Name: Préparation et observation déchantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Apprenez la préparation d'échantillons biologiques épais pour la tomographie électronique à transmission à balayage. Cette méthode permet une reconstruction 3D avec récupération de la profondeur de champ en biologie structurale.

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Ce travail a été financé par deux subventions ANR (ANR-11-BSV8-016 et ANR-10-IDEX-0001-02). Nous remercions également le PICT-IBiSA de nous avoir donné accès à l’équipement d’imagerie chimique.

Attention: Consultez les fiches de données de sécurité (FDS) des différents réactifs avant de les utiliser. Plusieurs des produits chimiques utilisés lors de la préparation de l&#39;échantillon sont toxiques, cancérigènes, mutagènes et / ou reprotoxiques. Utiliser un équipement de protection individuelle (gants, blouse, pantalon pleine longueur et des chaussures fermées) et de travailler sous une hotte lors de la manipulation de l&#39;échantillon. Sectionnement l&#39;échantillon avec un ultramicrotome implique l&#39;utilisation d&#39;instruments tranchants, et l&#39;utilisation judicieuse de ces outils est obligatoire. Dans les étapes décrites ci-dessous, les auteurs supposent que l&#39;échantillon est un échantillon de culture cellulaire. Le protocole peut devoir être modifiée selon le type d&#39;échantillon, en particulier les étapes de centrifugation. 1. Préparation des tampons et des mélanges <ol><li> Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4 et 1,76 mM de KH 2 PO 4). </li><li> Préparer des solutions contenant 30%, 50% et 70% etHanol dans du PBS pour l&#39;échantillon déshydratation. Effectuer échantillon déshydratation par incubation progressivement l&#39;échantillon dans l&#39;augmentation des concentrations d&#39;éthanol. </li><li> Préparer la résine époxy en mélangeant le bisphénol-A (épichlorhydrine) (20 ml), de l&#39;anhydride dodécénylsuccinique (9 ml), la méthyl-5-norbornène-2,3-dicarboxylique (11 ml) et de 2,4,6-tris ( diméthylaminométhyl) phénol (0,7 ml); d&#39;autres rapports de mélange peuvent être utilisés en fonction de la dureté désirée de la résine. </li><li> Préparer des solutions contenant 30%, 50%, et une résine époxy 70% dans l&#39;éthanol pour l&#39;échantillon enchâssement. Effectuer enrobage de résine en incubant progressivement l&#39;échantillon avec des concentrations croissantes de résine. NOTE: Les volumes des solutions préparées dépendent du type d&#39;échantillon qui est étudié. Plusieurs solutions sont nécessaires pour les tissus que pour les cultures cellulaires. </li></ol> 2. Fixation et Coloration de l&#39;échantillon <ol><li> Centrifuger la culture cellulaire pendant 5 min à 5000 x g. Effectuer toutes les centrifugations suivantes en utilisant les mêmes conditions.</li><li> Jeter le surnageant et on fixe le culot de cellules en remettant en suspension dans du PBS (1 ml) avec du paraformaldehyde à 4% et 2% de glutaraldéhyde. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes (figure 1A). Vous pouvez également fixer les cellules à 4 ° C pendant la nuit ou le week-end. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et laver le culot 3 fois avec du PBS (1 ml) pour éliminer complètement les agents fixants. </li><li> Post fixer l&#39;échantillon avec 1% de OsO 4 dans du PBS (1 ml) pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et laver le culot 3 fois avec du PBS (1 ml) pour éliminer complètement le OsO 4. Désactiver l&#39;OSO 4 dans l&#39; huile et le rejet. </li><li> Ajouter 2% d&#39; acétate d&#39;uranyle dans de la PBS (1 ml) en tant qu&#39;agent de contraste et laisser incuber l&#39;échantillon pendant 30 min à température ambiante (figure 1B). </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et laver le culot 3 fois avec du PBS (1 ml) pour éliminer l&#39;uranyle ac non liéeetate; l&#39;acétate d&#39;uranyle contient des éléments radioactifs et doivent être éliminés dans un bac dédié aux déchets radioactifs. REMARQUE: Les durées d&#39;incubation peuvent être modifiées en fonction de la taille de l&#39;échantillon. Par exemple, la fixation et la coloration des échantillons plus épais, comme un échantillon tissulaire, nécessitent de plus longues durées d&#39;incubation. Des durées d&#39;incubation peuvent également être mieux pour la déshydratation et les étapes d&#39;incorporation. l&#39;acétate d&#39;uranyle peut être remplacée par une solution «uranyle-less&quot; qui contient des sels de gadolinium. </li></ol> Déshydratation 3. Sample <ol><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et on incube l&#39;échantillon pendant 30 min à 4 ° C dans du PBS (1 ml) avec 30% d&#39; éthanol (figure 1C). </li><li> Répétez l&#39;étape 3.1 en utilisant des solutions avec des concentrations progressivement croissantes d&#39;éthanol (50%, 70% et jusqu&#39;à 100%). Au cours de ces étapes de déshydratation, de maintenir l&#39;échantillon à 4 ° C à des fins de conservation de l&#39;échantillon. </li><li> Après centrifugation, jeter le supernatant et resuspendre le culot dans de l&#39;éthanol pur (1 ml); incuber une nuit à 4 ° C. </li></ol> 4. Résine Embedding <ol><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans de l&#39; éthanol avec de la résine époxy à 30% (1 ml) pendant 30 min à température ambiante (figure 1D). </li><li> Répétez l&#39;étape 4.1 en utilisant des solutions avec des concentrations de résine époxy augmentant progressivement (50%, 70% et jusqu&#39;à 100%). </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans une résine époxy pur (1 ml); incuber une nuit à température ambiante. La présence de durcissement DMP-30 pourrait déclencher la polymérisation de la résine; si tel est le cas, de préparer deux lots de résine époxy, une avec et une sans DMP-30. </li><li> Après centrifugation, remise en suspension du culot dans 200 pl de résine époxy pur (contenant le durcisseur) dans une capsule en matière plastique; l&#39;échantillon doit être au fond de la capsule en matière plastique. </li></ol> 5. Résine Polymérisation <ol><li> jencubate la capsule en plastique contenant l&#39;échantillon dans un incubateur réglé à 60 ° C pendant 48 h; d&#39;autres types de résine peuvent polymériser avec des paramètres différents. </li><li> Retirer la capsule de l&#39;incubateur et vérifier que la résine a polymérisé; la résine doit être difficile si elle est pressée contre une surface dure. </li><li> Ajouter une résine époxy pur (contenant le durcisseur) au-dessus de la résine polymérisée contenant l&#39;échantillon; cette couche supplémentaire de résine, il sera plus facile à couper l&#39;échantillon. Incuber la capsule à 60 ° C pendant 48 heures. </li></ol> Sectionnement 6. Sample <ol><li> Monter l&#39;échantillon à l&#39;envers dans un porte-échantillon de telle sorte que l&#39;échantillon est vers le haut et la fixer sur le bloc de coupe de l&#39;ultramicrotome. verrouiller fermement le levier pour fixer le bloc de coupe à l&#39;ultramicrotome. </li><li> En utilisant une lame de rasoir ou un instrument similaire tranchant, découper la capsule en plastique pour le séparer de la résine polymérisée. Découper la résine de telle sorte que l&#39;échantillon contiented en résine dans à peu près la forme d&#39;une pyramide. Il n&#39;y a pas besoin de retirer la capsule en plastique ensemble; seulement enlever la partie couvrant l&#39;échantillon polymérisé. </li><li> Prenez la capsule et le porte-échantillon hors du bloc de coupe et les installer sur le bras mobile de l&#39;ultramicrotome. </li><li> Installez un couteau de coupe sur le bloc de couteau et couper avec précision les faces de la pyramide. L&#39;utilisation de jumelles est conseillé de donner une forme parfaite à la pyramide; mieux la pyramide, plus les sections seront. </li><li> Enlever le couteau coupe et le remplacer par un couteau d&#39;histologie qui peut être utilisé pour couper des sections qui sont plus épais que 0,5 um. </li><li> Après avoir rempli la cuvette du couteau d&#39;histologie avec la bonne quantité d&#39;eau, amener le bord de coupe du couteau à la surface de l&#39;échantillon et utiliser les jumelles pour régler l&#39;angle d&#39;inclinaison de la capsule de sorte que le couteau trancher perpendiculairement à la pyramide. </li><li> Ajuster la vitesse de coupe souhaitée en fonction de lal&#39;épaisseur de coupe pour récupérer des sections homogènes. </li><li> Laissez la section flottant sur l&#39;eau et les poissons avec une boucle. </li><li> Déplacer la boucle en direction d&#39;une grille de cuivre en microscopie électronique qui a été placé sur le dessus du papier filtre. NOTE: La grille doit avoir été préalablement traitée pour augmenter son hydrophilie. Ceci peut être effectué avec un stylo à grille revêtement. </li><li> En raison de l&#39;absorption d&#39;eau par le papier filtre, laissez la section coller à la grille. Laissez sécher pendant quelques minutes avant de l&#39;insérer dans le microscope électronique. </li></ol> 7. Conception du Tilt-série Through-focale <ol><li> Collecter des images par le biais-focaux à intervalles de discussion constants. NOTE: L&#39;inclinaison de la série grâce à focale se composent d&#39;un ensemble d&#39;images par le biais-focaux qui sont collectées à chaque angle d&#39;inclinaison de l&#39;inclinaison de la série. Toute amplitude de mise au point doit être suffisante pour couvrir la totalité de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon. </li><li> Déterminer la valeur de l&#39;intervalle de mise au point. Si l&#39;intervalle est égal à la depth de champ, de recueillir l&#39;ensemble de l&#39;échantillon au point; ce paramètre représente le plus haut possible l&#39;échantillonnage. Si l&#39;intervalle est supérieur à la profondeur de champ, certaines parties de l&#39;échantillon ne sont pas acquises au point, ce qui signifie que certaines parties de l&#39;échantillon ne sont pas collectées dans le foyer. </li><li> Calculer la profondeur de champ d&#39;un faisceau d&#39;électrons à partir de la longueur d&#39;onde de l&#39;électron et la convergence demi-angle du faisceau d&#39;électrons. Tandis que la longueur d&#39; onde d&#39;électrons est directement liée à la tension d&#39;accélération, utiliser le demi-angle de convergence fourni par le fabricant au microscope électronique ou à déterminer expérimentalement à partir du motif de diffraction d&#39;un échantillon connu 16. Parce que les électrons accélérés à une longueur d&#39;onde λ de frapper l&#39;échantillon avec un demi-angle de α de convergence dans un microscope électronique, utiliser l&#39;équation suivante pour déterminer la profondeur de champ (DOF): <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> Conceptionla série focale de sorte que toute l&#39; amplitude de mise au point portera sur l&#39;échantillon à son épaisseur apparente maximale (ie, à son plus haut inclinaison). REMARQUE: Un échantillon de 0,75 um d&#39;épaisseur aura une épaisseur apparente de 2,19 um à une inclinaison de 70 °, de sorte que l&#39;amplitude de la mise au point doit être supérieure à 2,19 um. Pour cet exemple, si l&#39;intervalle de mise au point déterminé ci-dessus est égale à 50 nm, il faudra 44 images (2.19 pm / 50 nm) pour couvrir l&#39;échantillon à son épaisseur maximale apparente. L&#39;ensemble de l&#39;amplitude de mise au point est égale à la valeur de l&#39;intervalle de mise au point, multipliée par le nombre d&#39;étapes d&#39;intervention. Au plus haut inclinaison (θ), l&#39;épaisseur apparente de l&#39;échantillon est défini comme suit: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> Imaging 8. Sample NOTE: Il est hors de la portée de ce protocole pour décrire comment mettre en place un microscope électronique en mode STEM; la plupart de ces informations peuvent être trouvées in le manuel de référence fourni par le fabricant de microscope électronique. Cependant, notez ce qui suit: i) la taille du spot doit être choisi en fonction du grossissement souhaité; ii) l&#39;Ronchigram doit être bien aligné; et iii) en mode BF, la longueur de la caméra doit être ajustée pour sélectionner des électrons non dispersés, tout en maintenant un bon éclairage du détecteur. sections de résine déposée sur la microscopie électronique des grilles de cuivre devraient être éclairés avant l&#39;acquisition d&#39;image pour empêcher le retrait. retrait de la résine et les effets de charge pourraient être confondus lors de l&#39;acquisition d&#39;image. L&#39;utilisation d&#39;une ouverture de l&#39;objectif pourrait améliorer la stabilité échantillon lorsque les effets de charge se produisent. Cependant, dans le cas spécifique des configurations SOUCHES, l&#39;ouverture de l&#39;objectif n&#39;est pas compatible avec le mode d&#39;imagerie HAADF, et de très petites ouvertures objectives ne sont pas compatibles avec le mode d&#39;imagerie BF. <ol><li> En utilisant un faible grossissement (environ 20,000X en STEM), naviguer à travers l&#39;échantillon et de localiser la région d&#39;intérêt. </li><li> Régler til eucentrique hauteur (axe Z) de sorte que la région d&#39;intérêt ne dérive pas de distance tout en faisant tourner l&#39;échantillon. </li><li> Vérifiez que l&#39;objet d&#39;intérêt restera visible sur toute la plage d&#39;inclinaison. </li><li> En raison du nombre important d&#39;images acquises au cours d&#39;une inclinaison de la série grâce à focale, utilisez un logiciel automatique de collecte. Soit utiliser une solution commerciale ou de concevoir un logiciel de collecte de données personnalisée si vous le souhaitez. Assurez-vous que le logiciel est capable d&#39;exécuter les trois étapes suivantes: <ol><li> Suivre et se concentrer comme dans un système de collecte d&#39;inclinaison de la série standard. </li><li> Faire en sorte que les images se chevauchent à travers focale avec la position Z de l&#39;échantillon. </li><li> acquérir automatiquement une série d&#39;images par le biais de focale à chaque angle d&#39;inclinaison. </li></ol></li><li> Donnez le logiciel les principaux paramètres de l&#39;inclinaison de la série grâce à focale (c. -à- intervalles correspondants, étape focale, l&#39; angle d&#39;inclinaison minimum, l&#39; angle d&#39;inclinaison maximale, l&#39; étape d&#39;inclinaison, et la vitesse de balayage). </li><li> Débutle processus et de collecte d&#39;images attendre le logiciel pour terminer. </li></ol> Traitement 9. Image NOTE: Dans ce protocole, le traitement tilt-série à travers focale est effectuée en utilisant ImageJ plugins 17. Données supplémentaires 1 montre une macro ImageJ pour l&#39;étape d&#39;alignement (Turboreg) et pour la fusion des informations de mise au point (profondeur de champ) pour une inclinaison de la série grâce à focale conçu avec trois valeurs de mise au point. <ol><li> Alignez les images recueillies dans le même angle d&#39;inclinaison (ie, les images par le biais-focaux). Comme les images ne sont pas les mêmes informations de mise au point, ils ne pas héberger les mêmes caractéristiques pour l&#39;alignement; procéder à l&#39; alignement en alignant les images voisines deux par deux ( à savoir, suite à une hiérarchie pyramidale, avec les valeurs de discussion les plus proches premiers) en utilisant Turboreg 18, un plugin ImageJ. </li><li> Toujours vérifier l&#39;alignement des images par le biais-focaux à chaque angle d&#39;inclinaison.Empilez les images par le biais-focaux alignés pour améliorer l&#39;inspection visuelle. NOTE: Seule la zone qui est mise au point doit se déplacer tout en naviguant à travers la pile. Un alignement précis est la chose la plus importante, puisque l&#39;étape suivante consiste à la récupération de l&#39;information qui est mise au point à partir de différentes images. </li><li> Fusionner l&#39;information qui est mise au point en utilisant profondeur de champ 19, un plugin ImageJ; ce qui finira par générer une seule image à partir de la pile d&#39;images. Plusieurs paramètres peuvent être utilisés lors de la reprise de la profondeur de champ, mais utilisent les réglages les plus élevés pour préserver les informations d&#39;image. NOTE: L&#39;inclinaison de la série est maintenant composé d&#39;une seule image par angle d&#39;inclinaison, chaque image contenant les informations de mise au point récupéré des images par le biais-focaux. </li><li> Traiter les données. REMARQUE: les outils standards pour l&#39;alignement et la reconstruction peut être utilisé depuis que les données ont maintenant été réduit à une inclinaison de la série standard. Dans ce protocole, nous TomoJ ested pour l&#39; alignement des données et à la reconstruction de données 20, 21. Plus de détails sur la façon d&#39;utiliser TomoJ peuvent être trouvés dans la publication originale 22. </li><li> Effectuer l&#39;alignement de l&#39;inclinaison de la série. NOTE: Une bonne stratégie consiste à utiliser des billes d&#39;or comme marqueurs de référence pour suivre avec précision les changements entre les images. minima locaux peuvent également être utilisés si des billes d&#39;or ne peuvent pas être ajoutés à l&#39;échantillon. </li><li> Effectuez une reconstruction 3D des données alignées; plusieurs algorithmes sont disponibles pour effectuer les reconstructions dans l&#39;espace réel ou de l&#39;espace de Fourier, chacune ayant ses avantages et ses limites. </li><li> Si l&#39;alignement final de l&#39;inclinaison de la série est pauvre, apporter quelques améliorations en optimisant les étapes initiales. Réitérer les étapes d&#39;alignement si la reconstruction 3D finale apparaît floue ou déformée; dans la pratique, plus le nombre de plans focaux recueillis, mieux le contraste et les détails de la reconstruction 3D. NOTE: Sedes programmes logiciels peuvent être utilisés sieurs pour traiter l&#39;inclinaison de la série traversants focale. Cependant, les outils utilisés dans ce protocole ont été choisis parce que, dans notre expérience, ils ont joué le meilleur. Turboreg 18 fait mieux en termes d&#39;alignement des images quand un gradient de concentration était présent. Plus d&#39; informations peuvent être trouvées sur le site dédié 23. La profondeur étendue du plug - in Zone 19 a très bien performé en termes de récupération des informations de mise au point à partir de différentes images, alors que d&#39; autres outils ont abouti à pixels visibles modifications. Plus d&#39; informations, en particulier en ce qui concerne l&#39; écriture de scénario, peut être trouvé sur ce site dédié 24. </li></ol>

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</ol>

Nous n’avons aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans cet article, nous présentons un protocole de préparation d&#39;échantillon classique avec un guide étape par étape pour effectuer une analyse en 3D sur des échantillons biologiques épais en utilisant STEM par focale de positons. Enrobage de résine de spécimens biologiques a été utilisé pendant des décennies 26, et d&#39; autres protocoles qui sont adaptés aux différents types d&#39;échantillons peuvent être trouvés dans la littérature 27. En revanche, l&#39;imagerie é...

Depuis le début des années 1970, la tomographie par des approches en microscopie électronique à transmission (MET) ont été largement utilisés pour la caractérisation structurale des échantillons biologiques 1, 2, 3. L&#39;appel de la tomographie d&#39;émission d&#39;électrons est qu&#39;il pourrait être utilisé pour étudier un grand nombre de structures biologiques à l&#39;échelle du nanomètre, de l&#39;architecture des cellules et organites l&#39;ultrastructure de la structure des complexes macromoléculaires et des protéines. Néanmoins, la tomographie d&#39;émission d&#39;électrons ne peut pas être utilisé pour étudier des échantillons très épais (supérieur à 0,5 um). En effet, les spécimens épais produisent trop d&#39;électrons dispersés, générant faible rapport signal sur bruit (SNR) images. En outre, la tomographie implique la collecte d&#39;images de spécimens basculées, l&#39;épaisseur apparente de l&#39;échantillon augmente avec l&#39;angle d&#39;inclinaison. Même si la diffusion inélastique peut être filtréeà l&#39;aide de filtres d&#39;énergie, la quantité critique d&#39;électrons nécessaires pour les images SNR élevé est atteint à peine en TEM. Par conséquent, les échantillons biologiques épais ont seulement été étudiés en utilisant sectionnant 4. Certains échantillons ne peuvent pas être tranchés: certains pourraient se dégrader quand ils sont coupés, et d&#39;autres doivent être étudiées dans leur intégralité afin de comprendre leur complexité. Une autre approche consiste à utiliser TEM en mode 5, 6, 7, 8 numérisation. En microscopie électronique à balayage en transmission (STEM), le trajet optique des électrons est différente de celle TEM classique. Electrons passant à travers l&#39;échantillon sans diffusion peuvent être collectées sur l&#39;axe optique avec un champ lumineux (BF) détecteur 9, alors que ceux dispersés élastiquement peuvent être collectées à un certain angle par rapport à l&#39;axe optique avec un détecteur de champ foncé (DF).L&#39;autre avantage de STEM est que le faisceau d&#39;électrons focalisé est balayé sur la surface de l&#39;échantillon, ce qui permet la collecte de pixel par pixel des images. Même si le faisceau d&#39;électrons élargit en passant à travers l&#39;échantillon 10, ce système de collecte particulier est moins sensible aux électrons inélastique que TEM conventionnel. En outre, il n&#39;y a pas d&#39;objectif post-spécimen STEM, évitant ainsi les aberrations chromatiques qui peuvent survenir dans TEM. La longueur de la caméra peut être réglée de telle sorte que le détecteur de BF détecte principalement les électrons non dispersés. En utilisant le détecteur DF pour étudier des échantillons épais est pas recommandé en raison de la diffusion multiple, qui produit des images inexactes. Au lieu de cela, le détecteur de BF peut être utilisé 11. Alors que STEM peut produire des images SNR élevés, il a une relativement faible profondeur de champ en raison de la convergence de faisceaux relativement élevé par rapport à TEM, ce qui diminue la quantité d&#39;informations en profondeur qui peut être récupéré à partir d&#39;épaisseurspécimens. Dans le cas des microscopes SOUCHES aberration corrigée, où l&#39;angle de convergence peut être aussi élevé que 30 mrad, la profondeur de champ-peut être suffisamment faible pour que l&#39;information qui est mise au point provient d&#39;un plan focal de seulement quelques nanomètres . La mise en place du faisceau d&#39;électrons en mode parallèle augmente la profondeur de champ du faisceau d&#39;électrons , au détriment de la résolution 12. Cependant, cette configuration est pas toujours possible. Chaque fois qu&#39;il est nécessaire d&#39;utiliser un faisceau d&#39;électrons convergent, on doit employer des techniques qui améliorent la profondeur de champ du faisceau d&#39;électrons lorsque l&#39;on étudie des échantillons épais. Des études récentes ont rapporté l&#39;acquisition de plusieurs images à différents plans focaux à travers l&#39;échantillon pour récupérer le maximum d&#39;informations de mise au point 13, 14. Les deux études décrivent différentes façons de traiter les informations provenant des différents plans focaux. Hovden et al.combinés dans l&#39; espace de Fourier les images qui ont été recueillies à divers plans focaux, et la reconstruction finale a été obtenue directement à partir de l&#39;inverse 3D transformée de Fourier 13. En revanche, Dahmen et al. développé un moteur de reconstruction du faisceau convergent pour reconstruire dans l&#39; espace réel le volume 3D à partir des différents plans focaux 14. Notre laboratoire a également développé une méthode pour l&#39;imagerie des échantillons biologiques épais. Notre stratégie était différente des deux méthodes décrites ci - dessus en ce que nous avons fusionné l&#39;information qui est mise au point dans les différents plans focaux et reconstruit le volume 3D finale dans l&#39; espace réel à l&#39; aide d&#39; un projecteur de faisceau parallèle 15. Notre objectif était de développer une méthode qui peut facilement être effectuée dans un laboratoire de microscopie électronique. À cette fin, nous avons cherché à recueillir des images de liaison en une quantité limitée de temps comparable à la période des expériences de tomographie conventionnelle. En outre, notre méthode proposée could être adapté pour être utilisé avec différents types d&#39;alignement et d&#39;un logiciel de reconstruction. Dans le cadre de notre publication à partir de 2015 15, nous voulions visualiser et caractériser la récupération de la profondeur de champ, nous avons donc utilisé un demi-angle de 25 mrad grande convergence. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour effectuer par focale imagerie STEM selon la méthode développée dans notre laboratoire en 2015 15, et nous présentons comment les données de 2015 ont été traitées. Cette méthode récupère les informations de mise au point de plusieurs plans focaux à travers un (750 nm) échantillon biologique épais et permet des reconstructions 3D de haute qualité. Le cas échéant, les différences dans cette méthode par rapport aux méthodes utilisées par d&#39;autres groupes sont également présentés.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Résine époxy</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Ajouter de la poudre de paraformaldéhyde au PBS chauffé à environ 60 &deg ;C. Augmenter le pH en ajoutant 1 N de NaOH jusqu’à ce qu’aucune poudre PFA ne soit visible.</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882² ;</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Capsule de gélatine</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Couteaux de coupe et d’histo</td><td>Distribution LFG Couteaux</td><td></td><td></td>diamantés Diatome</tr><tr><td>Microscopie électronique Grille de cuivre</td><td>LFG Distribution</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Stylo de revêtement de grille</td><td>LFG Distribution</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Porte-échantillon</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 Microscope électronique HTR</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation et observation d&#39;échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Ce rapport décrit un protocole de préparation d’échantillons biologiques épais pour une observation ultérieure à l’aide d’un microscope électronique à transmission à balayage. Il décrit également une méthode d’imagerie permettant d’étudier la structure 3D d’échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage. Le protocole de préparation de l’échantillon est basé sur des méthodes conventionnelles dans lesquelles l’échantillon est fixé à l’aide d’agents chimiques, traité avec un agent de contraste de sel d’atome lourd, déshydraté dans une série de bains d’éthanol et noyé dans de la résine. Les conditions d’imagerie spécifiques à l’observation d’échantillons épais par microscopie électronique à transmission à balayage sont ensuite décrites. Des sections de l’échantillon sont observées à l’aide d’une méthode de mise au point traversante impliquant la collecte de plusieurs images à différents plans focaux. Cela permet de récupérer des informations nettes à différentes hauteurs dans l’échantillon. Ce modèle de collecte particulier est effectué à chaque angle d’inclinaison lors de la collecte des données de tomographie. Une seule image est ensuite générée, fusionnant les informations de mise au point de tous les différents plans focaux. Un jeu de données classique de série d’inclinaison est ensuite généré. L’avantage de la méthode est que l’alignement et la reconstruction de la série d’inclinaison peuvent être effectués à l’aide d’outils standard. La collecte d’images à travers les focales permet de reconstituer un volume 3D contenant tous les détails structurels de l’échantillon mis au point.

Dans notre étude, les électrons sont accélérés à 200 kV dans le microscope électronique à transmission du pistolet à émission de champ. Les images ont été recueillies en mode STEM de BF en utilisant un temps de séjour de 20 ms. En ce qui concerne la conception de l&#39;inclinaison de la série par le biais-focal, nous avons constaté que les intervalles de mise au point de 150 nm ont donné des résultats satisfaisants pour l&#39;étude ultrastructurale d&#39;un échantillon-même 750 nm d&#39;...

Ce rapport décrit un protocole de préparation d’échantillons et des conditions d’imagerie spécifiques pour effectuer la tomographie électronique à transmission à balayage d’échantillons biologiques épais.

Préparation et observation d&#39;échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une reconstruction tridimensionnelle avec récupération de la profondeur de champ d’un échantillon biologique épais à l’aide de la tomographie électronique à transmission à balayage à faisceau convergent. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale sur la tomographie électronique d’échantillons biologiques épais. Le principal avantage de cette technique est que les images peuvent être acquises en mode bit convergent et que le traitement des données peut être effectué sur la plupart des logiciels dédiés à la tomographie.Pour commencer à préparer l’échantillon de culture cellulaire, centrifugez l’échantillon à 5000 x g pendant cinq minutes. Utilisez ces paramètres de centrifugation tout au long de la préparation de l’échantillon. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS enrichi de 4 % de paraformaldéhyde et de 2 % de glutéraldéhyde.Incuber la suspension pendant 30 minutes à température ambiante. Centrifugez le mélange, jetez le surnageant et lavez la pastille trois fois avec des portions d’un millilitre de PBS. En utilisant les mêmes conditions d’incubation et la même procédure de lavage, incubez la pastille dans un millilitre de PBS, enrichi de 1 % de tétroxyde d’osmium, et dans un millilitre de PBS enrichi de 2 % d’acétate d’uranyle.Ensuite, refroidissez l’échantillon à quatre degrés Celsius. Déshydrater la pastille par incubations successives dans des solutions d’éthanol de plus en plus concentrées. Maintien de la température de l’échantillon de quatre degrés Celsius tout au long de l’incubation, de la centrifugation et du lavage.Remettez en suspension la pastille déshydratée dans un millilitre d’éthanol pur et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius. Ensuite, laissez l’échantillon se réchauffer à température ambiante et centrifugez-le. Incuber la pastille dans des solutions de résine époxy de plus en plus concentrées à température ambiante.Après le lavage final, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de résine époxy pure et incubez toute la nuit à température ambiante. Centrifugez l’échantillon et retirez le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de résine époxy et de durcisseur. Transférez la suspension dans la capsule.Incuber la capsule de plastique à 60 degrés Celsius pendant 48 heures pour polymériser la résine. Retirez la capsule de l’incubateur et vérifiez la polymérisation de la résine. Ajoutez une couche de résine époxy et de durcisseur sur l’échantillon incorporé et incubez à nouveau la capsule dans les mêmes conditions.Montez l’échantillon nausé dans la résine à l’envers dans un porte-échantillon. Fixez solidement l’échantillon sur le bloc de coupe d’un ultramicrotome. Coupez la capsule en plastique de l’échantillon dans la résine.Façonnez la résine exposée en une pyramide. Transférez ensuite la capsule et le porte-échantillon dans le bras mobile de l’ultramicrotome. Installez un couteau de coupe et, guidé par un microscope, affinez la forme de la pyramide.Remplacez le couteau de parage par un couteau d’histologie. Au microscope, ajustez l’angle d’inclinaison de la capsule de manière à ce que la pyramide soit perpendiculaire au bord du couteau. Réglez la vitesse de coupe et coupez l’échantillon.Après avoir sectionné l’échantillon, transférez la section choisie sur une grille en cuivre traité sur du papier filtre. Laissez sécher l’échantillon, puis chargez-le dans le microscope électronique. Pour concevoir la série d’inclinaison focale traversante, calculez d’abord la profondeur de champ du faisceau d’électrons et l’épaisseur apparente maximale de l’échantillon.Sur la base de ces valeurs, sélectionnez un intervalle de mise au point et déterminez le nombre d’étapes focales nécessaires pour imager l’ensemble de l’échantillon à l’épaisseur apparente maximale. Ensuite, à faible grossissement, localisez la région d’intérêt dans l’échantillon. Ajustez la hauteur eucentrique de sorte que la valeur d’intérêt ne semble pas bouger lorsque l’échantillon est tourné.Vérifiez que le retour sur investissement reste visible sur toute la plage d’inclinaison. Remplissez les paramètres de la série d’inclinaison focale pour la collecte automatique d’images et acquérez les images. Importez la série d’images dans un programme de traitement d’images et alignez les images collectées au même angle d’inclinaison dans une hiérarchie pyramidale.Trouvez l’alignement à chaque angle d’inclinaison en empilant les images alignées. Parcourez la pile pour vous assurer que seule la zone sélectionnée se déplace d’une image à l’autre et réalignez les images si nécessaire. Une fois l’alignement vérifié dans l’ensemble de l’échantillon, fusionnez les informations de mise au point aux paramètres élevés pour obtenir la série avec une seule image par angle d’inclinaison.Effectuez l’alignement de la série d’inclinaison en fonction des minima locaux ou des repères. Effectuez une reconstruction 3D et inspectez l’image résultante. Si la reconstruction apparaît floue ou déformée, réalignez la série d’images d’origine.Un échantillon de T. brucei a été imagé et analysé à l’aide de cette méthode. À un angle d’inclinaison de zéro degré, plusieurs détails de la poche flagellaire sont visibles.À l’angle d’inclinaison plus élevé de 70 degrés, seule une partie de chaque image collectée dans la série focale traversante est nette. Cette position change tout au long de la série. En fusionnant les sections de mise au point, une seule image avec une zone de mise au point plus grande est produite.Cet effet est encore plus prononcé lorsque les zones à haute fréquence de la série d’inclinaison focale traversante sont mises en évidence. Les informations à haute fréquence couvrent la majeure partie de l’image combinée, ce qui indique que la série d’inclinaison focale traversante a été bien traitée. Une fois maîtrisée, la partie traitement d’image peut être réalisée en trois à quatre heures environ, selon les paramètres d’alignement et de reconstruction choisis.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité de la reconstruction finale dépend grandement de la qualité des tests d’alignement précédents. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la collecte et le traitement d’image d’une série d’inclinaison focale.

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