Protocoles de préparation des échantillons, d'imagerie et d'analyse pour la microscopie à balayage en lame de couteau

L’objectif général de cette procédure est de démontrer la préparation d’échantillons biologiques pour le sectionnement et l’imagerie sous le microscope à balayage à tranchant de couteau, ou KESM, et la visualisation des données d’empilement d’images résultantes. Ceci est accompli en fixant, colorant et intégrant d’abord le tissu pour le préparer à l’imagerie sous le KESM. La deuxième étape de la procédure consiste à configurer le KESM et à effectuer le sectionnement et l’imagerie à l’aide du logiciel de contrôle automatisé.

Les images résultantes sont ensuite débruitées, enregistrées et recadrées. La dernière étape consiste à charger et à explorer les ensembles de données dans un atlas en ligne et un logiciel de visualisation 3D. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’ensemble du niveau du cerveau, l’organisation neuronale et vasculaire à une résolution inférieure au micromètre.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux Mesos existants, tels que l’électromicroscopie à balayage en série, est qu’elle permet d’imager des volumes beaucoup plus importants, bien qu’à une résolution plus faible. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la connectomique et des neurosciences en général. Cette méthode peut donner un aperçu de l’organisation structurelle du cerveau, et elle peut également être appliquée à d’autres systèmes organiques tels que les poumons et les reins.

Pour commencer cette procédure, le cerveau de souris disséqué est placé dans un bocal en verre contenant la solution de Golgi Cox. Placez le bocal en verre dans une boîte étanche à la lumière à température ambiante pendant 10 à 16 semaines. Une étape de fixation distincte n’est pas nécessaire puisque la solution Golgi Cox agit comme un fixateur.

Après 10 à 16 semaines, rincez le cerveau dans de l’eau déminéralisée pendant la nuit dans l’obscurité le lendemain, plongez le cerveau rincé dans une solution d’hydroxyde d’ammonium à 5 % dans de l’eau déminéralisée pendant sept à 10 jours à l’obscurité à température ambiante. Après sept à 10 jours, rincez à nouveau le cerveau dans de l’eau déminéralisée à température ambiante pendant quatre heures. Ensuite, déshydratez le cerveau à l’aide d’une série graduée d’alcools éthyliques, en le laissant dans chaque solution pendant 24 heures, 50 % d’éthanol et 70 % d’éthanol à quatre degrés Celsius et 85 % d’éthanol.

Trois changements de 95 % d’éthanol et quatre à cinq changements de 100 % d’éthanol à température ambiante. Ensuite, mettez le cerveau déshydraté dans de l’acétone et effectuez trois à quatre changements chacun pendant une journée. Après cela, mettez le cerveau toute la nuit au réfrigérateur dans chacun de ces mélanges d’acétone aite avec un rapport aite/acétone de un à deux, un à un et deux à un.

Enfin, mettez le cerveau à 100 % dans le réfrigérateur, effectuez trois changements à chaque fois pendant la nuit. Le cerveau traité est ensuite intégré dans 100 % d’aite et chauffé à 60 degrés Celsius pendant trois jours. Enfin, le bloc d’échantillon durci est monté sur l’anneau d’échantillon métallique, en utilisant de l’époxy et les côtés du bloc sont coupés si nécessaire pour commencer cette procédure.

Vérifiez que la souris est profondément anesthésiée et qu’elle ne répond pas à un pincement de l’orteil. Ensuite, la souris a été transfusée à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante, suivie d’un paraformaldéhyde tamponné au phosphate à 4 %. Ensuite, perfuser la souris avec une solution de 0,1 % thi et colorant dans de l’eau déminéralisée.

Après cela, placez le corps dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, retirez la cervelle du ventre et placez-la dans une solution fraîche de thionine à 0,1 %. Laissez le cerveau à quatre degrés Celsius pendant sept jours.

Après sept jours, retenez et déshydratez le cerveau à l’aide d’une série graduée d’alcools éthyliques. Sur une période de six semaines, trois à cinq jours dans de l’éthanol à 50 %, sept à 10 jours dans de l’éthanol à 70 %, environ deux semaines chacun dans de l’éthanol à 85 et à 95 %, et le reste du temps dans de l’éthanol à 100 %. Après trois changements d’acétone à température ambiante, le cerveau est nauséabond dans du plastique érudit dans un four à 60 degrés Celsius.

Pour commencer la procédure de coloration du réseau vasculaire à l’encre de Chine, confirmez par une absence de réflexe de retrait de l’orteil que la souris est profondément anesthésiée. Ensuite, perfuser la souris trans cordialement à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante, suivie d’une formine tamponnée à 10 % neutre à température ambiante. La perfusion de tout le corps avec une solution saline et un fixateur est nécessaire pour éliminer le sang du système cardiovasculaire et pour fixer les tissus.

Ensuite, imprégnez la souris de 3,0 cc de perfusion d’encre de Chine non diluée. Avec de l’encre de Chine est nécessaire pour remplir complètement le système vasculaire du système cardiovasculaire. Après son retrait de la souris, le cerveau résultant est déshydraté à travers une série d’alcools éthyliques gradués, puis incorporé dans du plastique érudit.

En suivant le protocole montré ci-dessus pour configurer le KESM pour l’imagerie, allumez la caméra, l’illuminateur et la platine, levez le couteau et l’objectif. Ensuite, installez l’anneau d’échantillon. Abaissez ensuite l’objectif et le couteau.

Mesurer les dimensions de l’éprouvette. Créez ensuite un fichier de configuration pour le contrôleur d’étage KESM. Deux applications, lever le couteau et l’objectif du KESM avant d’initialiser l’étape.

Démarrez le contrôleur d’étage KESM deux et initialisez l’étape. Abaissez ensuite le couteau et l’objectif et allumez la pompe. Faites la mise au point de l’objectif et de la caméra en tournant le bouton de mise au point sur le train optique et en ajustant le champ de vision de la caméra par rapport au bord du couteau.

Cliquez, étape par étape, pour vérifier les premières étapes de l’imagerie et de la section. Cliquez ensuite sur OK. Pour lancer l’imagerie et le sectionnement pour le traitement d’image.

Exécutez le processeur de pile KESM pour supprimer l’artefact d’éclairage et normaliser l’intensité de l’arrière-plan dans toutes les images. Répétez l’opération pour tous les sous-dossiers de données. Pour visualiser les données à l’aide de l’atlas cérébral KESM, rendez-vous sur ce site et sélectionnez l’atlas approprié pour aller à une profondeur différente.

Sélectionnez dans le menu déroulant la profondeur à laquelle aller à chaque étape, puis cliquez sur plus pour augmenter ou moins pour diminuer la profondeur Z. D’autres options incluent le zoom avant ou la navigation à l’aide de l’atlas cérébral KESM. Utilisez le menu déroulant pour ajuster le numéro de superposition et l’intervalle de superposition afin de visualiser les données à l’aide de VIS lab.

Lancez l’application, créez un nouveau projet. Le projet doit inclure la composition 3D à partir de fichiers 2D, l’ensemble de la matrice mondiale, l’arithmétique et la vue 3D connectée. Dans cet ordre, les paramètres appropriés doivent être définis comme indiqué dans la vue 3D en appuyant sur le bouton droit de la souris.

Déplacez la souris pour ajuster le seuil : les zones peuvent être recadrées. L’orientation a changé, l’éclairage a changé ou l’arrière-plan s’est allumé ou éteint. Les résultats représentatifs de KESM sont illustrés par les clips vidéo suivants : les clips vidéo présentés en premier sont des visualisations volumiques de KESM, des piles de données entières à l’encre Brain India pour l’ensemble de données vasculaires, en commençant par un gros plan des données vasculaires d’une largeur d’environ 100 microns.

Ce deuxième clip de KESM, données entières de l’encre Brain India montre trois vues standard de l’ensemble du système vasculaire cérébral de la souris, sous-échantillonnées à partir de données haute résolution d’une largeur d’environ 10 millimètres. La vue sagittale, la vue coronale et la vue horizontale, ainsi qu’un survol de la section coronale. KESM. Les données entières de Golgi sont illustrées dans ce clip vidéo qui montre un survol le long des trois plans de coupe différents, en commençant par la vue en bloc, suivie de la vue sagittale, de la vue coronale et de la vue horizontale.

Ensuite, les détails des données GoGy de la souris à cerveau entier KESM sont montrés. Ce premier clip vidéo montre les cellules du cervelet et de Purkinje. Ce deuxième clip montre le cortex et les cellules paramétalliques.

Enfin, KESM. L’ensemble des données sur le cerveau est illustré dans ces deux clips vidéo. La première montre un gros plan des données NLE.

Ce deuxième clip montre trois vues standard de l’ensemble du cerveau de la souris : des sous-données Nle échantillonnées à partir de données haute résolution. Une coupe transversale est également montrée pour une vue claire des structures internes Après ce développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les réseaux neuronaux et vasculaires dans le cerveau de la souris.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons, de l’imagerie et de l’analyse des données pour le microscope à balayage à tranchant de couteau.