L'utilisation abordable tableaux LED pour photo-stimulation des neurones

L’objectif de cette procédure est de préparer et d’opérer à distance des réseaux de LED pour contrôler l’activité neuronale dans des tranches de cerveau. Ceci est accompli en utilisant des coupes in vitro d’animaux avec le canal REDSIN deux exprimant des neurones, et en utilisant un réseau de LED en conjonction avec un microscope pour activer ces neurones. Cette vidéo explique comment calibrer une LED et un microscope pour fournir des intensités de lumière connues à la chambre de tranche.

Avec cette configuration, les seuils d’activation des neurones exprimant le canal deux peuvent être mesurés avec précision en réponse à la stimulation lumineuse par une stimulation à large champ des neurones exprimant l’opsine du canal deux. Cette technique permet un contrôle optique temporairement précis d’une grande population neuronale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes optogénétiques existantes, y compris celles qui utilisent des lasers ou des méthodes basées sur l’obturateur, est qu’elle est très peu coûteuse et peut être facilement installée sur une lunette de serrage existante.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse adulte, notamment comment l’activité façonne-t-elle l’intégration de nouveaux neurones dans le cerveau adulte. Les implications de cette technique s’étendent aux thérapies ou aux diagnostics basés sur les cellules souches neurales adultes, car elle offre un contrôle temporel précis de l’activité des neurones nés à l’âge adulte qui s’intègrent dans les circuits neuronaux existants. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des conséquences fonctionnelles de la neurogenèse adulte, elle peut également être réalisée sur n’importe quelle préparation in vitro.

Contenir l’adoption du canal exprimant les neurones Commencez par sélectionner un réseau de LED qui produit sa puissance de crête à la longueur d’onde souhaitée. De plus, choisissez le réseau avec un courant nominal maximal. Intégrez le réseau de LED au microscope.

Commencez par fixer le réseau de LED à un ventilateur appelé dissipateur thermique à l’aide de pâte thermique pour augmenter l’efficacité du dissipateur thermique. Retirez ensuite la LED d’origine basse consommation de son ensemble de lentille et fixez la LED de puissance supérieure à la lentille. Remplacez maintenant la lampe Brightfield par l’appareil LED assemblé et assurez-vous que le ventilateur est solidement mis à la terre sur la masse commune du système.

Positionnement minutieux des matrices de LED nécessaires pour s’assurer que l’appel émis est aligné avec l’objectif. Objectif. Obtenez l’éclairage Kohler en focalisant le condenseur de sorte que l’image du diaphragme de champ soit focalisée sur la chambre de coupe et soit centrée sous le chemin optique des objectifs. Un mince tissu de papier d’objectif peut aider à focaliser l’image de l’ouverture arrière à d’autres profondeurs.

Maintenant, percez des trous d’épingle de diamètres connus dans un matériau opaque qui peut servir d’ouverture pour le wattmètre. Placez l’un de ces petits trous d’épingle sur le capteur du wattmètre optique. Fixez ensuite le wattmètre au microscope pour focaliser le condenseur sur le sténopé.

Positionnez manuellement le wattmètre jusqu’à ce qu’il donne une lecture maximale. Fixez le capteur de puissance dans cette position. Si le capteur de puissance maximum est au-dessus du plan de la tranche, rétablissez l’éclairage Kohler à ce plan.

Ensuite, ouvrez complètement toutes les ouvertures. Déplacez systématiquement le wattmètre par rapport au trajet de la lumière optique à l’aide des manipulateurs de platine. Une fois terminé, mesurez l’uniformité de la puissance optique dans la zone éclairée en prenant systématiquement des lectures de puissance dans une grille autour de la puissance maximale, qui doit se trouver sous la mise au point de l’objectif, Le microscope est correctement configuré avec un éclairage plus froid centré sur la mise au point des objectifs, la puissance maximale du réseau doit être à cette mise au point Les régions à l’extérieur de la mise au point doivent maintenant recevoir une quantité connue de puissance en fonction de l’uniformité complot.

Maintenant, mesurez la puissance maximale pour chaque trou d’épingle de taille en sachant quel diamètre de foret utilisé pour que chaque trou d’épingle trace la puissance optique en fonction de l’aire du trou d’épingle. Étant donné que les sténopés percés ne sont pas parfaits, la moyenne de ces valeurs produira une bonne estimation de la densité de puissance optique. Le réseau de LED va être utilisé pour patcher des optiques.

Assurez-vous de prendre en compte tous les éléments optiques nécessaires au patching lorsque vous construisez le tracé de puissance et le tracé d’uniformité. Par exemple, de nombreux microscopes ont un écran diffuseur rabattable que vous pouvez utiliser et qui sacrifiera la puissance au profit de l’uniformité. Préparez des coupes de tissu cérébral en utilisant des méthodes standard, et tout en laissant les tranches récupérer pendant 30 à 45 minutes dans un LCR A réchauffé, allez faire les pipettes de patch.

Une fois que les tissus se sont rétablis, placez délicatement une tranche dans la chambre d’enregistrement du microscope sous perfusion constante de LCR A oxygéné. Confirmer la présence du canal EYFP rouges dans deux canaux par épifluorescence sous éclairage fluorescent. Localiser dans la tranche un canal sain deux neurones EYFP à morphologie mature.

Localisez ensuite ce neurone soma sous l’optique du patch et produisez un joint giga ohm entre la membrane plasmique et les parois de l’électrode patch. Si l’électrode est suffisamment proche d’un neurone dopateur, l’activité spontanée devrait produire un potentiel de champ local mesurable, même sans joint giga ohm. Maintenant, activer le canal adopte deux dans ce neurone en clignotant différentes doses de lumière, car les doses de lumière, fonction de la puissance et de la durée de la LED, calculent la quantité de lumière nécessaire pour évoquer un potentiel d’action à plusieurs puissances et durées.

Un microscope Olympus BX 51 wi a été configuré avec une LED en ligne avec deux ouvertures et une lentille à condenseur. Un contraste en fond clair suffisant pour l’enregistrement par patch clamp a été obtenu en fermant à la fois le diaphragme de champ et le diaphragme d’ouverture. Un graphique d’uniformité de l’intensité lumineuse des LED a été construit dans une région autour du champ de vision objectif indiqué par le cercle pointillé.

Avec tous les diaphragmes complètement ouverts, les trancheuses ont été exposées à une puissance lumineuse maximale pour l’activation du canal. Cette configuration produit une lumière trois fois plus puissante que la configuration utilisée pour la visualisation par patch clamp. Un marquage généralisé des granules du bulbe olfactif et des neurones glomérulaires nés adultes a été observé quatre semaines après l’infection lentivirale des neuroblastes migrateurs dans le flux migratoire rostral.

Des enregistrements de patchs libres d’un seul canal Adoptin deux cellules granulaires exprimant EYFP ont indiqué que pour ce neurone, une stimulation de cinq millisecondes à la puissance maximale était suffisante pour provoquer un pic. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une après-midi. Il est important de se rappeler après cette procédure de toujours surveiller votre équipement et vos paramètres pour dériver au fil du temps Depuis leur développement, ces techniques optogénétiques ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer la transmission synaptique et l’intégration dans un certain nombre d’organismes modèles tels que le ver, la souris mouche et même le primate.