Name: Lutilisation abordable tableaux LED pour photo-stimulation des neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Apprenez à utiliser des tableaux LED abordables pour la photo-stimulation optogénétique de neurones adultes dans des coupes cérébrales. Cette méthode permet un contrôle précis de l'activité neuronale à faible coût.

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Ce travail a été soutenu par la compagnie d&#39;assurance vie &quot;AG2R-La Mondiale-&quot;, l&#39;Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), l&#39;Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-NEUR-004&quot; dans le cadre de «ERA-NET NEURON »du FP7 programme par la Commission européenne et la Fondation Pasteur. Sébastien Wagner a été soutenu par la Fondation Letten.

1. Calibrage optique: Mesure de LED <ol><li> Fixez une barrette de DEL à un dissipateur thermique activement refroidi par un ventilateur et apposer cette aparatus LED / radiateur à une lentille de collimation. </li><li> Remplacer la lampe utilisée en fond clair l'éclairage à LED / radiateur / ventilateur / appareil de l'objectif. Cet appareil doit être soigneusement placé de sorte que le faisceau LED collimaté se déplace le long d'une trajectoire rectiligne optiques vers la lentille de condenseur. Assurez-vous que le dissipateur / ventilateur est correctement mise à la terre commune du système. </li><li> Conduire le tableau LED avec une alimentation qui peut donner des impulsions rapides et carrés de courant. Cette alimentation peut être contrôlée par une impulsion de 5V TTL provenant d'un générateur d'impulsions. </li><li> Centrer le faisceau collimaté le long du trajet de la lumière défini entre le diaphragme de champ et de la lentille condenseur. Idéalement, le faisceau LED peu trop le diaphragme de champ complètement ouvert. Typiquement, un faisceau plus étroitement collimaté LED va remplir cette ouverture moins, et va produire MorPower E au détriment de l'uniformité. Dans notre configuration, nous avons augmenté l'uniformité de lumière en choisissant une lentille de collimation qui a projeté une image légèrement élargie de la matrice de LED à son plan conjugué au niveau du diaphragme consenser. </li><li> Atteindre éclairage de Köhler en concentrant le condenseur afin que l'image du diaphragme de champ (le diaphragme le plus proche de la source de lumière) est axé sur la chambre tranche (fig. 1). Un tissu mince de papier pour objectif peuvent agir comme un écran de projection pour visualiser l'image focalisée sur le diaphragme de champ à d'autres profondeurs. </li><li> Percer une série de trous de diamètre connu dans un matériau opaque. Placez un de ces trous petits sur le capteur d'une puissance-mètre optique. Placer le mesureur de puissance sur la scène spécimen et le centre du compteur de pouvoir sur l'image focalisée sur le diaphragme de champ en déplaçant simplement le compteur de puissance jusqu'à ce qu'il donne une valeur maximale. Apposez le wattmètre dans cette position. </li><li> Totalement ouvert toutes les ouvertures (diaphragme et aperaturediaphragme de champ). Systématiquement passer la tranche attachée de chambre / wattmètre par rapport à la lightpath optiques et de calculer l'uniformité de la puissance optique dans la zone éclairée. Construire l'intrigue d'uniformité pour votre système. Si le microscope est correctement configuré avec illumination Kohler centrée au foyer de l'objectif, la puissance maximale doit être directement en dessous de l'objectif, et les régions en dehors de cette focalisation doit maintenant recevoir une quantité connue de puissance en fonction de l'intrigue uniformité. </li><li> Pour chaque taille de trou d'épingle, de construire une courbe standard de puissance optique vs surface sténopé. En ajustant le courant d'entrée du tableau de LED, de produire cette courbe plusieurs niveaux de puissance et de chaque courbe de calculer la puissance par mm2. Si le tableau de LED est utilisé pour l'optique patch, assurez-vous d'introduire des éléments optiques nécessaires pour patcher (condenseurs, les piqûres et les filtres) pour savoir combien la lumière est transmise sous un éclairage patcher. </li><li> Retournement du wattmètre pourface à l'objectif, calculer l'intensité de l'éclairage à 470nm lorsque la lampe au mercure est allumé. </li><li> Ajouter une tranche en direct à la chambre, et de reconstruire les courbes standard pour déterminer la puissance lumineuse transmise à travers les tissus du cerveau de diffusion. </li></ol> 2. Procédure de tranchage et d'électrophysiologie Partie A: Préparation Trancher <ol><li> Anesthetize (60 mg / kg de kétamine et de xylazine 2mg/kg) et décapiter la souris. Disséquer le cerveau dans le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF, en mm: 124 NaCl, KCl 3, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 de glucose, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7,4 lors barbotage avec un mélange de O2 95% et 5% de CO 2 5,1), en prenant soin de ne pas endommager les bulbes olfactifs. Séparez les deux hémisphères et le lieu sur une gélose à la surface ventrale, même avec un bord (pour les sections horizontales). </li><li> Collez l'agar-agar et la surface dorsale de chaque hémisphère cortical à l'vibrAtome Chuck, et lentement, remplissez la baignoire avec glacée ACSF. Trancher de la surface ventrale dans 300 sections um, le transfert de chaque section pour réchauffé (34-36 ° C) et oxygénées ACSF, leur permettant de récupérer pendant 30-45 minutes. </li></ol> Partie B: Mesure Patch en vrac du Seuil à Spike <ol start="3"><li> Après avoir porté les tranches à la température ambiante pendant 30 minutes, placez doucement une tranche dans la chambre d'enregistrement de la chambre de microscope sous perfusion constante de l'ACSF oxygénée. Au risque de trop stimuler CHR2 neurones infectés, la présence de EYFP-CHR2 peut être confirmée en vertu épifluorescence (fig. 2a) </li><li> Tirez électrodes de verre sur un extracteur de pipette (Sutter P-97). Remplissez cette électrode avec l'ACSF. Lorsqu'il est placé dans le bain ACSF la résistance de pointe devrait être entre 7-10 MOhms. </li><li> Sous un éclairage fluorescent, de localiser dans la tranche d'une saine CHR2-EYFP neurone avec une morphologie mature. Également localiser le soma ce neurone dans le cadre de l'optique patcher. </li><li> Avec une pression positive lumière passait à travers la pointe de l'électrode, l'électrode inférieure correctif vers le neurone identifié fluorescentes. Quand le contact est fait de membrane, de libérer rapidement la pression positive et appliquez une petite quantité et brève de l'aspiration à travers la pointe. Un sceau de giga-ohms doit être faite entre la membrane plasmique et les murs de l'électrode de patch. </li><li> Même si un giga-joint n'est pas formé, si l'électrode est suffisamment proche d'une activité des neurones fluorescents dopage devrait produire un potentiel de champ mesurable locales. Activer CHR2 dans ce neurone par le clignotement des doses différentes de la lumière. Parce que la lumière dose est fonction de deux LED d'alimentation et de la durée, calculer la quantité de lumière est nécessaire pour évoquer un potentiel d'action à des puissances et des durées multiples (fig. 2b). Aussi observer combien de dopage se produit sous une lampe à mercure d'éclairage. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Sur notre microscope (Olympus BX51WI), notre LED est in ligne avec deux ouvertures et un condenseur, maintenant ainsi le chemin optique d'origine de l'usine installée lampe à arc. En fermant la fois le diaphragme de champ et le diaphragme aperature, nous pouvons obtenir un contraste suffisant pour fond clair enregistrements de patch-clamp (Fig. 1b). Avec tous les diaphragmes totalement ouverte, nous exposent la tranche à puissance lumineuse maximale pour channelrhodopsin activation (figure 1A). Sur notre microscope, cette configuration patcher produit à faible densité qui est d'environ trois ordres de grandeur inférieure à la densité maximale plein champ (4,1 uW / mm 2 versus 6,88 mW / mm 2). Nous voyons l'étiquetage robuste de l'adulte née granules bulbe olfactif et des neurones periglomerular semaines après l'infection de la migration des neuroblastes lentiviral dans le flux migratoire rostrale (fig. 2a) Un enregistrement lâche-correctif à partir d'un seul adulte-né CHR2-EYFP exprimer cellules granulaires indique que une stimulation de 5 ms chez Maximeuh la puissance (6,88 mW / mm 2) est suffisante pour évoquer dopage (fig. 2b). Depuis le niveau d'expression varie entre les cellules, la quantité de lumière qui passe le seuil à pic sera variable et devrait être décrit statistiquement pour chaque type de cellule d'intérêt. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. DEL de configuration réseau pour le plein champ photostimulation et l'électrophysiologie tranche de patch-clamp. Pour activer channelrhodopsin (CHR2) nous projettent un faisceau collimaté à travers les ouvertures dos ouvert et l'optique condenseur (a). Cette configuration peut être modifiée en optique à contraste élevé patcher par la fermeture complète du diaphragme de champ et la modulation de la largeur du diaphragme de champ (b). Abréviations: a. ventilateur, radiateur b., c. LED array, d. lentille de collimation, e. miroir, diaphragme de champ f., g. ouverture de diaphragme, condenseur h., i. SAstade de mple, J. objectif. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Image d'une tranche horizontale de 300 um bulbe olfactif pour le patch-clamp et de l'ensemble du champ de photostimulation (a). Lentivirally cellules infectées par des granules pour adultes-né exprimer CHR2-EYFP peut être vu rayonnant à partir du noyau du bulbe olfactif. La lumière-dose requise pour évoquer dopage peuvent être trouvés en augmentant la durée du flash à LED (b). Le seuil de cette cellule a été granules 5ms à intensité LED complet (2.43mW/mm 2). Échelle en (a) = 500 um, de l'échelle en (b) = 50 ms.

<ol><li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li>
<li>Apicella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+Cells+in+Piriform+Cortex+Receive+Convergent+Input+from+Distinct+Olfactory+Bulb+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli.</a> Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature. 8, 1263-1263 (2005).</li>
<li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+the+first+synapse+in+olfaction%3A+development+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis.</a> The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-breakers%3A+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).</li>
<li>Grossman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+optical+excitation+using+ChR2+and+micro-LED+array%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array.</a> Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).</li>
<li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li>
<li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li>
<li>Toni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+born+in+the+adult+dentate+gyrus+form+functional+synapses+with+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells.</a> Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.</li>
<li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ces dernières années ont vu une explosion de la popularité des outils de recherche en neurosciences pour optogénétique 6. En conséquence, il est plus important d&#39;abaisser la barrière d&#39;entrée pour les laboratoires qui désirent commencer à utiliser ces nouveaux outils. Nous décrivons ici comment procéder à une rénovation simple et peu coûteuse et l&#39;étalonnage d&#39;un classique de patch-clamp banc afin qu&#39;il puisse faire plein champ stimulation optique de channelrhodopsin exprimant neurones. En...

<table><tbody><tr><td>Kétamine</td><td>Imalg&amp;#232;ne 1000</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Rompun</td><td></td><td>2 %</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>&amp;amp;nbps;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Tire-pipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150T-10</td><td>1,5 mm de diamètre extérieur / 1,17 mm de diamètre intérieur</td></tr><tr><td>Matrice de LED</td><td>Bridgelux</td><td>BXRA-C2000</td><td></td></tr><tr><td>Objectif collimateur</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDC1</td><td>40 mm de diamètre du faisceau</td></tr><tr><td>Alimentation électrique</td><td>A1W Electronik</td><td>HKO2800</td><td>2,8 ampère</td></tr><tr><td>Mesureur de puissance optique</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM 100</td><td></td></tr><tr><td>Dissipateur thermique</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Ventilateur</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation abordable tableaux led pour photo-stimulation des neurones

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Électrophysiologie tranche standard a permis aux chercheurs de sonder les composantes individuelles des circuits neuronaux par l&#39;enregistrement des réponses électriques des cellules individuelles en réponse à des manipulations électriques 1,2 ou pharmacologiques. Avec l&#39;invention de méthodes pour le contrôle des neurones génétiquement optiquement ciblées (optogénétique), les chercheurs ont désormais un niveau sans précédent de contrôle sur des groupes spécifiques de neurones dans la préparation tranche standard. En particulier, photosensibles channelrhodopsin-2 (CHR2) permet aux chercheurs d&#39;activer des neurones avec 3,4 lumière. En combinant l&#39;étalonnage minutieux des LED à base de photostimulation CHR2 à l&#39;électrophysiologie tranche de la norme, nous sommes en mesure de sonder avec plus de détails sur le rôle de l&#39;adulte-né interneurones dans le bulbe olfactif, premier relais central du système olfactif. En utilisant l&#39;expression virale des CHR2-YFP spécifiquement chez l&#39;adulte-né neurones, nous pouvons contrôler sélectivement les jeunes adultes-né des neurones dans un milieu d&#39;une ancienneneurones d matures. Notre contrôle optique utilise un système simple et peu coûteux à LED, et nous montrons comment ce système peut être calibré pour bien comprendre comment la lumière est nécessaire pour évoquer l&#39;activité de dopage dans les neurones unique. Ainsi, de brefs éclairs de lumière bleue peut contrôler à distance le modèle tirs de CHR2-cellules transduites nouveau-né.

Adulte-né neurones exprimant CHR2 peuvent être manipulés dans des préparations tranche électrophysiologiques afin d&#39;examiner leur contribution à la fonction de olfactive circuits neuronaux.

L&#39;utilisation abordable tableaux LED pour photo-stimulation des neurones

L'électrophysiologie standard sur coupes a permis aux chercheurs de sonder les composants individuels des circuits neuronaux en enregistrant les réponses électriques de neurones isolés...

L'objectif de cette procédure est de préparer et de faire fonctionner à distance des réseaux de DEL afin de contrôler l'activité neuronale dans des tranches cérébrales. Cela est réalisé à l'aide de tranches in vitro provenant d'animaux dont les neurones expriment le canal REDSIN deux, et à l'aide d'un réseau de DEL combiné à un microscope pour activer ces neurones. Cette vidéo explique comment étalonner une DEL et un microscope afin de délivrer des intensités lumineuses connues dans la chambre contenant la tranche.Avec ce dispositif, les seuils d'activation des neurones exprimant le canal deux peuvent être mesurés avec précision en réponse à une stimulation lumineuse par stimulation en champ large des neurones exprimant l'opsine du canal deux. Cette technique permet un contrôle optique temporellement précis d'une grande population neuronale. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes optogénétiques existantes, y compris celles utilisant des lasers ou des systèmes basés sur des obturateurs, est qu'elle est très peu coûteuse et peut être facilement adaptée à un microscope existant pour enregistrement en patch clamp.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse adulte, notamment comment l'activité façonne l'intégration de nouveaux neurones dans le cerveau adulte. Les implications de cette technique s'étendent vers des thérapies ou des diagnostics fondés sur les cellules souches neuronales adultes, car elle offre un contrôle temporel précis de l'activité des neurones nés à l'âge adulte qui s'intègrent dans les circuits neuronaux existants. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les conséquences fonctionnelles de la neurogenèse adulte, elle peut également être réalisée sur toute préparation in vitro.Contenant des neurones exprimant des canaux Commencez par sélectionner un réseau de DEL produisant sa puissance maximale à la longueur d'onde souhaitée. En outre, choisissez le réseau possédant une intensité maximale admissible. Intégrez le réseau de DEL au microscope.Commencez par fixer le réseau de LED à un ventilateur appelé dissipateur thermique à l'aide de pâte thermique afin d'augmenter l'efficacité du dissipateur. Ensuite, retirez la LED d'origine basse puissance de son ensemble de lentilles et fixez la LED plus puissante sur la lentille. Remplacez maintenant la lampe de champ clair par le dispositif de LED assemblé, et assurez-vous que le ventilateur est correctement mis à la masse commune du système.Un positionnement précis des matrices de LED est nécessaire pour s'assurer que la lumière émise par l'appel est alignée avec l'objectif. Objectif. Obtenir une illumination de Köhler en focalisant le condenseur de manière à ce que l'image du diaphragme de champ soit mise au point sur la chambre de coupe et centrée sous le trajet optique de l'objectif. Un fin morceau de papier essuie-lentilles peut aider à focaliser l'image de l'ouverture arrière à d'autres profondeurs.À présent, percez des trous de diamètres connus dans un matériau opaque pouvant servir d'ouverture pour le puissancemètre. Placez l'un de ces petits trous sur le capteur du puissancemètre optique. Fixez ensuite le puissancemètre au microscope afin de focaliser le condenseur sur le trou.Positionner manuellement le puissancemètre jusqu'à ce qu'il affiche une lecture maximale. Fixer le puissancemètre dans cette position. Si le maximum du puissancemètre se situe au-dessus du plan de la coupe, rétablir l'éclairage de Köhler à ce plan.Ensuite, ouvrez complètement toutes les ouvertures. Déplacez systématiquement le puissancemètre par rapport au trajet optique de la lumière à l’aide des manipulateurs de la platine. Une fois terminé, mesurez l’uniformité de la puissance optique dans la zone éclairée en effectuant systématiquement des relevés de puissance selon une grille autour de la puissance maximale, qui doit se situer sous le foyer de l’objectif. Le microscope est correctement configuré lorsque l’illumination plus froide est centrée sur le foyer de l’objectif : la puissance maximale du réseau doit se trouver à ce foyer, et les régions situées en dehors du foyer doivent désormais recevoir une quantité connue de puissance, conformément au graphique d’uniformité.Mesurez maintenant la puissance maximale pour chaque diamètre de diaphragme en tenant compte du diamètre de la mèche utilisée pour réaliser chaque diaphragme, puis tracez la puissance optique en fonction de la surface du diaphragme. Étant donné que les diaphragmes percés ne sont pas parfaits, la moyenne de ces valeurs fournira une bonne estimation de la densité de puissance optique. Le réseau de LED sera utilisé pour l'optique de patch.Veillez à tenir compte de tous les éléments optiques nécessaires pour le patch-clamp lors de la création du graphique de puissance et du graphique d'uniformité. Par exemple, de nombreux microscopes sont équipés d'un écran diffuseur basculable que vous pouvez utiliser, au prix d'une perte de puissance, afin d'améliorer l'uniformité. Préparez des tranches de tissu cérébral selon des méthodes standard, puis, pendant que les tranches se reconstituent pendant 30 à 45 minutes dans un liquide ACSF chauffé, préparez les micropipettes de patch. Une fois que les tissus se sont rétablis, déposez délicatement une tranche dans la chambre d'enregistrement du microscope sous perfusion constante de liquide céphalorachidien (ACSF) oxygéné. Vérifiez la présence du canal EYFP reds dans deux canaux par épifluorescence sous éclairage fluorescent. Repérez dans la tranche un neurone EYFP sain du canal deux présentant une morphologie mature.Ensuite, localisez le soma de ce neurone sous l'optique de patch-clamp et établissez un scellement de gigaohm entre la membrane plasmique et les parois de l'électrode de patch. Si l'électrode est suffisamment proche d'un neurone actif, une activité spontanée devrait produire un potentiel de champ local mesurable, même en l'absence de scellement de gigaohm. Activez maintenant le canal adopté deux dans ce neurone en appliquant différentes doses de lumière, car la dose de lumière dépend à la fois de la puissance et de la durée de la LED ; calculez la quantité de lumière nécessaire pour déclencher un potentiel d'action à plusieurs puissances et durées.Un microscope Olympus BX 51 wi a été configuré avec une LED alignée sur deux diaphragmes et une lentille condenseur. Un contraste suffisant en champ clair pour l'enregistrement en mode patch clamp a été obtenu en fermant à la fois le diaphragme de champ et le diaphragme d'ouverture. Un graphique de l'uniformité de l'intensité lumineuse de la LED a été établi dans une région entourant le champ de vision de l'objectif, indiqué par le cercle en pointillés.Avec tous les diaphragmes complètement ouverts, les coupeuses ont été exposées à une puissance lumineuse maximale pour l'activation du canal adoptin. Cette configuration produit une lumière trois ordres de grandeur plus puissante que celle utilisée pour la visualisation en enregistrement en patch. Une marquage étendu des neurones granulaires et péri-glomérulaires nés à l'âge adulte a été observé quatre semaines après l'infection lentivirale des neuroblastes migrateurs dans le courant migrant rostral.Des enregistrements en mode patch lâche effectués sur un canal unique de cellules granuleuses exprimant l'EYFP ont indiqué que, pour ce neurone, une stimulation de cinq millisecondes à puissance maximale suffisait à déclencher des potentiels d'action. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une après-midi. Il est important de toujours surveiller, après cette procédure, l'évolution de vos équipements et de vos paramètres au fil du temps. Depuis leur développement, ces techniques optogénétiques ont ouvert la voie aux chercheurs en neurosciences pour explorer la transmission et l'intégration synaptiques chez plusieurs organismes modèles tels que le ver, la mouche, la souris et même le primate.

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Neurones adultes-né du bulbe olfactif peut être contrôlé à l'aide optogenetically Channelrhodopsin2 exprimant l'injection lentiviral dans le flux migratoire et rostrale photostimulation chronique avec une miniature implanté à LED.

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Nous décrivons ici notre stratégie pour obtenir des enregistrements unitaires stables et bien isolés à partir d’interneurones inhibiteurs identifiés dans le cortex de souris anesthésié. Les neurones exprimant ChR2 sont identifiés par leur réponse à la lumière bleue. La méthode utilise un équipement d’enregistrement extracellulaire standard et constitue une alternative peu coûteuse à l’imagerie calcique ou au patching guidé visuellement.

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Dans le cœur, les événements moléculaires coordonnent la fonction électrique et contractile de l'organe. Un ensemble de techniques de microscopie de fluorescence de champ locales présentées ici permet l'enregistrement des variables cellulaires dans les cœurs intacts. mécanismes définissant la fonction cardiaque Identifier est essentiel dans la compréhension comment le cœur fonctionne dans des situations pathologiques.

Champ local Fluorescence Microscopy: Imagerie signaux cellulaires dans les coeurs intacts

Ce protocole décrit comment effectuer des expériences optogénétiques pour contrôler l’expression des gènes avec la lumière rouge et rouge lointain en utilisant PhyB et PIF3. Vous y trouverez des instructions étape par étape pour la construction d’un système d’éclairage simple et flexible, qui permet le contrôle de l’expression génique ou d’autres optogénétiques avec un ordinateur.

Construire un système d’éclairage simple et polyvalent pour les expériences optogénétiques

Ici, nous présentons la méthode de fabrication d’un système optrode avec des fibres optiques pour la livraison de lumière et un réseau d’électrodes pour l’enregistrement neuronal. Des expériences in vivo avec des souris transgéniques exprimant la channelrhodopsine-2 montrent la faisabilité du système pour la stimulation optogénétique simultanée et l’enregistrement électrophysiologique.

Optrode Array pour la modulation optogénétique simultanée et l’enregistrement neuronal électrique

Les développements récents dans la recherche sur la douleur mettent en évidence le potentiel de la photoneuromodulation à l’aide de diodes électroluminescentes vertes (GLED) comme traitement non pharmacologique. GLED module les voies de la douleur, offrant un soulagement efficace de la douleur. Cet article vise à normaliser et à affiner les protocoles d’exposition au GLED, à améliorer la cohérence entre les études et à faire progresser l’application clinique de cette thérapie.

Optimisation des techniques de photoneuromodulation pour évaluer le rôle des diodes électroluminescentes vertes dans la gestion de la douleur

Apprenez à utiliser des tableaux LED abordables pour la photo-stimulation optogénétique de neurones adultes dans des coupes cérébrales. Cette méthode permet un contrôle précis de l'activité neuronale à faible coût.

L'utilisation abordable tableaux LED pour photo-stimulation des neurones

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