Analyse quantitative des migrations au hasard des cellules en utilisant la microscopie vidéo time-lapse

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer quantitativement la migration des cellules en temps réel à l’aide de la microscopie vidéo time lapse. Ceci est réalisé en enrobant d’abord une plaque de culture à six puits de collagène, puis en ensemenceant avec parcimonie les cellules d’intérêt sur la plaque revêtue. Dans un deuxième temps, une plaie est créée dans la plaque à l’aide d’une pointe de pipette, ce qui garantit un espace suffisant pour la migration.

Ensuite, le microscope est installé et les images sont capturées à intervalles réguliers à l’aide d’un système de contrôle de la température pour permettre un suivi continu des cellules en migration en temps réel. En fin de compte, le protocole de suivi des particules est utilisé pour évaluer les différences de vitesse moyenne et de déplacement total des cellules de test et de contrôle. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le test de migration en chambre d’évitement, est qu’elle n’est pas basée sur des mesures quantitatives de migration finales.

Au lieu de cela, il permet de surveiller et de calculer différents paramètres en continu. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, telles que comment des gènes ou des médicaments particuliers affectent-ils la migration des cellules tumorales ? Deux jours avant l’intervention, ajoutez 1,5 millilitre de collagène dilué dans un opti media dans chaque puits d’une plaque de culture à six puits, puis incubez la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius un jour avant l’intervention.

Remettez en suspension les cellules d’intérêt dans deux millilitres de DMEM plus FBS par puits et transférez les cellules dans chaque puits de la plaque recouverte de collagène ENC, en incubant les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le jour de l’intervention. Utilisez une pointe de pipette pour créer une plaie dans les cellules cultivées pendant la nuit et lavez chaque puits avec du PBS pour éliminer tous les débris qui se sont formés à la suite de la plaie.

Ajoutez DMEM plus FBS dans les puits rincés, puis vérifiez au microscope pour confirmer qu’un espace propre a été créé pour la plaie. Après avoir allumé la caméra du microscope et l’appareil d’imagerie de cellules vivantes, positionnez la plaque sur la platine du microscope. Couvrez la plaque près de la nouvelle chambre de contrôle de l’environnement de la cellule vivante et réglez le thermostat sur 37 degrés Celsius et le dioxyde de carbone sur 5 %Ouvrez maintenant le logiciel du livre de diapositives dans la barre de menus.

Sélectionnez la commande de mise au point en cliquant sur le bouton F dans un cercle. Dans la boîte d’objectif, utilisez la fenêtre déroulante pour définir l’objectif Dans la boîte de filtres, sélectionnez les paramètres pour diriger le chemin de la lumière vers la pièce I. Sélectionnez le filtre approprié pour l’éclairage en champ vif, puis cliquez sur ouvrir Bright.

Pour ouvrir l’obturateur à fond clair. Sélectionnez maintenant le filtre de champ clair sur la tourelle et visualisez l’échantillon à travers l’oculaire pour trouver les champs appropriés et faire la mise au point sur l’échantillon. Déplacez ensuite la tourelle du filtre pour modifier la trajectoire de la lumière vers l’appareil photo Pour la capture d’image dans le logiciel du diaporama, cliquez sur la commande de mise au point, sélectionnez XY pour sélectionner différentes positions à travers la pièce I, puis cliquez sur définir le point pour verrouiller chaque emplacement.

Pour la capture d’image, ajustez manuellement la mise au point de l’image de la caméra affichée à l’écran, puis utilisez les outils de la fenêtre des commandes de mise au point pour ajuster la position Z de la scène. Pour de meilleurs résultats, concentrez-vous sur les protubérances cellulaires plates près du contact avec la plaque pour faciliter la mise au point. Utilisez le curseur pour régler les temps d’exposition afin qu’ils soient dans une plage appropriée pour la mise au point.

Si plusieurs positions XY ont été sélectionnées, ajustez la mise au point pour chaque position individuelle en sélectionnant la commande de mise au point. Puis xy, puis point de visite. Dans le diaporama, sélectionnez le graphique de l’appareil photo dans la barre de menus, sélectionnez le type de capture, puis time lapse pour sélectionner la durée de l’expérience.

Dans le menu déroulant, saisissez le délai souhaité entre le début d’un point temporel et le début du suivant. Dans les champs d’intervalle, le troisième champ sera automatiquement calculé à partir des valeurs saisies manuellement. Sous Capture XY multiple, sélectionnez Liste multipoint pour les expériences avec plusieurs positions XY.

Enfin, nommez le fichier pour l’enregistrer, allez dans le contrôle de capture et sélectionnez avancé, puis spoule. Ensuite, capturez en mémoire et enregistrez dans le fichier spool Après chaque point de temps. Commencez par cliquer sur l’image.

Dans la barre de menus du diaporama, sélectionnez importer dans le menu déroulant, puis cliquez sur spoule du diaporama. Sélectionnez les fichiers de diaporama générés à partir de l’expérience de migration pour différents champs et points chronologiques. Ouvrez le premier fichier, puis sélectionnez masque dans la barre de menu et choisissez protocole de suivi des particules dans le menu déroulant.

Dans le menu Suivi des particules, choisissez Protocole de suivi manuel des particules. Une fenêtre s’affiche avec les points de début et de fin Pour analyser la migration aléatoire, sélectionnez le masque, puis le protocole de suivi des particules. Encore une fois, pour déterminer les coordonnées du centre de l’objet, sélectionnez le centre de l’aire.

Cliquez ensuite sur suivre et continuer. Choisissez maintenant les statistiques souhaitées pour chaque chemin, telles que le déplacement et la vitesse moyenne. Comme illustré ici, cliquez sur calculer pour afficher les statistiques.

Cet encadré présente un exemple d’analyse de migration aléatoire quantifiée en termes de vitesse. Dans le graphique de Whiskers, dans cette expérience, il y a eu une augmentation de la vitesse moyenne dans les cellules M-D-A-M-B 2 31 avec un gène suppresseur de tumeur renversé. Par rapport aux cellules témoins M-D-A-M-B 2 31 ici, la migration aléatoire des cellules à partir de la première figure a été analysée en termes de déplacement cellulaire.

Encore une fois, le groupe knockdown du gène suppresseur de tumeur total présentait un déplacement cellulaire accru par rapport au groupe témoin M-D-A-M-B 2 31. Les cellules de ce contrôle de film de microscopie vidéo en accéléré MDA MB 2 31 cellules ont été placées sur du collagène pendant la nuit. Les images ont ensuite été prises à des intervalles d’une heure pour un total de 18 heures lors d’une migration aléatoire.

Notez comment les cellules s’éloignent de leur position d’origine au fil du temps. Dans ce film, la migration des cellules testées M-D-A-M-B 2 31 après l’ensemencement nocturne sur le collagène a été enregistrée et analysée. Notez que les cellules de test sont plus migratrices que les cellules de contrôle du film précédent.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’invasion cellulaire et les dynas peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que, quels sont les rôles des cellules dans les métastases cancéreuses après son développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la migration cellulaire à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses isolées.