Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit
12 décembre 2011
Ici nous démontrons l'nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Deux cellules du développement embryonnaire scène avec des spermatozoïdes congelés-décongelés a été améliorée de manière cohérente dans cinq souches de souris à l'utilisation de ce kit. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et plus tard avec succès récupéré par FIV.
L'objectif général de cette procédure est de cryoconserver du sperme de souris. Cela est réalisé en prélevant d'abord du sperme à partir de spermatozoïdes de souris à l'aide de pailles destinées à la cryoconservation. Les pailles sont ensuite congelées dans de l'azote liquide, où elles sont stockées jusqu'à leur récupération par décongélation dans de l'eau tiède.
Les spermatozoïdes de souris récupérés sont finalement utilisés pour la fécondation in vitro. Le principal avantage de ce kit par rapport aux méthodes existantes est qu'il contient tous les matériaux nécessaires à la cryoconservation et à la récupération des spermatozoïdes de souris. Généralement, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés à manipuler et charger les pailles. Commencez par assembler 15 pailles de cryoconservation du sperme par lignée de souris à cryoconserver.
Tout d'abord, reliez chaque paille de 0,25 millilitre à une seringue d'un millilitre, le bouchon en coton étant placé le plus près possible de la seringue. Ensuite, chargez huit centimètres de milieu de FIV dans chaque paille, suivis d'un centimètre d'air. Enfin, étiquetez chacune des 15 pailles avec le nom de la lignée à préserver pour chaque lignée devant être cryoconservée.
Remplir une cavité d'une plaque à quatre puits avec 240 microlitres d'agent cryoprotecteur. Fixer une pipette d'un millilitre au manche du récipient de congélation afin d'allonger ce dernier. Enfin, remplir la boîte isolée en mousse fournie avec le kit avec 15 centimètres de diazote liquide et fermer le couvercle euthanasier.
Deux souris mâles adultes fertiles. Pour chaque lignée à cryoconserver, retirer chirurgicalement les épididymes caudales. Placer la souris en décubitus dorsal et ouvrir la paroi abdominale ventrale.
Tirer doucement sur le cordon déférent et retirer tout excès de graisse. Ensuite, localiser l'épididyme et le retirer intact avec un petit morceau de cordon déférent. Placer les EPI dans une cavité d'une plaque quadruple préparée contenant du CPA, sous un microscope stéréoscopique.
Effectuez cinq à sept incisions longitudinales dans chaque épididyme. Ensuite, à l’aide de pinces, pressez délicatement chaque incision. Pour expulser les spermatozoïdes, incubez le mélange d’APA et d’épididyme à température ambiante pendant trois à cinq minutes.
Agiter doucement la boîte à la main deux à trois fois pendant l'incubation. Cela permettra aux spermatozoïdes de sortir par aspiration. Charger chaque paille préparée avec cinq millimètres de la suspension de spermatozoïdes, suivis d'un centimètre d'air.
Il est important pour le processus de congélation que toutes les pailles soient chargées de manière identique. Après avoir chargé les 15 pailles, scellez soigneusement chaque extrémité des pailles par thermosoudure. Afin de garantir la survie des spermatozoïdes, effectuez l'ensemble du processus pour les 15 pailles dans un délai de 10 minutes.
Une fois toutes les pailles préparées, chargez-les dans la colonne à sperme du canister de congélation. Placez d'abord le canister dans la boîte en mousse et laissez-le flotter verticalement dans l'azote liquide. Le canister doit flotter verticalement pendant 10 minutes, faute de quoi la vitesse de congélation du sperme serait affectée.
Plongez ensuite la capsule dans l'azote liquide. Ainsi, le sperme est cryopréservé et prêt pour un stockage à long terme dans l'azote liquide. Environ 60 heures avant une récupération planifiée du sperme.
Suivez le protocole écrit pour superovuler les femelles avant la FIV. Pour chaque paille à décongeler, préparez et équilibrez tous les milieux pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ces matériaux comprennent une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant une goutte de 90 microlitres de milieu de traitement des spermatozoïdes recouverte d'huile.
Une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant trois millilitres de milieu IVF servant de boîte de sectionnement, et pour chaque groupe de cinq femelles superovulées, préparer une boîte IVF, soit une cavité d'une boîte à quatre cavités remplie de 500 microlitres de milieu IVF. Pour chaque boîte IVF, préparer une boîte de lavage, constituée d'une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant trois millilitres de KSOM, et une boîte de culture embryonnaire, constituée d'une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant des gouttes de 50 microlitres de milieu KSOM recouvertes d'huile. Une fois tous les matériaux nécessaires préparés, retirer rapidement une paille du stockage et la placer dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes.
Séchez la paille. Ensuite, effectuez une coupe en biais dans la colonne d'air située sous le bouchon de coton. À l'autre extrémité de la paille, réalisez une autre coupe en biais au-dessus d'une autre colonne d'air.
Évitez de couper la colonne de spermatozoïdes. Aspirez maintenant la suspension de spermatozoïdes à l'extrémité de la paille à l'aide d'une pipette de 200 microlitres et déposez-la au centre du milieu de traitement des spermatozoïdes. Ensuite, incubez la boîte pendant 45 à 60 minutes.
Pendant l'incubation des spermatozoïdes, isoler les CU des femelles superovulées et les transférer dans la boîte de dissection. Utiliser une aiguille de calibre 30 ou une pince pour déchirer chaque oviducte et libérer les complexes cumulus-oocyte. Transférer les CC provenant de cinq femelles dans chaque fécondation in vitro.
Eh bien, avec une quantité minimale de milieu. Évitez de transférer du tissu adipeux et du sang, car un milieu contaminé inhibe l'efficacité de la fécondation. Après l'incubation, prélève 10 à 15 microlitres de la suspension de spermatozoïdes à la périphérie de la goutte de STM et dépose la suspension dans un IVF.
Co-cultivez maintenant les cellules pendant quatre à six heures pour la fécondation. Après la fécondation, faites passer les embryons par au moins deux lavages avec du SOM 2K dans la boîte de lavage. Ensuite, réalisez la culture.
Les embryons sont maintenus dans le KSOM jusqu'à l'obtention du stade de développement souhaité. Des spermatozoïdes provenant de cinq souches consanguines de souris Charles River ont été congelés. Les taux de protection de la mobilité et de la mobilité progressive rapide des spermatozoïdes variaient de 81 % à 47 % selon les cinq souches.
Les taux de FIV avec du sperme congelé-dégelé ont varié selon les souches, de 26 à 88 % sur une période d'un an et demi. Un total de 49 lignées de souris génétiquement modifiées a été préservé par cryoconservation du sperme et ultérieurement récupéré par FIV à l’aide de quatre souches femelles différentes. C 57 black six BC DBA one et 1 29 SV Une fois la technique de cryoconservation du sperme maîtrisée, elle peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement.
Pour cette procédure, il est important d'acheminer le flux vers le réservoir de manière verticale et dans de l'azote liquide.
Aperçu
Cette étude présente le kit I•Cryo pour la cryoconservation efficace du sperme de souris, démontrant une amélioration du développement embryonnaire chez plusieurs souches de souris. Ce kit facilite l'archivage de lignées de souris génétiquement modifiées par cryoconservation du sperme et récupération ultérieure par FIV.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie de la reproduction
- Techniques de cryoconservation
- Fécondation in vitro (FIV)
Contexte
- La cryoconservation des spermatozoïdes de souris est essentielle pour la recherche génétique.
- Les méthodes existantes peuvent manquer d'efficacité et de facilité d'utilisation.
- Le kit I•Cryo vise à simplifier le processus de cryoconservation.
- La récupération réussie des spermatozoïdes est essentielle pour les résultats de fécondation in vitro.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'efficacité du kit I•Cryo pour la congélation de sperme de souris.
- Évaluer l'impact du sperme congelé sur le développement embryonnaire.
- Constituer une archive de lignées de souris génétiquement modifiées pour des recherches futures.
Méthodes utilisées
- Prélèvement de spermatozoïdes à partir de l'épididyme de souris à l'aide de pailles de cryoconservation.
- Congélation des spermatozoïdes dans l'azote liquide pour une conservation à long terme.
- Décongélation des spermatozoïdes en vue de leur utilisation dans des procédures de FIV.
- Évaluation de la mobilité des spermatozoïdes et des taux de réussite de la FIV selon différentes souches.
Résultats principaux
- Développement amélioré des embryons observé chez 5 souches de souris à l'aide du kit I•Cryo.
- 49 lignées de souris génétiquement modifiées correctement archivées et récupérées.
- Les taux de mobilité des spermatozoïdes variaient de 81 % à 47 % selon les souches.
- Les taux de FIV variaient de 26 % à 88 % avec du sperme congelé-décongelé.
Conclusions
- Le kit I•Cryo améliore considérablement l'efficacité de la cryoconservation des spermatozoïdes.
- La récupération réussie de lignées génétiquement modifiées confirme son utilité en recherche.
- Une optimisation supplémentaire de la méthode pourrait réduire le temps de traitement.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La cryoconservation des spermatozoïdes de souris offre une solution rentable et évolutive pour l'archivage de souches génétiquement modifiées, réduisant ainsi la dépendance aux colonies d'animaux vivants et atténuant les risques de perte de lignée. Le kit I•Cryo améliore la confiance prédictive dans la préservation des souches en augmentant la mobilité des spermatozoïdes après décongélation et le développement embryonnaire issu de la FIV chez plusieurs lignées consanguines. Cela permet une gestion stratégique du portefeuille en recherche préclinique, en rendant possible le stockage fiable à long terme et la récupération à la demande de modèles précieux de maladies.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet la validation fonctionnelle de modèles génétiques en assurant la récupérabilité du sperme pour le criblage phénotypique basé sur la FIV.
- Valeur opérationnelle : Réduit la charge liée à l'élevage animal et les coûts associés au maintien de colonies vivantes de modèles à faible rendement ou inductibles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une source standardisée de spermatozoïdes pour des tests de FIV cohérents, permettant une évaluation reproductible des effets des composés sur la fécondation et le développement embryonnaire précoce.
- Valeur opérationnelle : Facilite la disponibilité des tests grâce à la cryoconservation des spermatozoïdes, éliminant les variations dues aux différences entre mâles ou entre lots lors de la collecte d'échantillons frais.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve l'intégrité génétique des modèles de maladie au fil du temps, permettant des études longitudinales et une continuité expérimentale intergénérationnelle.
- Valeur opérationnelle : Facilite la collaboration entre plusieurs sites en permettant la distribution de sperme cryopréservé au lieu d'animaux vivants, réduisant ainsi la complexité du transport et les préoccupations liées à la biosécurité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre au flux de travail de découverte, depuis la génération précoce du modèle jusqu'à la validation préclinique, en servant de pont entre l'ingénierie génétique et le phénotypage fonctionnel par FIV.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en permettant la récupération de sperme cryoconservé pour la FIV, ce qui permet d'évaluer l'impact des modifications génétiques sur la fertilité et l'embryogenèse précoce.
- Écrantage : Permet des tests normalisés basés sur la FIV à l’aide de sperme décongelé, améliorant ainsi la reproductibilité dans l’évaluation de la fonction spermatique, de la capacitation et de la capacité fécondante.
- Analytique : Génère des mesures quantitatives telles que la mobilité spermatique (% de progression), la mobilité progressive rapide et les taux de développement embryonnaire, qui orientent les décisions de poursuite ou d'abandon concernant la stabilité du modèle.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre modification génétique et résultats développementaux en permettant la FIV avec du sperme cryoconservé, soutenant ainsi un écrantage phénotypique associé à des biomarqueurs chez les embryons préimplantatoires.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme de cryoconservation réutilisable pour l'archivage continu et la récupération de lignées génétiquement modifiées, réduisant ainsi les efforts redondants de redérivation entre projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la préservation du modèle en démontrant une motilité et un développement embryonnaire améliorés par rapport aux méthodes de base utilisant des agents de congélation.
- Valeur opérationnelle : Standardise le protocole de cryoconservation grâce à des composants fournis sous forme de kit, réduisant ainsi la variabilité entre utilisateurs et la durée de formation.
- Valeur stratégique : Réduit les coûts à long terme du maintien des souches et diminue le risque de perte irréversible de lignée due à un échec de reproduction, à une dérive génétique ou à une éclosion de pathogènes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une hiérarchisation des lignées génétiquement modifiées à archiver selon leur valeur stratégique, avec une confiance garantie en leur récupérabilité future.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une compétence technique en matière de collecte de sperme, de manipulation des pailles et de scellage thermique afin de garantir l'intégrité de l'échantillon.
- Dépend de l'accès à un stockage en azote liquide et à un équipement de décongélation contrôlée (bain-marie à 37 °C) pour assurer une performance constante après décongélation.
- Exige l'utilisation de milieux de FIV standardisés et de protocoles de superovulation pour obtenir des résultats fiables en matière de fécondation et de culture embryonnaire.
- La performance peut varier selon les fonds génétiques, nécessitant une optimisation spécifique à chaque souche des étapes d'incubation et de lavage.
- Limitée par la nécessité de disposer de femelles fertiles et d'une expertise en FIV pour la récupération des spermatozoïdes, ce qui restreint son application directe aux tests basés sur l'accouplement naturel.
