Identification de sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes de souris par traçage fluorescent

Placez un tissu rétinien isolé d’une souris transgénique avec des cellules ganglionnaires rétiniennes marquées par fluorescence, ou RGC, dans une chambre d’enregistrement.

L’information visuelle est relayée aux CGR, dont les axones la transmettent au cerveau via le nerf optique.

Les sous-types RGC se distinguent par les motifs ramifiés de leurs dendrites, qui se stratifient en sous-couches à l’intérieur de la couche rétinienne interne.

Aplatissez le tissu rétinien et fixez-le à l’aide d’un ancrage tissulaire.

Transférez la chambre sur une platine de microscope et perfuser une solution oxygénée pour maintenir la viabilité du CGR.

À l’aide de l’éclairage infrarouge, identifiez les CGR fluorescents.

Positionnez une pipette contenant un traceur fluorescent sur un RGC. Appliquez une

pression positive pour éviter le colmatage.

Passez à la pression négative, en aspirant la membrane dans la pipette pour former un joint. Appliquez une

aspiration pour rompre la membrane, en établissant une configuration de cellules entières qui facilite la diffusion du traceur dans les dendrites.

Observer la morphologie et la stratification dendritiques pour identifier les sous-types de CGR.

Lavez la rétine dans la solution extracellulaire oxygénée et transférez-la dans une chambre d’enregistrement à fond de verre à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Après cela, utilisez des pinces pour aplatir soigneusement le tissu avec la couche photoréceptrice vers le bas. Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette. Et ancrez le tissu à l’aide d’un anneau en platine avec une maille en nylon. Remplissez ensuite la chambre avec la solution extracellulaire oxygénée et montez-la sur une platine de microscope. Perfuser le tissu avec la solution extracellulaire oxygénée à raison de 2 à 4 millilitres par minute.

Pour vous préparer à cette procédure, tirez des micro-pipettes en verre pour des enregistrements électrophysiologiques à l’aide d’un extracteur de micro-pipettes. Observez la couche de cellules ganglionnaires à l’aide de l’optique IR-DIC. Ensuite, identifiez la GFP et les cellules ganglionnaires à l’aide de l’épifluorescence à environ 480 nanomètres. Ensuite, localisez la pipette remplie de solution intracellulaire dans DIC. Appliquez une légère pression positive et mettez à zéro tout décalage de tension sur l’amplificateur.

Ensuite, abaissez la micropipette en verre sur une cellule GFP positive et appliquez les étapes de commande de tension de test pour surveiller la résistance du joint. La pression négative doit former un joint Giga ohm entre la pipette et la membrane cellulaire. Après avoir formé un joint stable, rompez la membrane en appliquant de brèves impulsions de pression négative pour accéder à l’ensemble de la cellule. Attendez une à deux minutes que les dendrites de la cellule se remplissent de traceur fluorescent.