Imagerie par fluorescence de la dynamique calcique synaptique dans un modèle in vitro de sclérose latérale amyotrophique

Prenez des neurones corticaux primaires de rongeurs cultivés sur une boîte à fond de verre recouverte de support.

Ces cellules expriment une protéine associée à la SLA codée génétiquement et un biocapteur de calcium.

Remplacez le média par un tampon à faible teneur en chlorure de potassium.

Incuber pour maintenir l’activité neuronale au repos et les niveaux de calcium de base.

Montez la parabole sur une platine de microscope confocal et positionnez la tubulure de perfusion.

À l’aide d’un éclairage en champ clair, concentrez-vous sur les neurones, puis passez à l’imagerie par fluorescence.

À l’aide du laser du microscope, excitez le biocapteur et enregistrez l’émission de fluorescence pour déterminer les niveaux de calcium intracellulaire de base.

Ensuite, perfuser le plat avec un tampon de chlorure de potassium élevé.

La forte concentration de potassium dépolarise les neurones, ouvrant des canaux calciques voltage-dépendants au niveau des terminaisons présynaptiques. Cela permet l’afflux de calcium, qui initie l’activité synaptique neuronale.

L’augmentation du calcium intracellulaire se lie au biocapteur, provoquant un changement de conformation qui améliore la fluorescence.

Continuer l’enregistrement de la fluorescence pour mesurer en temps réel les changements dans les niveaux de calcium intracellulaire, révélant l’activité synaptique neuronale.

48 heures après la transfection avec GCaMP6m, incuber les neurones corticaux primaires des rongeurs avec de l’ACSF à faible teneur en chlorure de potassium pendant 15 minutes. Montez ensuite la parabole sur la plate-forme d’imagerie et visualisez la fluorescence de GCaMP6m à l’aide d’un filtre FITC et d’un objectif 20 fois ou 40 fois. Après avoir sélectionné le champ d’imagerie et engagé une mise au point parfaite, prenez une seule image fixe avec des canaux FITC en fond clair et des marqueurs de fluorescence pour marquer les limites neuronales.

Ensuite, lancez « Run now » dans le logiciel d’acquisition et effectuez l’enregistrement basal pendant trois à cinq minutes. Ensuite, perfuser l’ACSF contenant 50 millimolaires de chlorure de potassium dans les neurones, comme démontré précédemment, et enregistrer pendant cinq minutes. Lorsque l’acquisition de l’image s’arrête, enregistrez l’expérience et procédez à l’analyse des données à l’aide du logiciel confocal.

Pour l’analyse d’images, ouvrez les images en accéléré et le logiciel confocal, et alignez les images en cliquant sur Image, puis sur Traitement, puis sur Aligner le document actuel. Sélectionnez ensuite Aligner sur le premier cadre. Sélectionnez les régions d’intérêt le long des neurites à l’aide de l’outil de sélection de ROI, et marquez également un ROI représentant l’intensité de la fluorescence de fond. Ensuite, lancez la fonction de mesure à partir du panneau de mesure du temps pour mesurer la fluorescence brute au fil du temps pour les zones d’intérêt sélectionnées. Après la mesure, exportez les intensités de fluorescence brutes vers le tableur.