Protocoles de préparation des échantillons, d'imagerie et d'analyse pour la microscopie à balayage en lame de couteau

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la préparation d'échantillons biologiques pour la coupe et l'imagerie au microscope à balayage par arête de lame, ou KESM, ainsi que la visualisation des données d'empilement d'images obtenues. Cela est réalisé en fixant, en colorant et en incluant d'abord le tissu afin de le préparer pour l'imagerie au KESM. La deuxième étape de la procédure consiste à configurer le KESM et à effectuer la coupe et l'imagerie à l'aide du logiciel de commande automatisé.

Les images obtenues sont ensuite enregistrées, débruitées et recadrées. La dernière étape consiste à charger et explorer les jeux de données dans un atlas basé sur le web et un logiciel de visualisation 3D. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant l'organisation neuronale et vasculaire à l'échelle du cerveau entier avec une résolution submicrométrique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de mesoscopie, telles que la microscopie électronique en balayage par blocs sériés, est qu'elle permet d'imaginer des volumes beaucoup plus grands, bien qu'à une résolution inférieure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la connectomique et des neurosciences en général. Elle peut fournir des informations sur l'organisation structurelle du cerveau et peut également être appliquée à d'autres systèmes d'organes tels que le poumon et le rein.

Pour commencer cette procédure, le cerveau de souris disséqué est placé dans un bocal en verre contenant la solution de Golgi-Cox. Placer le bocal en verre dans une boîte hermétique à la lumière, à température ambiante, pendant 10 à 16 semaines. Une étape de fixation séparée n'est pas nécessaire, car la solution de Golgi-Cox agit comme un fixateur.

Après 10 à 16 semaines, rincer le cerveau dans de l'eau déionisée pendant la nuit, à l'abri de la lumière, le jour suivant. Plonger le cerveau rincé dans une solution d'hydroxyde d'ammonium à 5 % dans de l'eau déionisée pendant sept à dix jours, à l'abri de la lumière et à température ambiante. Après sept à dix jours, rincer à nouveau le cerveau dans de l'eau déionisée à température ambiante pendant quatre heures. Ensuite, déshydrater le cerveau à l'aide d'une série progressive d'alcools éthyliques, en laissant le tissu dans chaque solution pendant 24 heures : 50 % d'éthanol et 70 % d'éthanol à quatre degrés Celsius, puis 85 % d'éthanol.

Trois changements d’éthanol à 95 % et quatre à cinq changements d’éthanol à 100 % à température ambiante. Ensuite, placer le cerveau déshydraté dans de l’acétone et effectuer trois à quatre changements par jour pendant un jour. Après cela, placer le cerveau toute la nuit au réfrigérateur dans chacun de ces mélanges d’aite et d’acétone aux rapports d’un à deux, d’un à un et de deux à un.

Enfin, placer le cerveau dans de l'alcool à 100 % au réfrigérateur et effectuer trois changements, chaque fois pendant la nuit. Le cerveau traité est ensuite inclus dans de l'alcool à 100 % et chauffé à 60 degrés Celsius pendant trois jours. Enfin, le bloc d'échantillon polymérisé est fixé sur l'anneau métallique à l'aide de résine époxy, et les côtés du bloc sont éventuellement parés pour commencer cette procédure.

Vérifiez que la souris est profondément anesthésiée et ne réagit pas à une pression sur l'orteil. Ensuite, perfusez la souris transcardialement en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante, suivie d'un paraformaldéhyde froid à 4 % tamponné au phosphate. Puis, perfusez la souris avec une solution de 0,1 % de thi et de colorant dans de l'eau déionisée.

Après cela, placer le corps dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, retirer le cerveau du crâne et le placer dans une solution fraîche de thionine à 0,1 %. Laisser le cerveau à quatre degrés Celsius pendant sept jours.

Après sept jours, fixer et déshydrater le cerveau à l'aide d'une série progressive d'alcools éthyliques. Sur une période de six semaines, passer trois à cinq jours dans de l'éthanol à 50 %, sept à dix jours dans de l'éthanol à 70 %, environ deux semaines chacun dans de l'éthanol à 85 % et 95 %, puis le temps restant dans de l'éthanol à 100 %. Après trois changements d'acétone à température ambiante, le cerveau est inclus dans un plastique erudite dans une étuve à 60 degrés Celsius.

Pour commencer la procédure de coloration du réseau vasculaire avec de l'encre de Chine, confirmez, à l'absence du réflexe de retrait des orteils, que la souris est profondément anesthésiée. Ensuite, perfusez la souris par voie transcardiale à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante, suivie d'une solution de formol tamponnée neutre à 10 % à température ambiante. Une perfusion corporelle totale avec du sérum physiologique et du fixateur est nécessaire pour éliminer le sang du système cardiovasculaire et fixer les tissus.

Ensuite, perfuser la souris avec 3,0 ccs d'encre de Chine non diluée. L'utilisation d'encre de Chine est nécessaire afin de remplir complètement la vascularisation du système cardiovasculaire. Après son prélèvement chez la souris, le cerveau obtenu est déshydraté à l'aide d'une série d'alcools éthyliques à concentration croissante, puis inclus dans un plastique érudite.

Après avoir suivi le protocole indiqué précédemment pour configurer le KESM en vue de l'imagerie, allumez la caméra, l'éclairage et la platine, puis relevez le couteau et l'objectif. Ensuite, installez l'anneau contenant l'échantillon. Abaissez ensuite l'objectif et le couteau.

Prendre les mesures des dimensions de l'échantillon. Ensuite, créer un fichier de configuration pour le contrôleur de la platine KESM. Deux applications : soulever le couteau et l'objectif du KESM avant d'initialiser la platine.

Démarrez le contrôleur de la platine KESM deux et initialisez la platine. Abaissez ensuite le couteau et l'objectif, puis mettez en marche la pompe. Mettez au point l'objectif et la caméra en tournant le bouton de mise au point du train optique et en ajustant le champ de vision de la caméra par rapport au bord du couteau.

Cliquez étape par étape pour vérifier les premières étapes de l'acquisition d'images et de la sectionnement. Ensuite, cliquez sur « go ». Pour démarrer l'acquisition d'images et le sectionnement en vue du traitement d'images.

Exécutez le processeur de pile KESM pour supprimer l'artéfact d'éclairage et normaliser l'intensité de fond de toutes les images. Répétez cette opération pour tous les sous-dossiers de données. Pour visualiser les données à l'aide de l'atlas cérébral KESM, rendez-vous sur ce site web et sélectionnez l'atlas approprié afin d'accéder à une profondeur différente.

Sélectionnez dans le menu déroulant la profondeur à atteindre à chaque étape, puis cliquez sur le signe plus pour augmenter ou sur le signe moins pour diminuer la profondeur en Z. D'autres options comprennent le zoom avant ou la navigation à l'aide de l'atlas cérébral KESM. Utilisez le menu déroulant pour régler le nombre de superpositions et l'intervalle de superposition afin de visualiser les données à l'aide du laboratoire VIS.

Lancez l'application et créez un nouveau projet. Le projet doit inclure la composition 3D à partir de fichiers 2D, la définition de la matrice mondiale, l'arithmétique un et l'affichage 3D connecté. Dans cet ordre, les paramètres appropriés doivent être définis comme indiqué dans l'affichage 3D tout en appuyant sur le bouton droit de la souris.

Déplacez la souris pour ajuster les régions seuil pouvant être recadrées. L'orientation a changé, l'illumination a été modifiée ou l'arrière-plan a été activé ou désactivé. Les résultats représentatifs de la KESM sont illustrés par les courtes vidéos suivantes, qui montrent d'abord des visualisations en volume de la KESM, des piles complètes de données au sépia pour l'ensemble de données vasculaires, en commençant par un agrandissement des données vasculaires ayant une largeur d'environ 100 microns.

Ce deuxième extrait de KESM, données au sépia du cerveau entier, montre trois vues standard de la vascularisation du cerveau entier de souris, échantillonnées à partir de données haute résolution avec une largeur d'environ 10 millimètres. La vue sagittale, la vue coronale et la vue horizontale, ainsi qu'un survol de la section coronaire. KESM. Les données entières du cerveau de souris colorées par la méthode de Golgi sont illustrées dans cet extrait vidéo qui montre un survol le long des trois plans de coupe différents, commençant par la vue du bloc, suivie de la vue sagittale, de la vue coronale et de la vue horizontale.

Voici d'autres détails concernant les données cérébrales entières de souris GoGy obtenues par KESM. Cette première vidéo montre le cervelet et les cellules de Purkinje. Cette deuxième vidéo présente le cortex et les cellules paramétales.

Enfin, KESM. Les données de NLE de cerveau entier sont illustrées dans ces deux extraits vidéo. On voit d'abord un gros plan des données de NLE.

Ce deuxième extrait montre trois vues standard des données Nle du cerveau entier de la souris, sous-échantillonnées à partir de données haute résolution. Une coupe transversale est également présentée pour une visualisation claire des structures internes après ce développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les réseaux neuronaux et vasculaires dans le cerveau de la souris.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons, de l'acquisition d'images et de l'analyse des données pour le microscope à balayage par lame tranchante.