Préparation et observation d'échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une reconstruction tridimensionnelle avec récupération de la profondeur de champ d’un échantillon biologique épais à l’aide de la tomographie électronique à transmission à balayage à faisceau convergent. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale sur la tomographie électronique d’échantillons biologiques épais. Le principal avantage de cette technique est que les images peuvent être acquises en mode bit convergent et que le traitement des données peut être effectué sur la plupart des logiciels dédiés à la tomographie.

Pour commencer à préparer l’échantillon de culture cellulaire, centrifugez l’échantillon à 5000 x g pendant cinq minutes. Utilisez ces paramètres de centrifugation tout au long de la préparation de l’échantillon. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS enrichi de 4 % de paraformaldéhyde et de 2 % de glutéraldéhyde.

Incuber la suspension pendant 30 minutes à température ambiante. Centrifugez le mélange, jetez le surnageant et lavez la pastille trois fois avec des portions d’un millilitre de PBS. En utilisant les mêmes conditions d’incubation et la même procédure de lavage, incubez la pastille dans un millilitre de PBS, enrichi de 1 % de tétroxyde d’osmium, et dans un millilitre de PBS enrichi de 2 % d’acétate d’uranyle.

Ensuite, refroidissez l’échantillon à quatre degrés Celsius. Déshydrater la pastille par incubations successives dans des solutions d’éthanol de plus en plus concentrées. Maintien de la température de l’échantillon de quatre degrés Celsius tout au long de l’incubation, de la centrifugation et du lavage.

Remettez en suspension la pastille déshydratée dans un millilitre d’éthanol pur et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius. Ensuite, laissez l’échantillon se réchauffer à température ambiante et centrifugez-le. Incuber la pastille dans des solutions de résine époxy de plus en plus concentrées à température ambiante.

Après le lavage final, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de résine époxy pure et incubez toute la nuit à température ambiante. Centrifugez l’échantillon et retirez le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de résine époxy et de durcisseur. Transférez la suspension dans la capsule.

Incuber la capsule de plastique à 60 degrés Celsius pendant 48 heures pour polymériser la résine. Retirez la capsule de l’incubateur et vérifiez la polymérisation de la résine. Ajoutez une couche de résine époxy et de durcisseur sur l’échantillon incorporé et incubez à nouveau la capsule dans les mêmes conditions.

Montez l’échantillon nausé dans la résine à l’envers dans un porte-échantillon. Fixez solidement l’échantillon sur le bloc de coupe d’un ultramicrotome. Coupez la capsule en plastique de l’échantillon dans la résine.

Façonnez la résine exposée en une pyramide. Transférez ensuite la capsule et le porte-échantillon dans le bras mobile de l’ultramicrotome. Installez un couteau de coupe et, guidé par un microscope, affinez la forme de la pyramide.

Remplacez le couteau de parage par un couteau d’histologie. Au microscope, ajustez l’angle d’inclinaison de la capsule de manière à ce que la pyramide soit perpendiculaire au bord du couteau. Réglez la vitesse de coupe et coupez l’échantillon.

Après avoir sectionné l’échantillon, transférez la section choisie sur une grille en cuivre traité sur du papier filtre. Laissez sécher l’échantillon, puis chargez-le dans le microscope électronique. Pour concevoir la série d’inclinaison focale traversante, calculez d’abord la profondeur de champ du faisceau d’électrons et l’épaisseur apparente maximale de l’échantillon.

Sur la base de ces valeurs, sélectionnez un intervalle de mise au point et déterminez le nombre d’étapes focales nécessaires pour imager l’ensemble de l’échantillon à l’épaisseur apparente maximale. Ensuite, à faible grossissement, localisez la région d’intérêt dans l’échantillon. Ajustez la hauteur eucentrique de sorte que la valeur d’intérêt ne semble pas bouger lorsque l’échantillon est tourné.

Vérifiez que le retour sur investissement reste visible sur toute la plage d’inclinaison. Remplissez les paramètres de la série d’inclinaison focale pour la collecte automatique d’images et acquérez les images. Importez la série d’images dans un programme de traitement d’images et alignez les images collectées au même angle d’inclinaison dans une hiérarchie pyramidale.

Trouvez l’alignement à chaque angle d’inclinaison en empilant les images alignées. Parcourez la pile pour vous assurer que seule la zone sélectionnée se déplace d’une image à l’autre et réalignez les images si nécessaire. Une fois l’alignement vérifié dans l’ensemble de l’échantillon, fusionnez les informations de mise au point aux paramètres élevés pour obtenir la série avec une seule image par angle d’inclinaison.

Effectuez l’alignement de la série d’inclinaison en fonction des minima locaux ou des repères. Effectuez une reconstruction 3D et inspectez l’image résultante. Si la reconstruction apparaît floue ou déformée, réalignez la série d’images d’origine.

Un échantillon de T. brucei a été imagé et analysé à l’aide de cette méthode. À un angle d’inclinaison de zéro degré, plusieurs détails de la poche flagellaire sont visibles.

À l’angle d’inclinaison plus élevé de 70 degrés, seule une partie de chaque image collectée dans la série focale traversante est nette. Cette position change tout au long de la série. En fusionnant les sections de mise au point, une seule image avec une zone de mise au point plus grande est produite.

Cet effet est encore plus prononcé lorsque les zones à haute fréquence de la série d’inclinaison focale traversante sont mises en évidence. Les informations à haute fréquence couvrent la majeure partie de l’image combinée, ce qui indique que la série d’inclinaison focale traversante a été bien traitée. Une fois maîtrisée, la partie traitement d’image peut être réalisée en trois à quatre heures environ, selon les paramètres d’alignement et de reconstruction choisis.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité de la reconstruction finale dépend grandement de la qualité des tests d’alignement précédents. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la collecte et le traitement d’image d’une série d’inclinaison focale.