Imagerie confocale tridimensionnelle à haute résolution de la barrière hémato-encéphalique dans une section de cerveau de souris

Commencez avec un logiciel de microscope confocal et définissez les paramètres d’acquisition d’image.

Ensuite, prenez une section de cerveau de souris montée sur une lame de verre. Cette section est colorée avec des anticorps ciblant les composants de la barrière hémato-encéphalique.

La barrière hémato-encéphalique est une interface cellulaire sélective entre la circulation sanguine et le cerveau pour maintenir l’homéostasie.

Appliquez une goutte d’huile d’immersion avec l’indice de réfraction souhaité sur la lamelle de recouvrement pour optimiser la résolution et minimiser la réfraction de la lumière.

Placez la lame sur la platine du microscope et utilisez la lampe d’épifluorescence pour visualiser l’échantillon.

À l’aide des filtres appropriés, localisez les noyaux colorés au DAPI et identifiez le segment capillaire pour l’imagerie.

Démarrez le balayage en direct et ajustez les paramètres de chaque canal fluorescent pour capturer des images de haute qualité.

Enfin, définissez les points de départ et d’arrivée de l’acquisition de la pile Z afin de générer une image tridimensionnelle de la barrière hémato-encéphalique.

Dans le menu Acquisition du logiciel qui contrôle le microscope, définissez les paramètres d’acquisition d’image. Dans le menu déroulant de la taille de l’image, sélectionnez une valeur de 1 024 x 1 024 pixels. Modifiez la taille des pixels à une valeur comprise entre 200 et 300 nanomètres en ajustant la valeur du menu Zoom.

Dans le menu déroulant Vitesse d’acquisition, sélectionnez une valeur de 400 hertz. Ensuite, dans le menu Paramètres système, sélectionnez la profondeur de pixels et remplacez la valeur par 12 bits. Ensuite, dans le logiciel du microscope, dans l’onglet Acquisition, activez l’option d’acquisition séquentielle de l’image. Réglez l’épaisseur de la section optique sur une valeur comprise entre 0,75 et 1 micromètre pour chaque voie, en modifiant la valeur dans le menu Sténopé.

Ajoutez une goutte d’huile d’immersion avec un indice de réfraction de 1,52 sur le dessus de la lamelle, avec la section du cerveau pour correspondre à l’indice de réfraction de la lamelle en verre et de l’objectif. Ensuite, placez l’échantillon dans le microscope et allumez la lampe épifluorescente pour visualiser l’échantillon à l’aide des jumelles du microscope. Ensuite, appuyez sur le bouton pour démarrer le mode de balayage en direct. Pendant le balayage, ajustez le gain et l’intensité laser pour chaque canal afin de maximiser la plage dynamique des images et d’éviter la saturation des pixels. Ensuite, établissez les sections de début et de fin pour effectuer des empilements Z optiques qui couvrent tout le volume du capillaire et utilisez une taille de pas de 0,45 micromètre.

Il est important de noter que tous les paramètres d’acquisition doivent être identiques pendant la session d’imagerie.