Name: Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Apprenez la cryoconservation du sperme de souris avec le kit I•Cryo pour la biologie de la reproduction. Cette méthode améliore le développement embryonnaire et permet l'archivage de lignées génétiquement modifiées.

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La recherche présentée ici a été soutenue par Charles River. Les auteurs sont très reconnaissants à l&#39;Modèles génétiquement modifiés et le groupe Services et le personnel de l&#39;embryologie pour les soins des animaux et l&#39;injection d&#39;hormones.

1. Cryoconservation du sperme de souris <ol><li> Pour chaque ligne d&#39;être cryoconservés, préparer la suivante avant de commencer. <ol><li> 1 puits d&#39;un plat 4-bien avec 240 l de kit CPA </li><li> 15 pailles cryoconservation du sperme comme suit <ol><li> Connectez l&#39;0,25 ml pailles à l&#39;seringues de 1 ml avec le tampon de coton plus proche de la seringue. Dans chaque paille, charge de 8 cm (environ 160 pi) de moyennes FIV, puis 1 cm d&#39;air. Étiquette les pailles avec le nom de la ligne doit être préservée. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 devrait être de 15 cm de profondeur dans la boîte de mousse. Fermez le couvercle. </li><li> 2 euthanasier les souris mâles de chaque ligne pour être cryoconservés. Souris devrait se situer entre 10 et 60 semaines. Retirez les deux épididymes caudales avec le canal déférent de chaque souris. </li><li> Placez les épididymes dans le CPA préalablement préparé contenant bien d&#39;un plat 4-même (étape 1.1). </li><li> Faire 5-7 coupes longitudinales dans chaque épididyme et doucementpresser chaque canal déférent pour pousser le sperme sortir. </li><li> Agiter le mélange de l&#39;ACP et de l&#39;épididyme à la main en douceur à la température ambiante pendant 3-5 minutes. Cela permettra aux spermatozoïdes de nager sur. </li><li> Utilisation de la paille préalablement préparé, aspirer 5 mm (environ 10 pi) de la suspension de spermatozoïdes et ensuite 1 cm d&#39;air. </li><li> Répétez ce processus jusqu&#39;à un total de 15 pailles. Charger et sceller des pailles dans les 10 minutes pour la survie des spermatozoïdes mieux. </li><li> Thermoscellez deux côtés de la paille soigneusement. Placer les pailles dans le bidon de congélation du sperme avec la colonne première. </li><li> Fixer la pipette 1 ml fournie dans le cadre de la trousse à la boîte de prolonger la poignée. Placez la cartouche dans la LN 2 dans la boîte de mousse à travers le trou dans le couvercle. Laisser le réservoir de flotter à la verticale dans la LN 2 pendant 10 minutes. </li><li> Immergez la cartouche dans le LN2. Le sperme est maintenant cryoconservés et peut être déplacé à long terme LN 2 de stockage. </li><li> La cartouche ne doit pas être utilisé pourla ligne suivante jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit réchauffé à la température ambiante. </li></ol> 2. Superovulation souris <ol><li> Généralement, l&#39;utilisation de jeunes souris femelles de la même origine que les donneurs de sperme. </li><li> Souris devrait être ~ 12 g (3-4 semaines d&#39;âge). </li><li> Effectuer une injection intrapéritonéale avec UI 5-10 de gonadotrophine de sérum de jument enceinte (PMSG). </li><li> Attendre 46 à 48 heures. </li><li> Effectuer une injection intrapéritonéale avec UI 5-10 de la gonadotrophine chorionique humaine (hCG). </li><li> Récolte ovocytes 14-16 h après l&#39;injection d&#39;hCG comme décrit ci-dessous. </li></ol> 3. La récupération des spermatozoïdes de souris et FIV <ol><li> Avant la FIV, pour chaque paillette d&#39;être décongelé, préparer la suivante et s&#39;équilibrer pendant au moins une heure dans un 37 ° C incubateur à CO 2. <ol><li> Plat d&#39;incubation de sperme: une boîte de Petri de 35 mm, avec une chute de 90 ul de milieu de traitement du sperme (STM) recouvert d&#39;huile. </li><li> Découpe plat: Pour la collecte des ovocytes à partir d&#39;un maximum de 10 sfemelles uperovulated, une boîte de Petri de 35 mm avec 3 ml de milieu de FIV. </li><li> FIV ainsi: Pour chaque groupe de 5 femelles superovulées pour la FIV, un puits d&#39;un plat bien avec 4 500 pi de milieu de FIV (si vous utilisez 10 femelles superovulées, par exemple, vous aurez besoin de 2 puits...) </li><li> Laver la vaisselle: une boîte de Petri de 35 mm avec 3 ml de simplex de potassium moyenne optimisée (KSOM) pour le lavage dans chaque puits de l&#39;antenne 4-FIV ainsi utilisée </li><li> Boîte de culture: une boîte de Petri de 35 mm avec 50 gouttes ul de milieu KSOM recouvert d&#39;huile pour la culture d&#39;embryons de chaque puits de la parabole de FIV. </li></ol></li><li> Suppression d&#39;une paille de LN 2 et placer dans un bain à 37 ° C l&#39;eau pendant 2-3 minutes. </li><li> Retirez la paille du bain d&#39;eau et essuyez pour enlever l&#39;excès d&#39;eau. Faire la première coupe à proximité de la colonne de First Air le plus proche du bouchon de coton. Couper la paille au milieu de FIV il y aura encore une colonne d&#39;air visibles avant que la colonne de sperme. </li><li> Ensuite, couper l&#39;extrémité de la paille dans le seuxièmement l&#39;air colonne, en prenant soin d&#39;éviter de couper la colonne de sperme. Couper à un angle de 45 - ce qui rendra beaucoup plus facile à aspirer le sperme. </li><li> Aspirer la suspension de spermatozoïdes à partir de l&#39;extrémité distale de la paille avec une pipette 200 pi. </li><li> Placer la suspension de spermatozoïdes dans le centre de la goutte de la STM et incuber le plat pendant 45-60 minutes dans un 37 ° C CO 2 5% incubateur. </li><li> Durant l&#39;incubation des spermatozoïdes, disséquer les oviductes des femelles superovulation dans le plat de coupe. Utiliser une aiguille de 30 g ou une pince pour arracher chaque oviducte, libérant les complexes cumulus-ovocytes (COC). Évitez les gras et du sang dans les moyennes FIV comme sale des médias fait pour les étapes de lavage supplémentaires. </li><li> Une fois que tous les oviductes ont été arrachés, le transfert du COC à partir de 5 femelles à chaque puits de FIV. Le nombre de COC produite par superovulation est très dépendante de contrainte. </li><li> Recueillir 10-15 ul de sperme de la périphérie de la goutte STM et fertiliser un FIV ainsi d&#39;environ 14-16 heures après l&#39;hCG injection. Répétez la fertilisation pour chaque puits utilisé. Concentration du sperme final sera d&#39;environ 1 million / ml. </li><li> Spermatozoïdes et des ovocytes coculture pendant 4-6 heures dans un 37 ° C 5% CO 2 incubateur. </li><li> Laver les embryons avec KSOM un minimum de 2 fois et la culture en gouttes KSOM pour le développement dans un 37 ° C 5% CO 2 incubateur. </li><li> Taux de fécondation in vitro a été calculé que deux embryons au stade de cellules à des ovocytes totale utilisée, après une nuit de culture. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le sperme de 5 souches de souris Charles River, consanguins a été gelé. Les rapports de protection sont calculés en divisant les valeurs d&#39;évaluation congelés sperme frais valeurs d&#39;évaluation du sperme. Rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes ont été de 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% pour C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement. Rapports de protection pour la motilité progressive rapide ont été de 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> LCR, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement (figure 1). Le taux de fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé ont été de 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% et 26,2% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement (figure 2) . Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme. Ces lignes ont ensuite été récupéré avec succès (tel que défini par les chiots nés vivants) par FIV en quatre souches femelles (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 et 129Sv) (Fig. 3). <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Figure 1. Les rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes et la motilité progressive rapide chez la souris <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Figure 2. Fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé chez la souris 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé dans des souris transgéniques

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
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<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
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<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs sont des employés de Charles River, le fabricant de ce kit.

Depuis 1990, le protocole de sperme base de gel en utilisant le raffinose 18% et 3% de lait écrémé a été prouvé fiable dans de nombreuses souches de souris et un grand nombre de lignées de souris ont été cryoconservés 1,2,3,4,5,6,7. Les principales causes de dommages aux cellules du sperme pendant le processus de congélation et de décongélation ont été associés à la formation de glace et de 8,9 espèces réactives de l&#39;oxygène 10. La supplémentation avec piégeurs de radicaux libres, tels que des acides aminés, et les agents réducteurs, tels que monothioglycérol, dans le milieu de congélation a été étudiée et prouvée d&#39;augmenter substantiellement le taux de FIV avec du sperme congelé-décongelé dans des souches consanguines y compris les C57BL / 6 11,6. Dans le présent protocole, nous avons développé un nouveau I • Cryo kit pour la cryoconservation du sperme de souris en optimisant le CPA avec base disponibles dans le commerce des antioxydants et les inhibiteurs de la glace et en modifiant le point de congélation du sperme et la procédure de FIV. Rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes(&gt; 60%) et la motilité progressive rapide (&gt; 45%) ont été observés pour les spermatozoïdes à partir de cinq souches de souris consanguines congelés avec le kit I • Cryo. Le taux de 2-cellules stade embryonnaire de développement avec du sperme congelé-décongelé en 5 souches de souris consanguines a été nettement améliorée par rapport à celui avec base CPA 11,6. En utilisant la trousse, l&#39;utilisateur crée une suspension de spermatozoïdes du sperme concentré par congélation de 2 hommes pour chaque ligne. En seulement 15 pailles de congélation le processus est rapide, facile et occupe moins d&#39;espace de stockage pour l&#39;entreposage à court ou à long terme. La plupart du temps, des lignées de souris peuvent être récupérées par le dégel seulement 1 ou 2 pailles.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fourni avec le kit</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fourni avec le kit</td></tr><tr><td>Milieu IVF</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fourni avec le kit</td></tr><tr><td>Paille en plastique de 0,25 ml</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fourni avec le kit</td></tr><tr><td>Récipient de congélation pour spermatozoïdes</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fourni avec le kit</td></tr><tr><td>Canne et godet</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fourni avec le kit</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Doit être testée pour les embryons</td></tr><tr><td>Milieu KSOM</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Scelleur thermique</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>Plaque multidépôt à 4 puits</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipetteur</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à 37&amp;#x00B0;C + 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de stockage en LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie à 37&amp;#x00B0;C</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 cc avec aiguille 26G 3/8</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux microchirurgicaux</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 30 &amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les i · cryo kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Des milliers de nouveaux génétiquement modifiés (OGM) des souches de souris ont été créés depuis l&#39;avènement des technologies de transgénèse et KO. Beaucoup de ces précieux animaux n&#39;existent que comme des animaux vivants, sans plan de sauvegarde en cas d&#39;urgence. Cryoconservation des embryons peuvent fournir ce secours, mais elle est coûteuse, peut être une procédure longue, et nécessite généralement un grand nombre d&#39;animaux pour le succès. Depuis la découverte que le sperme de souris peuvent être cryoconservés avec succès avec un agent de base cryoprotecteurs (CPA), composé de raffinose 18% et 3% de lait écrémé, la cryoconservation du sperme est devenu une procédure acceptable et rentable pour l&#39;archivage, la distribution et la récupération de ces souches précieuses . Ici nous démontrons une nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Le sperme de cinq souches couramment utilisé des souris consanguines ont été gelés en utilisant ce kit et ensuite récupéré. Rapports de protection plus élevé de la motilité des spermatozoïdes (&gt;60%) et la motilité progressive rapide (&gt; 45%) par rapport au contrôle (de base CPA) ont été vus pour sperme congelé avec ce kit de 5 souches de souris consanguines. Deux cellules d&#39;embryons de stade de développement après FIV avec le sperme retrouvé a été améliorée de manière cohérente dans l&#39;ensemble des 5 souches de souris examinées. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et récupéré plus tard par FIV.

Ici nous démontrons l&#39;nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Deux cellules du développement embryonnaire scène avec des spermatozoïdes congelés-décongelés a été améliorée de manière cohérente dans cinq souches de souris à l&#39;utilisation de ce kit. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et plus tard avec succès récupéré par FIV.

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

Des milliers de nouvelles souches de souris génétiquement modifiées (GM) ont été créées depuis l'avènement de la transgénèse et des technologies de knockout. Beaucoup de ces...

L'objectif général de cette procédure est de cryoconserver du sperme de souris. Cela est réalisé en prélevant d'abord du sperme à partir de spermatozoïdes de souris à l'aide de pailles destinées à la cryoconservation. Les pailles sont ensuite congelées dans de l'azote liquide, où elles sont stockées jusqu'à leur récupération par décongélation dans de l'eau tiède.Les spermatozoïdes de souris récupérés sont finalement utilisés pour la fécondation in vitro. Le principal avantage de ce kit par rapport aux méthodes existantes est qu'il contient tous les matériaux nécessaires à la cryoconservation et à la récupération des spermatozoïdes de souris. Généralement, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés à manipuler et charger les pailles. Commencez par assembler 15 pailles de cryoconservation du sperme par lignée de souris à cryoconserver.Tout d'abord, reliez chaque paille de 0,25 millilitre à une seringue d'un millilitre, le bouchon en coton étant placé le plus près possible de la seringue. Ensuite, chargez huit centimètres de milieu de FIV dans chaque paille, suivis d'un centimètre d'air. Enfin, étiquetez chacune des 15 pailles avec le nom de la lignée à préserver pour chaque lignée devant être cryoconservée.Remplir une cavité d'une plaque à quatre puits avec 240 microlitres d'agent cryoprotecteur. Fixer une pipette d'un millilitre au manche du récipient de congélation afin d'allonger ce dernier. Enfin, remplir la boîte isolée en mousse fournie avec le kit avec 15 centimètres de diazote liquide et fermer le couvercle euthanasier.Deux souris mâles adultes fertiles. Pour chaque lignée à cryoconserver, retirer chirurgicalement les épididymes caudales. Placer la souris en décubitus dorsal et ouvrir la paroi abdominale ventrale.Tirer doucement sur le cordon déférent et retirer tout excès de graisse. Ensuite, localiser l'épididyme et le retirer intact avec un petit morceau de cordon déférent. Placer les EPI dans une cavité d'une plaque quadruple préparée contenant du CPA, sous un microscope stéréoscopique.Effectuez cinq à sept incisions longitudinales dans chaque épididyme. Ensuite, à l’aide de pinces, pressez délicatement chaque incision. Pour expulser les spermatozoïdes, incubez le mélange d’APA et d’épididyme à température ambiante pendant trois à cinq minutes.Agiter doucement la boîte à la main deux à trois fois pendant l'incubation. Cela permettra aux spermatozoïdes de sortir par aspiration. Charger chaque paille préparée avec cinq millimètres de la suspension de spermatozoïdes, suivis d'un centimètre d'air.Il est important pour le processus de congélation que toutes les pailles soient chargées de manière identique. Après avoir chargé les 15 pailles, scellez soigneusement chaque extrémité des pailles par thermosoudure. Afin de garantir la survie des spermatozoïdes, effectuez l'ensemble du processus pour les 15 pailles dans un délai de 10 minutes.Une fois toutes les pailles préparées, chargez-les dans la colonne à sperme du canister de congélation. Placez d'abord le canister dans la boîte en mousse et laissez-le flotter verticalement dans l'azote liquide. Le canister doit flotter verticalement pendant 10 minutes, faute de quoi la vitesse de congélation du sperme serait affectée.Plongez ensuite la capsule dans l'azote liquide. Ainsi, le sperme est cryopréservé et prêt pour un stockage à long terme dans l'azote liquide. Environ 60 heures avant une récupération planifiée du sperme.Suivez le protocole écrit pour superovuler les femelles avant la FIV. Pour chaque paille à décongeler, préparez et équilibrez tous les milieux pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ces matériaux comprennent une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant une goutte de 90 microlitres de milieu de traitement des spermatozoïdes recouverte d'huile.Une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant trois millilitres de milieu IVF servant de boîte de sectionnement, et pour chaque groupe de cinq femelles superovulées, préparer une boîte IVF, soit une cavité d'une boîte à quatre cavités remplie de 500 microlitres de milieu IVF. Pour chaque boîte IVF, préparer une boîte de lavage, constituée d'une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant trois millilitres de KSOM, et une boîte de culture embryonnaire, constituée d'une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant des gouttes de 50 microlitres de milieu KSOM recouvertes d'huile. Une fois tous les matériaux nécessaires préparés, retirer rapidement une paille du stockage et la placer dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes.Séchez la paille. Ensuite, effectuez une coupe en biais dans la colonne d'air située sous le bouchon de coton. À l'autre extrémité de la paille, réalisez une autre coupe en biais au-dessus d'une autre colonne d'air.Évitez de couper la colonne de spermatozoïdes. Aspirez maintenant la suspension de spermatozoïdes à l'extrémité de la paille à l'aide d'une pipette de 200 microlitres et déposez-la au centre du milieu de traitement des spermatozoïdes. Ensuite, incubez la boîte pendant 45 à 60 minutes.Pendant l'incubation des spermatozoïdes, isoler les CU des femelles superovulées et les transférer dans la boîte de dissection. Utiliser une aiguille de calibre 30 ou une pince pour déchirer chaque oviducte et libérer les complexes cumulus-oocyte. Transférer les CC provenant de cinq femelles dans chaque fécondation in vitro.Eh bien, avec une quantité minimale de milieu. Évitez de transférer du tissu adipeux et du sang, car un milieu contaminé inhibe l'efficacité de la fécondation. Après l'incubation, prélève 10 à 15 microlitres de la suspension de spermatozoïdes à la périphérie de la goutte de STM et dépose la suspension dans un IVF.Co-cultivez maintenant les cellules pendant quatre à six heures pour la fécondation. Après la fécondation, faites passer les embryons par au moins deux lavages avec du SOM 2K dans la boîte de lavage. Ensuite, réalisez la culture.Les embryons sont maintenus dans le KSOM jusqu'à l'obtention du stade de développement souhaité. Des spermatozoïdes provenant de cinq souches consanguines de souris Charles River ont été congelés. Les taux de protection de la mobilité et de la mobilité progressive rapide des spermatozoïdes variaient de 81 % à 47 % selon les cinq souches.Les taux de FIV avec du sperme congelé-dégelé ont varié selon les souches, de 26 à 88 % sur une période d'un an et demi. Un total de 49 lignées de souris génétiquement modifiées a été préservé par cryoconservation du sperme et ultérieurement récupéré par FIV à l’aide de quatre souches femelles différentes. C 57 black six BC DBA one et 1 29 SV Une fois la technique de cryoconservation du sperme maîtrisée, elle peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement.Pour cette procédure, il est important d'acheminer le flux vers le réservoir de manière verticale et dans de l'azote liquide.

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Dans cette vidéo, article, nous présentons une démonstration étape par étape sur la façon de recueillir et de cryopréservation des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.

Collecte et cryoconservation des ovocytes de hamster et d&#39;embryons de souris

Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

Une base d'éthylène glycol méthode de vitrification des embryons de souris est décrite. Il est avantageux à d'autres méthodes dans sa simplicité et une faible toxicité embryonnaire, et ne peut donc être largement applicable à de nombreuses souches de souris, y compris les souris consanguines et génétiquement modifiées.

Cryoconservation d&#39;embryons de souris par base d&#39;éthylène glycol vitrification

L'approche comparative permet espèces neuroscientifiques comportementaux d'explorer différents facteurs neurobiologiques associés à des comportements spécifiques considérés comme caractéristiques d'un modèle animal spécifique. Profitant de naturellement des différences de comportement entre espèces étroitement apparentées, cette technique ne nécessite pas de techniques invasives pour manipuler l'expression du comportement.

En utilisant une approche comparative des espèces pour Enquêter sur la neurobiologie des réponses paternel

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’une méthode de cryovitrification ultra-rapide pour la conservation d’échantillons biologiques. Le procédé implique l’utilisation d’une combinaison de cryoprotecteurs pour protéger les tissus biologiques des dommages causés par le gel en empêchant la formation de cristaux de glace intracellulaires.

La cryoconservation par vitrification : une technique de refroidissement ultra-rapide pour conserver les spécimens biologiques à très basse température en vue d’un stockage à long terme

MicroSecure Vitrification a été développé en tant que système de dispositif de vitrification fermé aseptique non commercial, conforme aux bonnes pratiques de fabrication et de manipulation des tissus de la FDA. En raison du retrait des pailles d’embryons bouchés hydrophobes de l’industrie, la procédure de vitrification a été modifiée pour inclure un joint intérieur avant le bouchon intérieur en coton standard.

Modifié MicroSecure Vitrification: Une très procédure Cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains

L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. En outre, la répétabilité de la méthode dans cinq souches différentes de poisson-zèbre a été testée.

Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide

Protocoles pour la cryoconservation de maturation et de sperme anguille d’Europe ont été améliorés ces dernières années. Cet article décrit le meilleur protocole disponible à l’aide de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) pour induire la maturation et le méthanol comme cryoprotectant.

Manutention et traitement des anguilles mâles sur l’Europe (Anguilla anguilla) pour Maturation hormonale et cryoconservation de sperme

Ici, nous présentons une méthode modifiée pour la cryoconservation des embryons à une cellule ainsi qu’un protocole qui couple l’utilisation d’embryons dégelés et l’électroporation pour la génération efficace de souris génétiquement modifiées.

Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées

Ce protocole décrit une voie semi-automatisée pour améliorer l’efficacité et la capacité de traitement et de cryoconservation du sperme d’espèces coralliennes menacées, dans le but de garantir la diversité génétique et de soutenir les efforts de restauration des récifs.

Un flux de travail semi-automatisé pour la cryoconservation des spermatozoïdes de corail pour soutenir les biobanques et l’aquaculture

Apprenez la cryoconservation du sperme de souris avec le kit I•Cryo pour la biologie de la reproduction. Cette méthode améliore le développement embryonnaire et permet l'archivage de lignées génétiquement modifiées.

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

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