Visualisation de la synaptogenèse des neurones granulaires cérébelleux à différents stades de développement

Commencez par des coupes de tissu cérébral préfixées prélevées aux stades postnatals précoces et tardifs de souris.

La tranche contient des neurones granulaires cérébelleux, ou CGN, exprimant une protéine fluorescente.

À l’aide d’un microscope confocal, faites la mise au point sur un seul CGN fluorescent.

Capturez des images z-stack à différentes profondeurs pour créer une vue tridimensionnelle du neurone.

À l’aide d’un logiciel d’imagerie, tracez les neurites ou les longues projections des neurones, y compris les dendrites et les axones.

Mesurez la longueur des dendrites entre le corps cellulaire et son extrémité.

Analysez la formation des griffes dendritiques, des structures spécialisées aux extrémités des dendrites où les signaux d’autres neurones sont reçus.

Évaluez également la surface et le volume du neurone.

Au stade postnatal précoce, les neurones présentent un nombre accru de dendrites, sans formation de griffes.

Pendant ce temps, au stade postnatal tardif, il y a moins de dendrites, mais leur longueur et le nombre de griffes augmentent.

Ainsi, avec l’âge, les CGN subissent une synaptogenèse et forment des connexions avec d’autres cellules pour la transmission du signal.

Pour étudier la morphologie de CGN électroporés uniques à partir de coupes cérébrales sagittales du petit expérimental, prenez des images de pile z à 0,5 micromètre par pile sur un microscope confocal. Imagez une cellule par fenêtre d’image pour permettre une analyse d’image et une reconstruction 3D faciles. Analysez la longueur des neurites et la formation des griffes dendritiques à l’aveugle à l’aide d’un simple traceur de neurite.

Téléchargez des images d’empilement monocanal de CGN électroporés dans Fidji, et cliquez sur Plugins, Segmentation et Simple Neurite Tracer. Sélectionnez Créer une visionneuse 3D dans le menu déroulant. Faites défiler jusqu’à la base d’une dendrite se connectant à la cellule soma, et commencez un bain en cliquant sur la jonction. Tracez manuellement le chemin en cliquant sur les sections où le signal de remplissage de cellule est le plus brillant et en appuyant sur Y pour conserver le tracé.

Tracez jusqu’à la fin de la dendrite et confirmez le chemin en appuyant sur F. Sinon, tracez jusqu’à la base de la griffe. Ensuite, tracez la griffe de la base de la structure jusqu’à la fin du neurite le plus long. Tracez les branches secondaires et tertiaires en maintenant la touche Ctrl enfoncée sous Windows ou Alt sur Mac OS et en cliquant sur le chemin d’accès. Confirmez le chemin d’accès en appuyant sur F. Observez que les mesures des traces sont visibles dans une fenêtre séparée. Additionnez toutes les tailles des branches de griffes pour obtenir la longueur totale de chaque griffe.