Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

L’objectif global de cette procédure est de cryoconserver le sperme de souris. Ceci est accompli en collectant d’abord des spermatozoïdes d’EPI de souris à l’aide de paillettes de cryoconservation. Les pailles sont ensuite congelées dans de l’azote liquide où elles sont stockées jusqu’à ce qu’elles soient récupérées en les décongelant dans de l’eau tiède.

Les spermatozoïdes de souris récupérés sont finalement utilisés pour la fécondation in vitro. Le principal avantage de ce kit par rapport aux méthodes existantes est qu’il contient tout le matériel nécessaire à la cryoconservation et à la récupération du sperme de souris. Commencez par assembler 15 paillettes de cryoconservation de spermatozoïdes par ligne de souris à cryoconserver.

Tout d’abord, connectez chaque paille de 0,25 millilitre à une seringue d’un millilitre avec le bouchon de coton le plus proche de la seringue. Ensuite, chargez huit centimètres de médium de FIV dans chaque paille, suivis d’un centimètre d’air. Troisièmement, étiquetez chacune des 15 paillettes avec le nom de la ligne à conserver pour chaque ligne à cryoconserver.

Remplissez un puits d’une boîte à quatre puits avec 240 microlitres d’agent cryoprotecteur. Fixez une pipette d’un millilitre à la poignée de la cartouche de congélation pour étendre la poignée. Enfin, remplissez la boîte isotherme en mousse fournie avec le kit avec 15 centimètres d’azote liquide et fermez le couvercle de l’euthanasie.

Deux souris mâles adultes fertiles. Pour chaque ligne à cryoconserver et chirurgicalement, retirez leurs EPI codaux. Placez la souris dans la recu dorsale et ouvrez la paroi ventrale du corps.

Tirez doucement sur la vaste déférence et retirez tout excès de graisse. Ensuite, localisez l’épididyme et retirez-le intact avec un petit morceau de déférence rapide. Placez les EPI dans un puits du plat à quatre puits préparé chargé de CPA sous une lunette de dissection.

Faites cinq à sept incisions longitudinales dans chaque épididyme. Ensuite, à l’aide d’une pince, pressez doucement chaque différence rapide. Pour expulser les spermatozoïdes, incubez le mélange de CPA et d’épididyme à température ambiante pendant trois à cinq minutes.

Agitez doucement le plat à la main deux à trois fois pendant l’incubation. Cela permettra aux spermatozoïdes de nager par aspiration. Chargez chaque paille préparée avec cinq millimètres de suspension de sperme, suivis d’un centimètre d’air.

Il est important pour le processus de congélation que toutes les pailles soient chargées de manière égale. Après avoir chargé les 15 pailles, thermocollez soigneusement les deux extrémités de chaque paille. Pour assurer la survie des spermatozoïdes, terminez le processus pour les 15 paillettes en 10 minutes.

Une fois que toutes les paillettes sont préparées, chargez-les dans la colonne de sperme de la cartouche de congélation. Tout d’abord, placez la cartouche dans la boîte en mousse et laissez-la flotter verticalement dans l’azote liquide. Pendant 10 minutes, la cartouche doit flotter verticalement, sinon le taux de congélation des spermatozoïdes sera affecté.

Plongez ensuite la cartouche dans l’azote liquide. Le sperme est ainsi cryoconservé et est prêt pour le stockage à long terme de l’azote liquide. Environ 60 heures avant une récupération planifiée de spermatozoïdes.

Suivez le protocole écrit pour super ovuler les femmes avant la FIV. Pour chaque paille à décongeler, préparez et équilibrez tous les milieux pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ces matériaux comprennent une boîte de Pétri de 35 millimètres avec une goutte de 90 microlitres de milieu de traitement du sperme recouverte d’huile.

Une boîte de Pétri de 35 millimètres avec trois millilitres de milieu de FIV pour servir de plat de coupe et pour cinq femmes super ovulées préparer un plat de FIV, qui est un puits d’un plat de quatre puits chargé de 500 microlitres de milieu de FIV. Pour chaque plat de FIV, préparez un plat de lavage, qui est une boîte de Pétri de 35 millimètres avec trois millilitres de KSOM et une boîte de culture d’embryons, qui est une boîte de Pétri de 35 millimètres avec 50 gouttes de microlitres de milieu KSOM recouverte d’huile. Une fois tous les matériaux nécessaires préparés, retirez rapidement une paille de l’entreposage et placez-la dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes.

Séchez la paille. Faites ensuite une coupe en biais dans la colonne d’air sous le bouchon de coton. À l’autre extrémité de la paille, faites une autre coupe inclinée au-dessus d’une autre colonne d’air.

Évitez de couper la colonne de spermatozoïdes. Aspirez maintenant la suspension de sperme de l’extrémité de la paille à l’aide d’une pipette de 200 microlitres et déposez-la au centre du milieu de traitement du sperme. Goutte. Incuber ensuite le plat pendant 45 à 60 minutes.

Pendant l’incubation des spermatozoïdes, isolez le ucs des femelles super ovulées et transférez-les dans la coupelle de découpe. À l’aide d’une aiguille de calibre 30 ou d’une pince, on peut déchirer chaque oviducte, libérant ainsi les complexes cytaires du cumulus. Transférez les C C de cinq femelles dans chaque FIV.

Eh bien, avec un minimum de médias. Évitez de transférer de la graisse et du sang car les milieux sales inhibent l’efficacité de la fertilisation. Après l’incubation, prélevez 10 à 15 microlitres de suspension de spermatozoïdes à la périphérie de la goutte STM et déposez la suspension dans une FIV.

Eh bien, maintenant, co-cultivez les cellules pendant quatre à six heures pour la fécondation. Après la fécondation, faites passer les embryons dans au moins 2K SOM lavages dans la vaisselle. Puis la culture.

Les embryons dans KSOM jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint. Le sperme de cinq souches de souris consanguines de la rivière Charles a été congelé. Les rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes et de la motilité progressive rapide variaient de 81 % à 47 % sur cinq souches de ces spermatozoïdes.

Les taux de FIV avec du sperme congelé et décongelé ont varié selon les souches de 26 à 88 % sur un an et demi. Au total, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par cryoconservation de spermatozoïdes et récupérées plus tard par FIV dans quatre souches féminines différentes. C 57 black six BC DBA one et 1 29 SV Une fois maîtrisée, la technique de cryoconservation des spermatozoïdes peut être réalisée en 30 minutes si elle est correctement réalisée.

Pour cette procédure, il est important de s’écouler verticalement vers le bidon et l’azote liquide.