Quantification de l'architecture vasculaire cérébral en utilisant la microscopie à deux photons dans un modèle de souris de la neuro-inflammation induite par le VIH

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les changements dans les réseaux capillaires corticaux après une exposition prolongée à la virotoxine du VIH, tat. Cette méthode peut aider à examiner les principaux changements dans la morphologie capillaire corticale qui peuvent contribuer à la pathogenèse des troubles neurocognitifs associés au VIH. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification physiologiquement précise de plusieurs paramètres morphologiques capillaires.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la pathogenèse des troubles neurocognitifs associés au VIH. Il peut également être appliqué à d’autres maladies dans lesquelles des changements vasculaires se produisent, comme la maladie d’Alzheimer. Commencez cette procédure en appliquant du gel lacrymal artificiel sur les yeux d’une souris anesthésiée.

Ensuite, rasez-lui la tête à l’aide d’un rasoir électrique. Ensuite, appliquez une solution de povidone iodée pour stériliser le cuir chevelu et laissez-le sécher. Au microscope optique, retirez le cuir chevelu de l’animal, afin d’exposer complètement les os pariétaux, les os frontaux caudaux et le point bregma.

Appliquez une petite quantité d’une solution de chlorure ferrique à dix pour cent sur le crâne, afin de sécher la membrane pour un retrait facile. Par la suite, retirez la membrane séchée, en grattant doucement le crâne avec la pince. Ensuite, appliquez une fine couche de colle autour de la fenêtre de la plaque de tête.

Appuyez doucement la plaque de tête contre le crâne de la souris, pour garder la zone d’intérêt au centre de la fenêtre. Ensuite, appliquez une goutte de ciment dentaire sur la plaque de tête, pour polymériser la colle. Ensuite, appliquez une fine couche de colle le long du bord de la fenêtre de la plaque de tête pour créer un réservoir pour retenir la solution saline.

Une fois la colle sèche, vissez la plaque de tête dans le harnais de la plaque de tête de souris. Retirez toute colle de la fenêtre de la plaque de tête à l’aide d’un foret fixé à une perceuse à micro-torp, réglée à 6 000 tr/min. Arrêtez-vous toutes les 10 à 15 secondes pour éviter la surchauffe du crâne de la souris.

Après cela, à l’aide d’un nouveau foret, commencez à amincir le crâne à l’aide d’une perceuse à micro-torp réglée à 4 000 tr/min. Déplacez doucement la perceuse sur le crâne sans pression directe vers le bas. Une fois le crâne complètement aminci, détachez la souris du support et placez-la sur son dos.

Collez doucement les deux membres postérieurs pour exposer clairement le milieu des cuisses. Ensuite, retirez les poils sur les deux cuisses médiales et désinfectez le site chirurgical en recouvrant les cuisses avec de la povidone iodée. Ensuite, retirez délicatement la peau de la partie médiale de la cuisse droite, au-dessus de la veine fémorale et de l’artère.

Appliquez environ trois à cinq gouttes de solution saline à 0,9 % sur le site chirurgical. Ensuite, séparez la veine fémorale de l’artère, en disséquant brusquement en faisceau neurovasculaire fémoral. Maintenant, placez deux morceaux de suture chirurgicale de trois centimètres, sous l’artère fémorale, à environ un centimètre de distance.

Tournez la suture supérieure dans le sens des aiguilles d’une montre pour créer un garrot vasculaire qui aidera à prévenir une perte de sang excessive pendant le cathétérisme. Par la suite, faites une petite incision dans l’artère fémorale à l’aide de ciseaux à ressort, où le cathéter sera ensuite inséré pour surveiller les paramètres physiologiques de la souris. Dans cette procédure, retirez la peau de la cuisse médiale gauche de la souris.

Ensuite, localisez la veine fémorale. À l’aide d’une seringue d’un millilitre et d’une aiguille de calibre 30, prélevez 130 microlitres de la solution de colorant fluorescent. Injectez lentement 100 microlitres de colorant dans la veine fémorale.

Après avoir retiré l’aiguille, appliquez une pression douce et constante sur le site d’injection pour arrêter tout saignement et laissez le colorant circuler pendant cinq minutes. Ensuite, fermez le site chirurgical avec des sutures. Retournez délicatement la souris sur le ventre et placez-la dans le harnais de la plaque de tête de souris.

Pour l’imagerie à deux photons in vivo, déplacez l’appareil chirurgical vers le microscope à deux photons et assurez-vous de maintenir le niveau d’anesthésie de l’animal. Ensuite, placez une petite quantité de solution saline à 0,9 % dans le réservoir de la plaque de tête et dans la partie inférieure de l’objectif du microscope afin qu’il entre en contact avec la solution saline. Ensuite, localisez la zone d’intérêt à l’aide de l’objectif de visualisation en fond clair.

Ensuite, commencez l’imagerie à deux photons. Localisez un lit capillaire sur l’écran de visualisation et agrandissez également cette zone à l’aide du zoom optique. Acquérez des images des capillaires à l’aide du logiciel d’imagerie à deux photons.

Pour l’imagerie ex vivo à deux photons, faites une incision dans le cuir chevelu entre les os interpariétaux et les os frontaux de la souris décapitée. Fixez la peau sur les côtés du crâne avec l’index et le pouce, placez les ciseaux extra fins sous l’os interpariétal médial et coupez le crâne le long de la suture sagittale jusqu’à environ trois millimètres après le point de bregma. Ensuite, séparez le crâne du cerveau et retirez soigneusement toutes les méninges de la surface du cerveau avec la pince.

Faites glisser doucement la pince sous le cerveau pour le libérer du crâne. Ensuite, placez le cerveau dans une matrice cérébrale, spécifique pour les souris, et lavez-le avec des gouttes d’ACSF. Ensuite, retirez une section de cerveau coronaire d’un millimètre d’épaisseur.

Placez la section du cerveau sur une lame de verre concave contenant de l’ACSF, avec la partie la plus antérieure de la section vers le haut. Ensuite, couvrez délicatement la tranche de cerveau avec une lamelle en verre. Transférez la lame sur la platine du microscope et placez une petite quantité de solution saline à 0,9 % sur la lamelle.

Abaissez l’objectif du microscope jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la solution saline. Par la suite, localisez la ligne médiane du cerveau à l’aide de l’objectif à champ clair. Maintenant, commencez l’imagerie à deux photons et localisez à nouveau la ligne médiane à l’aide de l’objectif 25x.

Pour ce faire, vous recherchez la fissure longitudinale à la surface corticale de la section coronale. Ensuite, placez le bord droit de l’écran d’imagerie sur la ligne médiane et déplacez l’écran du visualiseur latéralement sur trois images complètes. Localisez la profondeur à laquelle les capillaires sont à peine visibles sur l’écran de visualisation.

Ensuite, abaissez le plan de mise au point de 20 micromètres supplémentaires pour déterminer le haut de la pile z. Réglez l’épaisseur de l’image sur un micromètre. Abaissez l’écran de visualisation de 100 micromètres et ajustez la puissance laser de manière à ce que moins d’un pour cent des pixels soient sursaturés.

Enfin, acquérez la pile z. Sur cette figure, une fois que la tranche de cerveau a été préparée, une zone d’imagerie à environ 1,5 millimètre de la ligne médiane est localisée. Une pile z de 100 micromètres produit une image tridimensionnelle utilisée pour l’analyse dans le logiciel analytique Amira.

Le réseau capillaire est ensuite tracé manuellement en plaçant des nœuds au début et à la fin d’un capillaire ou à tout endroit où un capillaire se ramifie dans un autre. Cela produit une image entièrement squelettisée à partir de laquelle les paramètres morphologiques sont automatiquement extraits. Le nombre de nœuds capillaires, de segments, la longueur moyenne des segments et la longueur totale des segments peuvent être extraits à l’aide de l’imagerie ex vivo à deux photons de tranches de cerveau de souris.

Ici, une image bidimensionnelle des réseaux capillaires est produite par l’imagerie in vivo, dans laquelle le diamètre capillaire peut être extrait et le volume capillaire total peut être calculé à l’aide du diamètre capillaire et de la longueur totale du segment obtenue à partir de l’imagerie ex vivo. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en trois heures et demie si elle est correctement exécutée. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important d’agir rapidement tout en maintenant un niveau d’anesthésie constant, car l’isoflurane peut provoquer une vasodilatation des capillaires corticaux, biaisant ainsi les données.

Au cours de cette procédure, d’autres paramètres capillaires peuvent être obtenus, tels que la vitesse des globules rouges ou le flux de globules rouges, ce qui peut permettre de mieux comprendre les changements pathogènes observés dans les troubles neurocognitifs associés au VIH et d’autres maladies neurodégénératives. Bonne chance dans vos expériences.