Name: Modifié MicroSecure Vitrification: Une très procédure Cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Découvrez la méthode MicroSecure Vitrification pour la cryoconservation sécurisée des blastocystes humains. Cette technique simple et reproductible améliore les taux de naissances vivantes en éliminant les variations techniques entre laboratoires.

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MC Schiewe aimerait remercier M. Forest Garner au Centre de fertilité de Las Vegas pour son expertise statistique dans l&#39;analyse et l&#39;évaluation des données annuelles CDC et SART. En outre, les auteurs tiennent à remercier leur directeur médical, le Dr Robert E. Anderson, pour son soutien dévoué et la foi en nos capacités techniques et de l&#39;expertise.

<ol><li>Edgar, D. H., Gook, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+cryopreservation+%28slow+cooling+versus+vitrification%29+of+human+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos.</a> Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).</li>
<li>Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+risk+of+monochorionic+dizygotic+twin+blastocyst+formation+associated+with+early+laser+zona+dissection+of+group+cultured+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos.</a> Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).</li>
<li>Schiewe, M. C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/301673333_The_Historic_Development_and_Incorporation_of_Four_Assisted_Reproductive_Technologies_Shaping_Today's_IVF_Industry">The historic development and incorporation of four assisted reproductive technologies shaping today's IVF industry.</a> J. Fertil. In Vitro Reprod. Med. Genet. 4, 2-9 (2016).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196+degrees+C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Rall, W. F., Wood, M. J., Kirby, C., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mouse+embryos+cryopreserved+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Development of mouse embryos cryopreserved by vitrification.</a> J. Reprod. Fertil. 80, 499-504 (1987).</li>
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<li>Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+and+human+blastocysts+using+a+novel+cryoloop+container-less+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique.</a> Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).</li>
<li>Mukaida, T., Oka, C., Goto, T., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+shrinkage+of+blastocoeles+using+either+a+micro-needle+or+a+laser+pulse+prior+to+the+cooling+steps+of+vitrification+improves+survival+rate+and+pregnancy+outcome+of+vitrified+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 21, 3246-3252 (2006).</li>
<li>Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+open+and+closed+methods+for+vitrification+of+human+embryos+and+elimination+of+potential+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination.</a> Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).</li>
<li>Vanderzwalmen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Births+after+vitrification+at+morula+and+blastocyst+stages%3A+effect+of+artificial+reduction+of+the+blastocoelic+cavity+before+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification.</a> Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).</li>
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<li>Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+safe%2C+simple%2C+and+successful+vitrification+method+for+bovine+and+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts.</a> Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).</li>
<li>Panagiotidis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+versus+closed+vitrification+of+blastocysts+from+an+oocyte-donation+programme%3A+a+prospective+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study.</a> Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).</li>
<li>Papatheodorou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+versus+closed+oocyte+vitrification+system%3A+a+prospective+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized study.</a> Reprod. Biomed. Online. 26, 595-602 (2013).</li>
<li>Schiewe, M. C., Zozula, S., Anderson, R. E., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Validation+of+microSecure+vitrification+(%26%23181%3BS-VTF)+for+the+effective+cryopreservation+of+human+embryos+and+oocytes">Validation of microSecure vitrification (µS-VTF) for the effective cryopreservation of human embryos and oocytes.</a> Cryobiology. 71, 264-272 (2015).</li>
<li>Schiewe, M. C. MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products. J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).</li>
<li>Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+survival+of+mouse+embryos+cryopreserved+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification.</a> Cryobiology. 24, 387-402 (1987).</li>
<li>Seki, S., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+warming+rate+on+the+survival+of+vitrified+mouse+oocytes+and+on+the+recrystallization+of+intracellular+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice.</a> Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).</li>
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<li>Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+warming+increases+survival+of+slow-frozen+sibling+oocytes%3A+a+step+towards+a+single+warming+procedure+irrespective+of+the+freezing+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol.</a> Reprod Biomed Online. , (2014).</li>
</ol>

MC Schiewe est membre du conseil consultatif scientifique innovantes Cryo entreprises et en tant que directeur technique à la Cryobank Californie. La production de cette vidéo article a été payé par Ovation fertilité. Les auteurs ont aucun accord ou les conflits d&#39;intérêts financiers concurrents de divulguer au sujet de la vitrification des gamètes et des embryons.

Aujourd&#39;hui, il y a une forte attente d&#39;atteindre la survie de blastocyste complète (&gt; 95%) et la réussite d&#39;une implantation similaire à celle d&#39;embryons frais. Certains groupes ont suggéré que les taux de naissances vivantes de cycles de transfert d&#39;embryons vitrifiés sont peut-être encore plus élevé que les blastocystes frais lorsque l&#39;embryon cryoconservé intact est transplanté dans un utérus sain non hormonale stimulée. Nos données indiquent clairement que la vitrification maintient efficacement et de manière fiable la viabilité de l&#39;embryon frais. De plus, nous avons prouvé que notre aseptique, méthode fermée, appelée MicroSecure vitrification (pS-VTF), peut obtenir un résultat optimal comparable ou supérieure aux normes commerciales (c. -à- systèmes de dispositifs ouverts) utilisés dans l&#39;industrie de la FIV. La variation est associée à la répétabilité et la fiabilité techniques entre les individus en utilisant une multitude de vitrification appareils / méthodes. À son tour, cela a abouti à inconsistencies entre les programmes d&#39;application vitrification. Par conséquent, il est peu surprenant que la familiarité de l&#39;appareil est un facteur important en ce qui concerne la compétence des laboratoires et des résultats positifs. Il est cette notion de «signature technique» 11 qui explique pourquoi la répétabilité entre les programmes peut être problématique. Non seulement le développement de plus d&#39;une douzaine de dispositifs commerciaux compliqués ce phénomène, il a créé des préoccupations de contrôle de qualité. Heureusement, les systèmes fermés de vitrification, comme uS-VTF, Rapid-I, et VitriSafe, sont maintenant révèle être tout aussi efficace pour ouvrir les systèmes de l&#39; appareil 12, 13, 14. MicroSecure VTF est une nouvelle technique de vitrification aseptique développé avec aisance technique, la fiabilité et cryo-sécurité à l&#39;esprit. En combinant l&#39;utilisation de deux approuvés antérieurement, les dispositifs conformes FDA, il existe un système de vitrification non commercial wvec l&#39;avantage d&#39;avoir un faible coût établi, contrairement aux dispositifs spécialisés. En outre, son unique et infalsifiable système d&#39;étiquetage à double couleur intériorisé, ainsi que de nombreux autres avantages de contrôle de qualité, ont fait uS-VTF une option globale attrayante 11. En tant que dispositif de VTF non-commercial, cependant, son application de l&#39;industrie répandue évolue lentement. Seule la publication continue de sa sûreté, la sécurité et l&#39;efficacité clinique sera un gain uS-VTF croissante utilisation. En Août 2014, face à l&#39;incapacité d&#39;acquérir les 0,3 ml embryon de paille d&#39;origine fabriqué avec un non-évacuation de bouchon intérieur, hydrophobe, nous avons pu modifier de façon fiable la méthode uS-VTF. En bref, le nouveau sperme 0,3 mL / pailles d&#39;embryons avec leurs bouchons de coton-PVP ont effectivement été adaptés. Ceci a été obtenu simplement en créant un joint interne avant la prise de coton, empêchant ainsi le contact et le liquide de mèche avec leembout ouvert VTF (ie, le flexipette contenant l&#39;embryon ou les œufs). En outre, si les tiges d&#39;identification de 40 mm ne sont pas accessibles, la question de flottabilité associée avec les plus légères tiges de 30 mm peut être contrebalancé en utilisant deux roulements à billes. Ces étapes supplémentaires ont fait la technique un peu moins simple, mais très efficace. Aujourd&#39;hui, l&#39;économie et l&#39;efficacité sont de plus en plus importantes préoccupations, comme blastocystes biopsiées sont généralement vitrifiés individuellement jusqu&#39;à ce que leur statut euploidy est confirmée sur un rapport de la génétique. Blastocystes avec un statut aneuploïdie non viable confirmé obtiennent généralement jetés, avec le consentement du patient, dans quelques semaines. Ainsi, la majorité (&gt; 50%) des dispositifs de VTF sont rejetés après un stockage à court terme, ce qui provoque un coût annuel escalade lors de l&#39;utilisation des dispositifs commerciaux. Dans l&#39;ensemble, uS-VTF est une procédure très efficace, fiable et reproductible pour la cryoconservation des blastocystes humains. Le supérieur Securel de conception de contrôle de qualitéétiquettes y et en toute sécurité stocke les ovocytes / embryons, tout en éliminant l&#39;échec de la récupération et l&#39;optimisation de la survie et la viabilité post-réchauffement, ce qui justifie l&#39;utilisation du système comme une approche universelle de l&#39;embryon vitrification.

La vitrification est la technologie assistée le plus d&#39; impact unique de la reproduction dans l&#39;industrie la fécondation in vitro (FIV) depuis le développement de l&#39; injection intracytoplasmique de spermatozoïdes. Aujourd&#39;hui, les blastocystes sont cryoconservés sans la perte de la viabilité des embryons précédemment associés aux méthodes classiques de congélation lente 1. Avec embryon de survie post-réchauffement fiable, l&#39;industrie de l&#39;infertilité se transforme en l&#39;utilisation préférée de cryoconservés cycles de transfert d&#39;embryons, qui donnent des résultats de grossesse similaires ou plus élevés que le transfert traditionnel d&#39;embryons frais. En association avec blastocyste biopsie et le dépistage génétique préimplantatoire (PGS), la vitrification est devenu un outil clinique essentiel pour optimiser les résultats de naissances vivantes en bonne santé via euploïde transfert d&#39; un seul embryon 2, 3. Murine embryon vitrification a été développé au milieu des années 1980 4, </sup&gt; 5 et adapté à l&#39; agriculture animale en 1990 , 6. Partant du principe que les solutions de vitrification forment un état glasseous métastable, sans endommager la formation de cristaux de glace, il a prouvé à préserver plus efficacement l&#39;intégrité cellulaire complète des embryons. Fait intéressant, l&#39;acceptation prometteuse de vitrification en embryologie humaine n&#39;a pas commencé à être réalisé jusqu&#39;à ce que le 21 ème siècle. Les premières publications visant à promouvoir l&#39;utilisation de vitrification a coïncidé avec le développement de dispositifs uniques «ouverts» du système 7, 8, 9. Cependant, l&#39;adoption de vitrification dans la pratique clinique a été lente, comme il est venu à un moment où l&#39;amélioration de la lente blastocyste congélation ont également été produisent. Le succès de congélation conventionnelle lente taux, en plus de vitrification, ont été alignées avec des améliorations dans les systèmes de culture d&#39;embryons, ainsi qu&#39;avec l&#39;incorporer l&#39;ion d&#39;approches blastocoele-effondrement, qui a amélioré à la fois la survie globale des trophectoderme et, par la suite, l&#39; implantation 10. Dans la dernière décennie, la technologie de vitrification a rapidement supplanté les pratiques de congélation classiques. Dans une large mesure, cela était dû à la mise au point de dispositifs de vitrification spécialisés. Certains de ces appareils ont handicapé la sécurité, l&#39; efficience et l&#39; efficacité de la vitrification clinique en introduisant des défauts de conception inhérents aux dispositifs utilisés dans l&#39;industrie de la FIV 11. En effet, les nuances des différents dispositifs introduisent une variation technique significative entre les programmes, communément appelés «signatures techniques» 12. Ainsi, des revues scientifiques, comme le Journal of Experiments Visualized (JoVE), peuvent servir comme une ressource précieuse pour démontrer les détails techniques, ce qui contribuera à réduire la variation des résultats. Un autre problème récurrent est que l&#39;artertains embryologistes continuent d&#39;être mal informé, aujourd&#39;hui encore, sur la base de revendications que le &quot;refroidissement ultra-rapide des embryons ou des ovocytes dans un« système de vitrification ouvert »(c. -à- contact embryon direct avec l&#39; azote liquide (LN2)) est une condition préalable à l&#39; optimisation les taux de réussite. &quot; De toute évidence, cette croyance est inexacte, basée sur le succès éprouvé des aseptique systèmes 13, 14, 15 fermé. Sur la base des principes cryobiologiques de vitrification, l&#39;efficacité de vitrification est plus fortement dépendant des taux de réchauffement que sur les taux 16, 17, 18 de refroidissement. D&#39;une manière générale, indépendamment du dispositif de vitrification utilisé, le taux de chauffage doit être supérieure à la vitesse de refroidissement afin d&#39;assurer des taux de survie élevés. Les taux élevés de réchauffement minimisent la possibilité pour toute croissance de la glace (ie, le recrystallization d&#39;impuretés nucléées dans cryo-solutions) pendant la phase de réchauffement de la dévitrification. Certes, la stabilité de la solution de vitrification (ie, le type et la concentration des agents cryoprotecteurs utilisés) peut avoir un effet de confusion, mais cela est abordé dans une publication distincte 11. Compte tenu des questions de taux-réchauffement refroidissement, MicroSecure vitrification (pS-VTF) a été développé en 2008 comme une méthode peu coûteuse, non-commerciale, conformes à la FDA qui optimise les aspects de contrôle de qualité de vitrification. Il était unique en ce qu&#39;elle a offert inviolable, intériorisée, double étiquetage de couleur. En outre, en chargeant et en stockant les embryons directement dans le flexipette stérile utilisé pour le pipetage ( à savoir, sans pipetage sur une surface de dispositif secondaire) et en utilisant des pailles ionomère de résine qui scellent complètement soudé au moyen d&#39; un scellement automatique, la variation technique a été effectivement éliminés. Lors de l&#39;évaluation de la completeness de dispositifs de vitrification pour une utilisation potentielle, il existe plusieurs facteurs de contrôle de qualité qui devraient être prises en compte, y compris: 1) Étiquetage étiquettes -Can potentiels être solidement respectées? Sont-ils inviolables? Ils offrent deux couleurs potentiel d&#39;identification? Est - il besoin d&#39; une étiquette secondaire, et peut l&#39;étiquette facilement être enlevé à des fins de tenue de dossiers (c. -à- patients vérification) post-réchauffement? 2) la facilité technique des embryons -Peut être facilement chargés dans / sur le dispositif en temps opportun et simplement identifiés et suivis post-réchauffement? 3) simplicité procédurale / répétabilité -Est la méthode de vitrification offre la simplicité et la fiabilité qui permet facilement de répétabilité, ce qui minimise la variation entre les techniciens (internes) et les programmes (externes)? 4) la capacité de stockage LN 2 -Pouvez les dispositifs facilement et en toute sécurité manipulé et identifié? Leur storage espace potentiel efficace? Est-ce que la sécurité de l&#39;offre de l&#39;appareil et la sécurité contre les dommages physiques ou contaminants possibles comme un système fermé aseptique? 5) Le potentiel de rétablissement / survivabilité -Est la conception sujettes à des problèmes potentiels dans la récupération garantie d&#39;embryons de l&#39; appareil, et seront - ils vitrifier de manière fiable et maintenir post-réchauffement complet de l&#39; intégrité cellulaire? Cette dernière préoccupation de qualité spécifique, le taux de récupération, a effectivement été étonnamment minimisé dans les rapports publiés; cela se fait en se cachant généralement le résultat défavorable (c. -à- embryon perdu ou œuf) dans typiquement de bons taux de survie. Tout dispositif sujettes à récupération incompatibles (&lt;99%) est gravement viciée et constitue une responsabilité procédurale. Notre aseptique, fermée méthode uS-VTF a été stratégiquement conçu pour tenir compte de chaque mesure de contrôle de qualité. Cependant, après 5 ans de succès clinique supérieure et de validation 14, la procédure avait to être modifié. Les pailles originales d&#39;embryons de 0,3 mL (possédant un bouchon hydrophobe) ont été retirés de l&#39;industrie de la FIV et remplacées par une paille de 0,3 ml de sperme possédant un bouchon de coton / PVP standard (c. -à- réétiqueté comme semence / embryon paille). Ce document décrit les étapes de la procédure et des stratégies spécifiques nécessaires pour mettre en œuvre uS-VTF en toute sécurité, tout simplement, et efficacement. En outre, nous mettons en évidence la modification (s) nécessaire pour tenir compte de manière fiable pour les limitations d&#39;approvisionnement, jusqu&#39;à ce que un récipient idéal de remplacement de paille est réintroduit dans le laboratoire clinique.

<table><tbody><tr><td>Canne en aluminium</td><td>IVM</td><td>XC055</td><td></td></tr><tr><td>Roulements à billes, 3/32"</td><td>VXB.com</td><td>KIT15977</td><td>paille</td></tr> de <tr><td>sperme/embryon CBS, 0,3 mL</td><td>CryoBioSystems</td><td>25292</td><td>stérile individuel</td></tr><tr><td>Couleur, tiges d’identification, 30 mm</td><td>CryoBioSystems</td><td>019021-26</td> Tubes <td>de culture pondérés</td></tr><tr><td>, 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td>Conique</td></tr><tr><td>Tubes de culture, 10 mL</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td>Snap-cap</td></tr><tr><td>Cryosleeves</td><td>Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Filtre, 250 mL</td><td>Fisher Sci.</td><td>09-740-2A</td><td>0.22 &mu ; m</td></tr><tr><td>Flacons, Culture tissulaire 50 mL</td><td>Falcon</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Flexipettes, 300 &mu ; m ID</td><td>Cuisinier Med.</td><td>K-FPIP-1300-10BS-5</td><td>Pince stérile, 20/paquet</td></tr><tr><td>Pince, Grande</td><td>pince Miltex</td><td>6-30TC</td><td></td></tr><tr><td>, Écharde - fine</td><td>Miltex</td><td>17-305</td><td></td></tr><tr><td>Gobelet</td><td>IVM</td><td>PA003</td><td></td></tr><tr><td>Thermosoudeuse, SYMS 1</td><td>CryoBioSystems</td><td>16399</td><td>110 V ou 220 V avec adaptateur</td></tr><tr><td>Média tamponné Hepes&nbsp ;</td><td>Life Global ou</td><td>LGGH-100 ; 100&nbsp ; mL, ou</td><td>stocké à 2 - 8 &ordm ; C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>H-HTF ; 90126 ; 100 mL</td><td>avec étiquettes AA non</td></tr><tr><td>essentielles, Cryo</td><td>GA International</td><td>CL-23T1</td> Différentes <td>couleurs</td></tr><tr><td>Réservoir d’azote liquide, 40&nbsp ; L</td><td>MVE ou Taylor Warton</td><td>divers</td><td>stockages liquides&nbsp ;</td></tr><tr><td>LN2 ; Fiole de Dewar, 0,5 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-695</td><td></td></tr><tr><td>Plats Custer 6 puits</td> en acier inoxydable <td>Biogenics</td><td>015/020</td><td>Vaisselle en plastique par étui</td></tr><tr><td>Pipette Bulbe, Micro Cap</td><td>Drummond</td><td>Fisher#13681451</td><td>Trou sur l’apex de l’ampoule</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, 35 mm</td><td>Boîtes</td> de Pétri Falcon <td>351006</td><td></td></tr>, <tr><td>58 mm</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, 100 mm</td><td>Pointes</td><td>de</td> pipette Falcon 351029<td></td></tr><tr><td>, ART long</td><td>Fisher Sci.</td><td>02-707-80</td><td>10 - 100 &mu ; L</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond ou Falcon</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>appareils de pipetage rechargeables, décapant</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, sérologique 1&nbsp ; mL</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, sérologique 2&nbsp ; mL</td><td>Falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, sérologique 5&nbsp ; mL</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, sérologique 10&nbsp ; mL</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>ciseaux, Stéréomicroscope chirurgical Mayo</td><td>Miltex</td><td>5-SC-16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon, Olympus, Leica</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>tampons de gaze stériles, 4 » x 4"</td><td>Kendall Healthcare</td><td>6939</td><td></td></tr><tr><td>Sérum synthétique</td><td>Life Global, ou</td><td>LGPS-20 ; 20 mL, ou</td><td>stocké à 2 - 8 &ordm ; C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>SS-99193 ; 12 x 10 mL</td><td>acheter lot à faible teneur en endotoxines</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>#S9378</td><td>Aliquote en 50&nbsp ; flacons de mL, 1 an ; 
17,1 g/flacon + Moyen à 50 mL ; 
produit une solution de 1 M ; 
Filtre avec 0.22 &micro ; m unité</td></tr><tr><td>Minuterie</td><td>Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Solution de décongélation</td><td>Entreprises cryogéniques innovantes</td><td>BL-TS (&le ; 1,0 m saccharose)</td><td>T1, T2, T3, T4 ; toré à 2 - 8 &ordm ; C comme &le ; 1 mois après l’ouverture de</td></tr><tr><td>la solution de vitrification*,**</td><td>Innovative Cryo Enterprises</td><td>BL-VS (&ge ; 7,9 M [Glycérol/EG])</td><td>V1, V2, V3 ; stocké à 2 - 8 &ordm ; C comme &le ; 1 mois après l’ouverture</td></tr><tr><td colspan="4">* Les additifs cryoprotecteurs non perméants peuvent inclure : du saccharose, du ficoll et de l’hyaluronate de sodium&nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">** Les autres préparations commerciales sont généralement de l’éthylène glycol (EG)/diméthylsulfoxyde (DMSO ; 30 % v/v ; 4,8 M), mais pourraient être de l’EG/propylène glycol (32 % v/v ; 5,2 M). Les solutions mixtes sont généralement utilisées pour réduire les problèmes de cryotoxicité d’une solution à molaire élevée. Les solutions commerciales comprennent généralement une solution ES et VS. La formulation d’une préparation commerciale est généralement une propriété exclusive.</td></tr></tbody></table>

modifié microsecure vitrification: une très procédure cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Embryon vitrification clinique a évolué avec le développement de dispositifs de vitrification uniques dans le 21 ème siècle et avec l&#39;idée fausse que le refroidissement ultra-rapide dans un système «ouvert» (c. -à- directe LN 2 contacts) était une nécessité d&#39;optimiser le succès de vitrification. Le dogme entourant l&#39;importance des taux de refroidissement a conduit à des pratiques dangereuses soumises à des variations techniques et à la création de dispositifs de vitrification qui négligées importants facteurs de contrôle qualité (par exemple, la facilité d&#39;utilisation, la répétabilité, la fiabilité, la sécurité de l&#39; étiquetage, de sécurité et de stockage). Comprendre les défauts de contrôle de qualité des autres appareils autorisés pour le développement d&#39;une méthode uS-VTF sûr, sécuritaire, reproductible et fiable visant à minimiser la variation intra- et inter-technicien. Tout aussi important, il combine la disponibilité de deux dispositifs conformes FDA existants: 1) un ionomère de paille d&#39;embryons de résine 0,3 ml avec intériorisé, deux couleurs, trifouiller-pétiquetage sur le toit avec répétable potentiel de joint de soudure; et 2) raccourcie, couramment utilisé, 300 um ID flexipettes stériles pour charger directement l&#39;embryon (s) afin de créer un dispositif de vitrification global très efficace. Comme les autres aseptique, les systèmes fermés de vitrification (par exemple, de haute sécurité vitrification (HSV), Rapid-i, et VitriSafe) effectivement utilisés en médecine reproductive, microSecure vitrification (pS-VTF) a prouvé qu&#39;il peut atteindre la survie et la grossesse haute post-réchauffement résultats avec son attention à la simplicité, et la variation technique réduite. Bien que la paille de l&#39;embryon 0,3 ml contenant un bouchon hydrophobe interne a été remplacé dans le commerce avec une paille de sperme norme possédant le coton-polyvinylpyrrolidone (PVP) bouchons, il a maintenu sa composition de résine ionomère pour assurer la soudure d&#39;étanchéité. Cependant, les bouchons de coton peuvent évacuer le contenu fluide embryon des flexipettes lors d&#39;un contact. Une méthode uS-VTF modifié a été adapté pour inclure une soudure interne supplémentairesceller avant le bouchon sur le côté dispositif de chargement. L&#39;étape technique ajoutée à la procédure uS-VTF n&#39;a pas affecté son application réussie, les taux de survie aussi élevé (&gt; 95%) et les taux de grossesse se poursuivre aujourd&#39;hui.

1,341 blastocystes vitrifiés ont été réchauffées entre 2012 à Juin 2014, et 1.341 embryons récupérés (100%), tandis que 1.316 ont survécu (98,1%). blastocystes biopsiées connu plus de 99,5% de survie. Lorsque le transfert est essentiellement unique, génétiquement testés, euploïde, embryons vitrifiés, nous avons pu atteindre certains des taux les plus élevés d'implantation et taux de naissances vivantes aux Etats - Unis, indépendamment de l' âge (figure 3) 20, selon les statistiques nationales récentes communiquées par le Centre for Disease Control et la Société pour Assisted reproductive Technologies (tableaux 1 et 2). L' évaluation d' une population de patients bonne pronostic (moins de 35 ans) pour les cycles cryoconservés seuls (tableau 1), notre laboratoire a dépassé la moyenne nationale pour les deux taux d'implantation ( par exemple, l'efficacité d'un embryon pour établir une grossesse) et , finalement , vivent taux de natalité de plus de 30%. En outre, la première validation / vérification de nos pailles de stockage modifiés à la mi-2014 en utilisant 70 recherche consentit blastocystes aneuploïdes re-vitrifiés a donné lieu à 100% de récupération et de survie de 100%. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54871/54871fig1.jpg"> Figure 1. MicroSecure VTF Setup. Le plat de VTF (A) est assemblé avec 3 rangées distinctes de solutions de vitrification, qui utilisent 3 gouttes de lavage avant de les placer dans différents, des gouttelettes de maintien numérotées. En outre, des pipettes individuelles avec des conseils de VTF raccourcis (ie, flexipettes 300 um ID) sont fixés et organisés dans un rack tube de styromousse (B), qui peut être tourné pour une utilisation ordonnée. A noter qu'un ensemble de pipetage jetable de l'ampoule de la micropipette représentative est en appui sur le support de mousse de polystyrène. Arget = "_ blank"&gt; S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54871/54871fig2.jpg"> Figure 2. modification Blastocyste système de classement. comptes Notre système de classement blastocyste Gardner modifié pour la hernie induite des cellules TE pour faciliter blastocyste biopsie. La modification considère l'éclosion prématurée des blastocystes complètes (A: grade 3 = moins de 10% hernies) et blastocystes expansé (B: grade 4 = jusqu'à 50% hernies), tandis qu'un blastocyste éclosion (C) a plus de 50% Hernie 16. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig2large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 54871fig3.jpg "/&gt; Figure 3. Issues de la grossesse comparatifs. Au cours d'un intervalle cumulatif de 1,5 ans, les données de la grossesse ont été comparées pour évaluer les effets du transfert de blastocystes euploïdes vitrifiés réchauffé (n = 172 cycles / 144 transferts) par rapport aux cycles non-PGS (n = 160 cycles / 153 transferts) impliquant principalement frais transfère 18. Pour nos fins expérimentales, ces données révèle clairement que blastocystes biopsiées vitrifiés par la procédure uS-VTF maintiennent leur viabilité. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig3large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> La source de données </td><td> # Cycles </td><td> Moyenne Nombre d'embryons transférés </td><td> Implantation Tarifs (%) </td><td> Taux de natalité en direct (en%) </td></tr><tr><td> NB Lab * </td><td> 144 </td><td> 1.2 </td><td> 74.00% </td><td> 74.50% </td></tr><tr><td> Moyenne nationale </td><td> 20423 </td><td> 1.7 </td><td> 39.60% </td><td> 44.10% </td></tr><tr><td colspan="5"> * Les données ont été en moyenne sur la base des performances 2014 Orange County Fertilité, Californie du Sud Centre de fertilité et le Centre sud de la Californie pour les cliniques de médecine de la reproduction à l'aide du laboratoire de fertilité Ovation actuelle (NB Lab) qui a fondé la procédure microSecure de vitrification en 2008. </td></tr></tbody></table> Tableau 1. 2014 CDC assistée Statistiques sur la reproduction. données transfert d'embryons congelés de la grossesse des femmes de moins de 35 ans de trois rapports cliniques médicales utilisant notre laboratoire NB par rapport aux États-Unis 2013 moyenne nationale de plus de 450 cliniques de déclaration. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Moyennes nationales SART </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clinique - État </td><td> Femmes </td><td> Femmes </td><td> Femmes </td><td> Femmes </td></tr><tr><td></td><td> &lt;35 ans </td><td> 35-37 ans </td><td> 38-40 ans </td><td> 41-42 ans </td></tr><tr><td> SCCRM-CA * </td><td> 63,1% </td><td> 58,3% </td><td> 40,6% </td><td> 32,3% </td></tr><tr><td> CCRM-CO * </td><td> 64,7% </td><td> 61,5% </td><td> 40,4% </td><td> 32,2% </td></tr><tr><td> RMA-NJ * </td><td> 63,2% </td><td> 59,7% </td><td> 34,6% </td><td> 18,7% </td></tr><tr><td> Moyenne nationale </td><td> 48,6% </td><td> 38,3% </td><td> 24,3% </td><td> 12,3% </td></tr><tr><td colspan="5"> California Center SCCRM-Sud pour la médecine reproductive; Centre CCRM-Colorado for Reproductive Medicine; et RMA-Reproductive Médecine Associés </td></tr><tr><td colspan="5"> * Ces principales cliniques ont tous mis en œuvre principalement cycles de transfert d'embryons vitrifiés, en association avec le test génétique préimplantatoire, dans leur pratique courante des soins aux patients afin d'optimiser le succès de naissances vivantes par embryon transplanté. </td></tr></tbody></table> Tableau 2. 2014 taux de naissances vivantes cumulatifs, tel que rapporté par la Société pour Assisted Reproductive Technologies (SART), pour la clinique SCCRM utilisant notre fertilité Lab Ovation à Newport Beach, CA, en contraste avec plusieurs autres programmes respectés, ainsi qu'avec la SART moyennes nationales.

MicroSecure Vitrification a été développé en tant que système de dispositif de vitrification fermé aseptique non commercial, conforme aux bonnes pratiques de fabrication et de manipulation des tissus de la FDA. En raison du retrait des pailles d’embryons bouchés hydrophobes de l’industrie, la procédure de vitrification a été modifiée pour inclure un joint intérieur avant le bouchon intérieur en coton standard.

Modifié MicroSecure Vitrification: Une très procédure Cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

L’objectif global de la méthode de vitrification embryonnaire MicroSecure est de fournir une procédure de vitrification fermée aseptique sûre, sécurisée, simple mais efficace pour les embryons humains. Cette méthode a été développée pour minimiser les variables de contrôle de la qualité dans la vitrification des embryons humains, assurant ainsi un succès fiable et reproductible. Le principal avantage de cette technique est qu’elle s’efforce d’éliminer les différences techniques entre les biologistes et les laboratoires.Notre technique est si simple à mettre en œuvre que nous trouvons que le plus grand défi pour nos stagiaires est d’apprendre à pipeter des embryons sans les perdre. L’idée derrière notre méthode était d’éliminer le besoin d’appareils spécialisés en adaptant deux articles couramment utilisés et approuvés par la FDA. Une paille de stockage ionomérique étiquetée à l’intérieur, et un flexipet stérile.La démonstration visuelle de cette technique est extrêmement utile car elle met en évidence les conseils de base qui garantissent son application réussie. Avant de commencer la procédure, placez la paille de sperme stérile de 0,3 ml sur la surface en téflon de l’électrode d’une scelleuse à impulsion de table, juste devant le bouchon, pour créer un joint interne. Appuyez sur la poignée pour activer la chaleur, en relâchant la poignée lorsque le voyant rouge s’éteint et qu’un bip se fait entendre.Poussez ensuite le bouchon en coton vers l’avant contre le joint intérieur avant de terminer la configuration. Pour la cryodilution et le chargement des échantillons par les blastocystes, retirer la boîte de culture du patient de l’incubateur et confirmer toutes les identifications d’échantillons auprès d’une source secondaire. Sous un stéréomicroscope, utilisez un flexipet de vitrification, appelé pointe de vit, pour déplacer les blastocystes en gouttelettes de maintien individuelles dans la rangée supérieure d’une boîte cryogénique correspondante.Ensuite, préremplissez le flexipet avec 3 microlitres de solution V1 et versez la moitié du contenu sur le premier embryon. Aspirez l’embryon et transférez-le dans la première gouttelette de lavage V1. Ensuite, pipetez l’embryon deux à trois fois autour du périmètre de la gouttelette et nettoyez le contenu résiduel de la pipette à l’extérieur de la gouttelette sur la surface de la boîte.Ensuite, déplacez le blastocyste dans une goutte de maintien V1 individuelle et préchargez l’embout de vit avec la solution V2 suivante avant de pipeter les embryons supplémentaires avec un nouvel embout de vit. Après avoir lavé tous les blastocystes dans les gouttelettes V2 et V3 comme nous venons de le démontrer, éliminez la solution résiduelle et les bulles de l’embout de la vit à l’extérieur de la gouttelette de maintien V3, et remplissez complètement l’embout avec une solution V3 propre autour du premier embryon. Expulsez environ 1 microlitre du volume et aspirez complètement le blastocyste et la solution V3 restante dans l’embout de la vit.Maintenant, retirez l’embout de la pipette et utilisez un tampon de gaze stérile pour sécher la solution V3 résiduelle de la surface extérieure de l’embout de la vit. Le séchage de la surface externe de l’embout est essentiel et n’entraîne aucun risque supplémentaire de perte d’embryons. Ensuite, insérez l’extrémité de la pointe en premier dans l’extrémité ouverte de la paille pré-scellée et retournez la paille, étiquetez l’extrémité vers le bas.Observez l’embout au niveau du bouchon intérieur. Laissez un espace d’air de 1 cm sur l’extrémité ouverte, puis soudez-le en toute sécurité. Lorsque toutes les pailles ont été scellées, plongez-les directement dans de l’azote liquide dans une fiole de Dewar en acier inoxydable et stockez les pailles dans le gobelet ouvert attaché à la canne du patient.Pour l’élution et la dilution de la cryo-solution, placez la boîte de dilution à six puits correspondante au centre d’une platine de stéréomicroscope et une boîte de Pétri de 60 mm contenant un bain chauffant de saccharose à 37 degrés Celsius sur un côté du microscope. Ensuite, isolez la paille à réchauffer et maintenez le joint supérieur de la paille au-dessus du niveau du liquide pour confirmer l’identité de l’échantillon. Utilisez des ciseaux à mayonnaise pour fixer la paille sous le bouchon interne, afin de maintenir l’embout de la capsule immergé dans l’azote liquide.Tapotez fermement les ciseaux contre la fiole de Dewar à plusieurs reprises pour déloger la pointe de la paroi latérale intérieure de la paille par mesure de contrôle de la qualité, et soulevez la paille dans l’air ambiant en direction horizontale à côté ou en dessous de la surface du stéréoscope. En saisissant l’extrémité non étiquetée de la paille, coupez la paille au niveau du bouchon intérieur. Soulevez ensuite la paille au-dessus du plat chauffant du bain et versez l’embout dans le bain à un angle de 60 degrés, jusqu’à ce que l’embout soit complètement extrudé.La base du flexipet doit reposer au-dessus de la paroi latérale du plat. Après 5 à 10 secondes, transférez la base de la pipette dans un appareil de pipetage à microcapuchons. Démarrez une minuterie de cinq minutes.Pendant que vous regardez le microscope, utilisez un index pour couvrir le trou de l’ampoule et pressez doucement l’ampoule pour libérer le blastocyste vitrifié de l’extrémité de la vit dans le lavage T1. Après avoir confirmé la libération du blastocyste, éliminez la solution résiduelle de V3 et les bulles par pression positive, en évacuant le contenu au centre d’un puits de rejet non utilisé. Transférez l’embout de la capsule sur une pipette sterber, en déplaçant l’embryon dans la deuxième gouttelette T1 sous l’huile pendant les quatre minutes restantes.Pendant l’incubation, préremplissez le flexipet avec la solution suivante, puis diluez le blastocyste dans les gouttelettes T2, 3 et 4 à trois minutes d’intervalle. Enfin, équilibrez les blastocystes dans la gouttelette T5 pendant cinq minutes sur une surface à 37 degrés Celsius, avant de les remettre dans l’incubateur. Le système de classification des blastocystes de Gardner modifié considère que les blastocystes complets ont moins de 10 % de hernie des cellules trophectodermiques, tandis que les blastocystes avec jusqu’à 50 % de hernie sont classés comme élargis.Les blastocystes qui présentent une hernie supérieure à 50 % sont considérés comme éclosions. En utilisant les méthodes de cryoconservation et de réchauffement éprouvées, des niveaux élevés de naissances vivantes par début de cycle ont été systématiquement atteints avec ou sans tests génétiques préimplantatoires. Bien que ces succès soient sensiblement plus élevés, en utilisant des blastocystes euploïdes présélectionnés.En effet, en évaluant une population de patients de bon pronostic pour les seuls cycles cryoconservés, ces données de transfert d’embryons congelés démontrent de plus de 30 % de taux de réussite supérieurs à la moyenne nationale pour les taux d’implantation et de naissances vivantes. indépendamment de l’âge, ont été atteints, par rapport aux statistiques nationales récentes rapportées par le Center for Disease Control pour deux autres cliniques de fertilité très respectées, et aux données publiées par la Society for Assisted Reproductive Technologies. La vitrification MicroSecure est une nouvelle procédure aseptique développée dans un souci de facilité technique, de fiabilité et de cryosécurité. Ce système de vitrification simple et non commercial offre une alternative très efficace et peu coûteuse aux appareils de vitrification.Depuis son développement, la méthode MicroSecure a permis d’assurer une récupération de plus de 99,9 % de l’embryon et une survie complète du blastocyste de plus de 95 %. Cela a permis de transformer notre pratique clinique dans presque tous les cycles de transfert d’embyro cryo-conservés au cours des trois dernières années. Nous avons effectivement modifié notre procédure pour inclure un joint intérieur devant le bouchon de coton des pailles de sperme ionomérique afin de produire des joints de soudure fiables et des résultats post-réchauffement exceptionnels.Il existe aujourd’hui de nombreux systèmes de dispositifs différents utilisés dans les industries des technologies de procréation assistée, mais aucun autre dispositif n’offre la simplicité et la répétabilité technique permettant d’éliminer essentiellement les variations de l’utilisateur et d’offrir une sécurité optimisée, comme la vitrification MicroSecure.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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