouton gauche de la souris pour déterminer la position XY du centre du bouton de repos. Les coordonnées XY du curseur défini seront affichées.

À l’aide des données d’étalonnage, calculez les coordonnées du site où le faisceau laser doit être envoyé pour l’excitation de la fluorescence du capteur de glutamate, en utilisant les formules indiquées. Pour créer une séquence à un point dans le logiciel de contrôle laser, sélectionnez point dans la zone Ajouter à la séquence de la page Séquence du logiciel de contrôle laser et réglez les exécutions et le délai d’exécution sur 0 et la séquence à exécuter à TLL. Cliquez ensuite sur Démarrer la séquence.

Dans le logiciel de contrôle de l’appareil photo, sélectionnez les paramètres d’imagerie appropriés, puis sélectionnez Démarrer externe pour le mode de déclenchement. Cliquez sur Prendre un signal dans le logiciel de contrôle de l’appareil photo. Ensuite, lancez le protocole expérimental établi pour le dispositif de déclenchement, et mettez en œuvre l’essai du protocole expérimental avec le calendrier approprié afin que la caméra acquière 400 images avec une fréquence de 2,48 kilohertz au cours d’un essai avec une fréquence de répétition de 0,1 hertz ou moins.

Pour identifier les synapses pathologiques, activez les routines d’élévation et calculez la moyenne et l’écart type de l’intensité de fluorescence pour la région d’intérêt sélectionnée au repos. Déterminez et boxez la surface occupée par les pixels dont l’intensité de fluorescence au repos est supérieure à la moyenne plus 3 écarts-types, et déterminez un diamètre virtuel en microns, en supposant une forme circulaire de l’aire du super seuil.

Tracez l’intensité de fluorescence en fonction du temps en fonction du temps en représentant la différence entre la valeur réelle de l’intensité de fluorescence et la valeur de l’intensité de fluorescence au repos, divisée par la valeur de l’intensité de fluorescence au repos. Déterminez l’amplitude maximale de la réponse de fluorescence. Effectuez un ajustement monoexponentiel pour la décroissance à partir du pic de la réponse de fluorescence, et déterminez la constante de temps de décroissance, tau d.

Pour estimer l’amplitude maximale à une synapse donnée, sélectionnez le pixel avec le changement le plus élevé de l’intensité de fluorescence, qui est le meilleur indicateur de la charge de glutamate présentée à la machinerie de clairance de la synapse.