Visualisation et cartographie des voies neuronales dans une tranche de cerveau d’amygdale

Dans le cerveau de la souris, l’amygdale contient des neurones qui forment des connexions synaptiques avec le cortex préfrontal médian, ou neurones mPFC.

Prenez une tranche de cerveau d’amygdale dans laquelle les neurones mPFC expriment un canal sensible à la lumière, la rhodopsine fusionnée à une protéine fluorescente.

Placez la tranche dans une chambre d’enregistrement et visualisez-la au microscope à fluorescence pour localiser les neurones mPFC.

Passez à une vue en fond clair et introduisez une pipette patch contenant une solution interne.

Appliquez une pression positive pour faire avancer la pipette vers un neurone de l’amygdale.

Au contact neuronal, une fossette se forme.

Appliquez une aspiration pour former un joint étanche.

Continuez l’aspiration pour rompre la membrane, en établissant un contact avec l’intérieur de la cellule.

Illuminez la tranche pour activer la canalisation neuronale mPFC, la rhodopsine, déclenchant l’afflux d’ions positifs, la génération de potentiel d’action et la libération de neurotransmetteurs.

Les neurotransmetteurs se lient aux récepteurs neuronaux de l’amygdale postsynaptiques, provoquant un afflux d’ions et une génération de courant.

Enregistrer le courant neuronal postsynaptique pour analyser la connectivité mPFC-amygdale.

Pour préparer le microscope patch à l’activation optogénétique des fibres et des cellules, centrez la diode électroluminescente, ou LED, montée sur la voie de diffusion de la lumière. Utilisez un wattmètre pour mesurer l’intensité de la lumière LED au niveau du plan focal arrière et à la sortie de chaque objectif à une longueur d’onde de 470 nanomètres. À l’aide d’une feuille de calcul, calculez l’intensité lumineuse en milliwatts par millimètre carré et créez une courbe d’étalonnage pour chaque objectif.

Ensuite, récupérez une tranche aiguë de l’amygdale dans la chambre d’interface et placez-la dans la chambre de coupe montée sur le microscope. Positionnez la tranche de manière à ce que la surface de la tranche tournée vers le haut dans la chambre d’interface soit également orientée vers le haut dans la chambre d’enregistrement. Perfuser la tranche avec de l’ACSF frais et oxygéné à raison de 1 à 2 millilitres par minute. La température doit être d’environ 31 degrés Celsius. Allumez la lampe fluorescente et sélectionnez les ensembles de filtres appropriés pour la protéine fluorescente spécifique exprimée. Utilisez l’objectif 5x pour obtenir une vue d’ensemble.

Ensuite, ouvrez ou limitez l’ouverture dans le trajet de la lumière du microscope, si nécessaire pour l’expérience. Pour obtenir un enregistrement de patch, remplissez une pipette patch avec la solution interne et montez-la dans le porte-électrode. Appliquez une pression positive sur la pipette patch et abaissez-la lentement dans la solution du bain. Ensuite, sous contrôle visuel, utilisez le micromanipulateur pour abaisser la pipette patch dans la tranche. Approchez le neurone d’intérêt avec la pipette patch par le côté et le haut.

Relâchez la pression positive lorsque la pipette atteint la surface de la cellule, comme l’indique une fossette visible à la surface de la cellule. Appliquez une pression négative pour obtenir un gigaseal. Appliquez une aspiration supplémentaire pour rompre le patch membranaire et obtenir l’enregistrement de la cellule entière. Ensuite, stimulez les fibres marquées avec la LED connectée en activant la channelrhodopsine avec une lumière de longueur d’onde de 470 nanomètres tout en enregistrant les réponses électriques de la cellule.

Pour la stimulation synaptique, utilisez les sorties numériques du logiciel d’acquisition de données pour déclencher la LED. Réglez manuellement l’intensité de la stimulation LED. Répétez la stimulation avec une ouverture ouverte ou restreinte si nécessaire pour la cellule suivante enregistrée, ou en présence de substances d’essai spécifiques.