Name: Protocoles de préparation des échantillons, dimagerie et danalyse pour la microscopie à balayage en lame de couteau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez la préparation d'échantillons cérébraux pour la microscopie à balayage en lame de couteau (KESM) chez la souris. Cette méthode permet d'imager des volumes entiers et d'étudier l'organisation neuronale et vasculaire.

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Ce projet a été financé par le NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), la NSF (# 0905041, # 0079874), le Programme du Texas Advanced Technology (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A &amp; M Research Foundation, Department of Computer Science et génie à la Texas A &amp; M University, et 3Scan. Nous tenons à remercier Bernard Mesa (Micro Star Technologies) pour la consultation technique et de soutien pour l&#39;instrumentation KESM. De grandes parties de la conception et la mise en œuvre du KESM a été réalisé par Bruce H. McCormick, qui mourut en 2007.

1. Préparation des éprouvettes: Golgi-Cox <ol><li> Ce protocole suit de près le protocole de Mayerich et al. 7. </li><li> La souris C57BL/6J est profondément anesthésié à l'aide d'anesthésie par inhalation d'isoflurane et ensuite décapité. </li><li> Le cerveau est enlevé et placé dans une solution de fixation de Golgi-Cox (1% chromate de potassium, 1% de bichromate de potassium, et 1% de chlorure mercurique dans de l'eau déminéralisée). </li><li> Le cerveau est laissé dans la solution de Golgi-Cox dans l'obscurité, à température ambiante, pendant 10 à 16 semaines. </li><li> Les cerveaux sont rincés à l'eau déminéralisée nuit dans l'obscurité. </li><li> Le cerveau rincé est immergé dans une solution d'hydroxyde d'ammonium à 5% dans de l'eau déminéralisée pour les 7 à 10 jours dans l'obscurité à température ambiante. Cette fois-ci une longue préparation était d'assurer l'infiltration de l'ensemble du cerveau, de sorte que le précipité noir avait une chance pour complètement se forment dans le tissu. </li><li> Le cerveau est à nouveau rincées à l'eau déminéralisée à température ambiante pendant 4 heures et tpoule déshydraté par une série graduée d'alcools éthylique: 50% et 70% dans le réfrigérateur (4 ° C), et 85%, 95% (3 changements), et 100% (4 à 5 changements) à température ambiante. Le cerveau est laissé dans chaque solution pendant 24 heures. </li><li> Le cerveau déshydraté est ensuite mis dans de l'acétone (3 à 4 changements, chacun pour un jour), suivi par un mélange araldite-acétone à l'araldite à l'acétone ratio de 1:2, 1:1, 2:1, et enfin en 100 araldite% (3 changements, chaque fois pendant la nuit), dans le réfrigérateur (4 ° C). </li><li> Enfin, le cerveau traitée est intégré dans l'araldite 100% et chauffée à 60 ° C pendant 3 jours (protocole intégrant cf. Abbott et Sotelo 2). Si les échantillons sont intégrés dans LR blanc, puis les échantillons sont transférés de la solution d'éthanol à 100% par le biais dernière trois changements de LR Blanc solution qui sont chacun conservés dans le réfrigérateur pendant la nuit, qui est une procédure standard avant la polymérisation. Trois changements sont faits pour assurer l'infiltration complète. Le spécimen est tpoule frais LR transféré à blanc qui est polymérisé dans un récipient fermé à 60 ° C pendant 24 heures, ce qui est le montant requis de temps et la température de polymérisation approprié. </li><li> Fig. 1 montre un cerveau de Golgi-Cox teinté intégré dans l'Araldite. </li><li> Le bloc de spécimen de guérir est ensuite montée sur le ring échantillon métallique à l'aide d'époxy, et les côtés du bloc coupé au besoin (voir fig. 2). </li></ol> 2. Préparation des éprouvettes: Nissl <ol><li> La souris est profondément anesthésié à l'aide de kétamine et de xylazine (1,7 mg de kétamine / xylazine 0,26 mg par 20 grammes de poids corporel) par voie intrapéritonéale injecté puis perfusé transcardiaque utilisant 50 mL de la température ambiante du tampon phosphate salin (pH 7,4), suivi par 250 ml de chambre Température de 10% du formol tamponné neutre (pH 7,4). et enfin avec 3,0 cc d'encre de Chine pur. </li><li> Perfusion du corps entier avec une solution saline et de fixateur est nécessaire pour effacer le sang du système cardio-vasculaire et de fixer le ti es questions. Perfusion avec l'encre de Chine est nécessaire pour remplir complètement la vascularisation du système cardio-vasculaire. </li><li> Le cerveau qui en résulte est ensuite déshydraté par une série d'alcools éthyliques classés (25% -100%), puis intégrées dans le plastique araldite suivant le protocole de 1.8 à 1.9 ci-dessus. Si le blanc est la LR milieu d'inclusion, puis le protocole en 1.10 ci-dessus est suivie. </li></ol> 4. La préparation de l'échantillon: les espèces génériques, les organes générique <ol><li> Pour le cas générique, la fixation peut se faire soit avec 10% de paraformaldéhyde neutres% du formol tamponné ou 4. </li><li> Pour les volumes du tissu de petites, la diffusion, au lieu de la perfusion est recommandé pour la fixation et coloration. Dans le cas des petits organismes ou d'organes, la coloration peut également être fait durant le processus de déshydratation. </li><li> Le protocole intégrant est le même que ci-dessus, bien que les temps d'infiltration solution peut être réduite pour les organes ou organismes qui sont beaucoup plus petits que le cerveau de souris ensemble. </li></ol>jove_title "&gt; 5. KESM configuration et l'imagerie <ol><li> Arrêter la pompe, tourner sur scène, tourner la caméra, allumez l'illuminateur. </li><li> Soulever un couteau et objective. </li><li> Installez anneau de spécimen. </li><li> Mesurer la dimension éprouvette et de créer un fichier de configuration pour l'application scène KESM Controller2. </li><li> Départ de l'étape KESM Controller2 et initialiser la scène. </li><li> Basse couteau / objectif, tournez sur la pompe. </li><li> Point de vue objectif et la caméra, en tournant le bouton de mise sur le train optique et en ajustant champ de la caméra de vue par rapport à l'arête du couteau. </li><li> Appuyez sur [Go] pour lancer l'imagerie. </li><li> Voir fig. 3-8. Voir 9, 7 pour les détails techniques. </li></ol> 6. Traitement d'image et de préparation des données <ol><li> Copiez le fichier exécutable du processeur KESM pile dans le dossier de données dans le dossier du fichier de configuration (00000, 00001, etc.) </li><li> Exécutez le processeur Stack KESM pour enlever des artefacts d'éclairage et de normaliser l'intensité de fond dans tous lesimages. Répétez l'opération pour tous les sous-dossiers de données. </li><li> Préparer les tuiles multi-échelle de l'ensemble des données et de télécharger et mettre en place les fichiers dans le serveur Web de l'Atlas du cerveau KESM. </li><li> Voir Fig. 9. </li></ol> 7. La visualisation des données et l'analyse <ol><li> Visualisation à l'aide de l'atlas du cerveau KESM. Aller à la <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> et sélectionnez l'atlas approprié. <ol><li> Naviguer comme dans Google Maps. </li><li> Zoom avant et arrière comme dans Google Maps. </li><li> Pour aller à une profondeur différente, sélectionnez la profondeur pour aller à chaque étape à partir du menu déroulant, puis cliquez soit sur [+] ou [-] pour augmenter ou diminuer la profondeur z. </li><li> Ajustez le nombre de superposition en utilisant le menu déroulant. </li><li> Réglez l'intervalle de superposition en utilisant le menu déroulant. </li><li> Voir Fig. 11. </li></ol></li><li> Visualisation à l'aide MeVisLab. <ol><li> Lancement MeVisLab. </li><li> Créez un nouveau projet. </li><li> Dans la suite, de nouveaux modules peuvent être créer par Typing dans le nom du module dans la boîte de commande. </li><li> Créer le module [Compose3Dfrom2DFiles], et aller vers le dossier souhaité. Entrez la chaîne de fichier et cliquez sur [GetFileList]. Assurez-vous que les images sélectionnées peuvent tenir en mémoire. Cliquez sur [Create3D] pour créer du volume. </li><li> Créer le module [SetWorldMatrix], et réglez le "Scale" sous "élémentaire Transforme" x, y, z pour la taille de voxel appropriée (0,6, 0,7, 1,0 pour un objectif 10X 0.45NA). Lien [Compose3Dfrom2DFiles] à [SetWorldMatrix]. </li><li> Set Matrix et se transforme sous "composition de la matrice" à "Ignorer", "Ignorer", "Forward". </li><li> Créer le module [Arithmetic1] et réglez la "Fonction" pour "Inverser (Max-Img)". Lien [SetWorldMatrix] à [Arithmetic1]. </li><li> Créer le module [View3D] et connectez [Arithmetic1]. </li><li> En View3D, alors que le bouton droit de la souris est enfoncé, déplacez la souris pour ajuster le seuil. Vous pouvez rogner les régions, l'orientation du changement (déplacez la souris alors que le bouton gauche de la souris est pressé), l'éclairage du changement (renderin volumesg ou PIM), activer / désactiver de fond, etc </li><li> Voir Fig. 10. </li></ol></li></ol> 8. Les résultats représentatifs: Ici, nous présentons l'ensemble du cerveau de données et d'informations. Figues. 12-15 montrent toute-encéphalique encre de chine, de Golgi et de Nissl ensembles de données 1, 4, 3. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Cerveau de souris fixés, colorés, et embarquées <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Embarqué échantillon de cerveau de souris monté sur la bague spécimen. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Le microscope à balayage Knife Edge (KESM). Une photo de l'KESM est montré avec ses principaux composants marqués: (1) l'assemblage ligne à grande vitesse de balayage la caméra, l'objectif de microscope (2), (3) un couteau de diamant et collimateur de lumière, (4) SPERéservoir Cimen (pour l'imagerie immersion dans l'eau), (5) à trois axes de précision à coussin d'air étape, (6) illuminateur de microscope à lumière blanche, pompe à eau (7) (dans le dos) pour le prélèvement de tissus sectionnés, (8) PC serveur pour le contrôle de la scène et d'acquisition d'image, base de granit (9), et le pont de granit (10). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Principes de l'imagerie KESM. Le principe de fonctionnement de KESM est illustré. L'objectif et le couteau est maintenu en place, tandis que le spécimen apposé sur le stade de positionnement se déplace (flèche avec une ligne solide) à la résolution de 20 nm et la vitesse de déplacement de 1-5, et obtient raclait le couteau de diamant (5 mm de large pour objectif 10X), générant une section mince s'écoulant sur le couteau (flèche avec une ligne solide). Ligne-scan imagerie se fait à proximité de la pointe du couteau. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. KESM appareil et l'objectif de contrôle mise au point. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Assemblée couteau KESM et les contrôles. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7. Initiale se concentrant sur ​​le port d'observation. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 8"> Figure 8. Controller Stade KESM 2 application (capture d'écran). <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 9"> Figure 9. Demande KESM processeur pile (screenshot). <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 10"> Figure 10. Demande MeVisLab (screenshot). <img alt="Figure 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 11"> Figure 11 KESM Atlas du cerveau:. Interface web (screenshot). <img alt="Figure 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 12"> Figure 12. KESM ensemble du cerveau des données encre de Chine. Volume de visualisations de données KESM piles sont présentés pour l'ensemble des données vasculaires. (A) Gros plan sur les données vasculaire. Largeur ~ 100 um. (Bd) Trois vues standard de l'ensemble de la vascularisation du cerveau de souris (sous-échantillonné à partir des données haute résolution). Largeur ~ 10mm. <img alt="Figure 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 13"> Figure 13. KESM ensemble du cerveau de souris de données de Golgi. <img alt="Figure 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 14"> Figure 14. KESM Golgi détail des données. <img alt="Figure 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 15"> Figure 15. KESM ensemble du cerveau des données de Nissl. (A) Gros plan sur la Ndes données ISSL. ~ 300 um 3. (Bd) Trois vues standard de l'ensemble des données de la souris Nissl cerveau (sous-échantillonné à partir des données haute résolution). Coupe transversale indiquée pour une vision claire des structures internes.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman est avec 3Scan, une société commerciale qui fabrique et commercialise la technologie KESM (brevet américain 6,744,572 #).

Le KESM permet pour une enquête submicroniques niveau de grands volumes d&#39;échantillons biologiques (~ 1 cm 3). Ce type de volume est suffisant pour contenir l&#39;ensemble des organes des petits animaux, tels que le cerveau, les poumons, cœur, rein, etc images numérisées à partir d&#39;organes peuvent fournir sans précédent, des informations quantitatives sur l&#39;organisation structurale de ces organes, et de permettre la modélisation computationnelle des fonctionnelles diverses aspects de ces organes, y compris la dynamique du circuit et le réseau, propriétés électriques, fluide et dynamique de l&#39;écoulement de l&#39;air, et la dynamique musculaire. Le protocole de préparation des échantillons et de post-analyse de protocole détaillé dans cet article sont attendus pour aider les groupes de recherche en dehors d&#39;avoir plus facilement accès à l&#39;KESM et les données résultantes. Le protocole de coopération KESM aidera ces chercheurs externes à apprécier les avantages et les limites de cette modalité d&#39;imagerie unique.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

protocoles de préparation des échantillons, d&#39;imagerie et d&#39;analyse pour la microscopie à balayage en lame de couteau

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Des avancées majeures dans le haut débit, haute résolution, des techniques de microscopie en 3D ont permis l&#39;acquisition de gros volumes de données neuroanatomiques à la résolution submicroniques. Un des premiers instruments tels la production entière-cerveau-données à grande échelle est le microscope à effet couteau (KESM) 7, 5, 9, développé et hébergé dans le laboratoire des auteurs. KESM a été utilisé pour la section et le cerveau de souris l&#39;image entière à la résolution submicroniques, révélant les détails complexes des réseaux neuronaux (Golgi) 1, 4, 8, les réseaux vasculaires (encre de Chine) 1, 4, et la distribution du corps cellulaire (Nissl) 3 . L&#39;utilisation de KESM n&#39;est pas limitée à la souris ni le cerveau. Nous avons réussi à imager le cerveau 6 poulpes, des poumons de souris, et le cerveau du rat. Nous travaillons actuellement sur l&#39;ensemble des embryons de poisson zèbre. Des données comme celles-ci peuvent grandement contribuer à la recherche connectomics 10; à la microcirculation et de la recherche hémodynamique et à la recherche par les dispositions stéréologieDing an. exacte réalité de terrain Dans cet article, nous allons décrire le pipeline, y compris la préparation des échantillons (fixation, coloration, and Embedding), la configuration et l&#39;installation KESM, de sectionnement et d&#39;imagerie avec le KESM, traitement d&#39;image, la préparation des données et la visualisation de données et d&#39;analyse. L&#39;accent sera mis sur la préparation des échantillons et la visualisation / l&#39;analyse des données obtenues KESM. Nous prévoyons que le protocole détaillé présenté dans cet article pour aider à élargir l&#39;accès à KESM et augmenter son utilisation.

Le processus complet de préparation des échantillons à l&#39;imagerie cérébrale coupes sériées en utilisant le microscope à effet couteau, à la visualisation de données et d&#39;analyse est décrite. Cette technique est actuellement utilisée pour acquérir des données cerveau de souris, mais il est applicable à d&#39;autres organes, d&#39;autres espèces.

Protocoles de préparation des échantillons, d&#39;imagerie et d&#39;analyse pour la microscopie à balayage en lame de couteau

Les avancées majeures dans les techniques de microscopie 3D à haut débit et à haute résolution ont permis l'acquisition de volumes importants de données neuroanatomiques à ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la préparation d'échantillons biologiques pour la coupe et l'imagerie au microscope à balayage par arête de lame, ou KESM, ainsi que la visualisation des données d'empilement d'images obtenues. Cela est réalisé en fixant, en colorant et en incluant d'abord le tissu afin de le préparer pour l'imagerie au KESM. La deuxième étape de la procédure consiste à configurer le KESM et à effectuer la coupe et l'imagerie à l'aide du logiciel de commande automatisé.Les images obtenues sont ensuite enregistrées, débruitées et recadrées. La dernière étape consiste à charger et explorer les jeux de données dans un atlas basé sur le web et un logiciel de visualisation 3D. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant l'organisation neuronale et vasculaire à l'échelle du cerveau entier avec une résolution submicrométrique.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de mesoscopie, telles que la microscopie électronique en balayage par blocs sériés, est qu'elle permet d'imaginer des volumes beaucoup plus grands, bien qu'à une résolution inférieure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la connectomique et des neurosciences en général. Elle peut fournir des informations sur l'organisation structurelle du cerveau et peut également être appliquée à d'autres systèmes d'organes tels que le poumon et le rein.Pour commencer cette procédure, le cerveau de souris disséqué est placé dans un bocal en verre contenant la solution de Golgi-Cox. Placer le bocal en verre dans une boîte hermétique à la lumière, à température ambiante, pendant 10 à 16 semaines. Une étape de fixation séparée n'est pas nécessaire, car la solution de Golgi-Cox agit comme un fixateur.Après 10 à 16 semaines, rincer le cerveau dans de l'eau déionisée pendant la nuit, à l'abri de la lumière, le jour suivant. Plonger le cerveau rincé dans une solution d'hydroxyde d'ammonium à 5 % dans de l'eau déionisée pendant sept à dix jours, à l'abri de la lumière et à température ambiante. Après sept à dix jours, rincer à nouveau le cerveau dans de l'eau déionisée à température ambiante pendant quatre heures. Ensuite, déshydrater le cerveau à l'aide d'une série progressive d'alcools éthyliques, en laissant le tissu dans chaque solution pendant 24 heures : 50 % d'éthanol et 70 % d'éthanol à quatre degrés Celsius, puis 85 % d'éthanol.Trois changements d’éthanol à 95 % et quatre à cinq changements d’éthanol à 100 % à température ambiante. Ensuite, placer le cerveau déshydraté dans de l’acétone et effectuer trois à quatre changements par jour pendant un jour. Après cela, placer le cerveau toute la nuit au réfrigérateur dans chacun de ces mélanges d’aite et d’acétone aux rapports d’un à deux, d’un à un et de deux à un.Enfin, placer le cerveau dans de l'alcool à 100 % au réfrigérateur et effectuer trois changements, chaque fois pendant la nuit. Le cerveau traité est ensuite inclus dans de l'alcool à 100 % et chauffé à 60 degrés Celsius pendant trois jours. Enfin, le bloc d'échantillon polymérisé est fixé sur l'anneau métallique à l'aide de résine époxy, et les côtés du bloc sont éventuellement parés pour commencer cette procédure.Vérifiez que la souris est profondément anesthésiée et ne réagit pas à une pression sur l'orteil. Ensuite, perfusez la souris transcardialement en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante, suivie d'un paraformaldéhyde froid à 4 % tamponné au phosphate. Puis, perfusez la souris avec une solution de 0,1 % de thi et de colorant dans de l'eau déionisée.Après cela, placer le corps dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, retirer le cerveau du crâne et le placer dans une solution fraîche de thionine à 0,1 %. Laisser le cerveau à quatre degrés Celsius pendant sept jours.Après sept jours, fixer et déshydrater le cerveau à l'aide d'une série progressive d'alcools éthyliques. Sur une période de six semaines, passer trois à cinq jours dans de l'éthanol à 50 %, sept à dix jours dans de l'éthanol à 70 %, environ deux semaines chacun dans de l'éthanol à 85 % et 95 %, puis le temps restant dans de l'éthanol à 100 %. Après trois changements d'acétone à température ambiante, le cerveau est inclus dans un plastique erudite dans une étuve à 60 degrés Celsius.Pour commencer la procédure de coloration du réseau vasculaire avec de l'encre de Chine, confirmez, à l'absence du réflexe de retrait des orteils, que la souris est profondément anesthésiée. Ensuite, perfusez la souris par voie transcardiale à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante, suivie d'une solution de formol tamponnée neutre à 10 % à température ambiante. Une perfusion corporelle totale avec du sérum physiologique et du fixateur est nécessaire pour éliminer le sang du système cardiovasculaire et fixer les tissus.Ensuite, perfuser la souris avec 3,0 ccs d'encre de Chine non diluée. L'utilisation d'encre de Chine est nécessaire afin de remplir complètement la vascularisation du système cardiovasculaire. Après son prélèvement chez la souris, le cerveau obtenu est déshydraté à l'aide d'une série d'alcools éthyliques à concentration croissante, puis inclus dans un plastique érudite.Après avoir suivi le protocole indiqué précédemment pour configurer le KESM en vue de l'imagerie, allumez la caméra, l'éclairage et la platine, puis relevez le couteau et l'objectif. Ensuite, installez l'anneau contenant l'échantillon. Abaissez ensuite l'objectif et le couteau.Prendre les mesures des dimensions de l'échantillon. Ensuite, créer un fichier de configuration pour le contrôleur de la platine KESM. Deux applications : soulever le couteau et l'objectif du KESM avant d'initialiser la platine.Démarrez le contrôleur de la platine KESM deux et initialisez la platine. Abaissez ensuite le couteau et l'objectif, puis mettez en marche la pompe. Mettez au point l'objectif et la caméra en tournant le bouton de mise au point du train optique et en ajustant le champ de vision de la caméra par rapport au bord du couteau.Cliquez étape par étape pour vérifier les premières étapes de l'acquisition d'images et de la sectionnement. Ensuite, cliquez sur « go ». Pour démarrer l'acquisition d'images et le sectionnement en vue du traitement d'images.Exécutez le processeur de pile KESM pour supprimer l'artéfact d'éclairage et normaliser l'intensité de fond de toutes les images. Répétez cette opération pour tous les sous-dossiers de données. Pour visualiser les données à l'aide de l'atlas cérébral KESM, rendez-vous sur ce site web et sélectionnez l'atlas approprié afin d'accéder à une profondeur différente.Sélectionnez dans le menu déroulant la profondeur à atteindre à chaque étape, puis cliquez sur le signe plus pour augmenter ou sur le signe moins pour diminuer la profondeur en Z. D'autres options comprennent le zoom avant ou la navigation à l'aide de l'atlas cérébral KESM. Utilisez le menu déroulant pour régler le nombre de superpositions et l'intervalle de superposition afin de visualiser les données à l'aide du laboratoire VIS.Lancez l'application et créez un nouveau projet. Le projet doit inclure la composition 3D à partir de fichiers 2D, la définition de la matrice mondiale, l'arithmétique un et l'affichage 3D connecté. Dans cet ordre, les paramètres appropriés doivent être définis comme indiqué dans l'affichage 3D tout en appuyant sur le bouton droit de la souris.Déplacez la souris pour ajuster les régions seuil pouvant être recadrées. L'orientation a changé, l'illumination a été modifiée ou l'arrière-plan a été activé ou désactivé. Les résultats représentatifs de la KESM sont illustrés par les courtes vidéos suivantes, qui montrent d'abord des visualisations en volume de la KESM, des piles complètes de données au sépia pour l'ensemble de données vasculaires, en commençant par un agrandissement des données vasculaires ayant une largeur d'environ 100 microns.Ce deuxième extrait de KESM, données au sépia du cerveau entier, montre trois vues standard de la vascularisation du cerveau entier de souris, échantillonnées à partir de données haute résolution avec une largeur d'environ 10 millimètres. La vue sagittale, la vue coronale et la vue horizontale, ainsi qu'un survol de la section coronaire. KESM. Les données entières du cerveau de souris colorées par la méthode de Golgi sont illustrées dans cet extrait vidéo qui montre un survol le long des trois plans de coupe différents, commençant par la vue du bloc, suivie de la vue sagittale, de la vue coronale et de la vue horizontale.Voici d'autres détails concernant les données cérébrales entières de souris GoGy obtenues par KESM. Cette première vidéo montre le cervelet et les cellules de Purkinje. Cette deuxième vidéo présente le cortex et les cellules paramétales.Enfin, KESM. Les données de NLE de cerveau entier sont illustrées dans ces deux extraits vidéo. On voit d'abord un gros plan des données de NLE.Ce deuxième extrait montre trois vues standard des données Nle du cerveau entier de la souris, sous-échantillonnées à partir de données haute résolution. Une coupe transversale est également présentée pour une visualisation claire des structures internes après ce développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les réseaux neuronaux et vasculaires dans le cerveau de la souris.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons, de l'acquisition d'images et de l'analyse des données pour le microscope à balayage par lame tranchante.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Source : Mukherjee, K., et. al. Analyse des mitochondries cérébrales à l’aide de la microscopie électronique à balayage en série Block-face. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre la préparation, l’imagerie et l’analyse du tissu cérébral de souris à l’aide d’un microscope électronique à balayage à face de bloc en série (SBFSEM) pour visualiser l’ultrastructure mitochondriale, permettant une cartographie précise de leur morphologie et de leur distribution spatiale dans les compartiments...

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