Name: Linfection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Découvrez la micro-injection de bactéries fluorescentes dans des embryons de poisson zèbre pour visualiser les interactions hôte-pathogène en temps réel. Cette méthode permet d'étudier les réponses immunitaires innées avec précision.

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Les auteurs tiennent à remercier Cui Chao, étage de Kort, Stoop Esther et Ralph Carvalho pour les images de la figure 4, Ulrike Nehrdich et Davy de Witt pour les soins de poissons, et les membres de laboratoire pour d&#39;autres discussions utiles. Ce travail est soutenu par le Programme Smart Mix du ministère néerlandais des affaires économiques et le ministère de l&#39;Education, la Culture et de la Science, de la 7ème Commission européenne cadre du projet ZF-Santé (Santé-F4-2010-242048), l&#39;Union européenne Marie-Curie Formation initiale réseau FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), et par le NHMRC australien (637 394). L&#39;Australien de médecine régénérative Institut est soutenu par des subventions du gouvernement de l&#39;État de Victoria et le gouvernement australien.

<ol><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li>
<li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li>
<li>vander Sar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).</li>
<li>Zakrzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+gene+functions+in+Spi1-directed+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity.</a> Blood. 116, 1-11 (2010).</li>
<li>Le Guyader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126, 3735-3745 (1999).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mycobacterium+marinum+TesA+mutant+defective+for+major+cell+wall-associated+lipids+is+highly+attenuated+in+Dictyostelium+discoideum+and+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos.</a> Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).</li>
<li>Carvalho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).</li>
<li>van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+zebrafish+host+transcriptome+response+to+acute+and+chronic+mycobacterial+infection+and+the+role+of+innate+and+adaptive+immune+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components.</a> Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Brain+Ventricle+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Brain Ventricle Injection.</a> J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 49-56 (2011).</li>
<li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+and+functional+analyses+of+the+zebrafish+embryonic+innate+immune+response+to+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection.</a> J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).</li>
<li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Stoop, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).</li>
<li>Levraud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+zebrafish+IFN+receptor%3A+implications+for+the+origin+of+the+vertebrate+IFN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system.</a> Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li>
<li>van Soest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).</li>
<li>Adams, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li>
<li>Ellett, F. L., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+quantification+of+fluorescent+leukocyte+numbers+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos.</a> Methods in Enzymology. , (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).</li>
<li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les méthodes d&#39;infection décrites dans cet article sont fréquemment utilisés pour étudier la fonction de gènes de l&#39;hôte de l&#39;immunité innée ou des gènes de virulence bactériens 1. Les micro-injection par voie intraveineuse (méthodes des protocoles 5 et 6.1) sont utilisés le plus souvent pour de telles études. La veine caudale à l&#39;île du sang postérieure est l&#39;endroit le plus commode pour l&#39;injection intraveineuse de 1-jour vieux embryons. Comme la veine caudale devient plus difficile de pénétrer à des stades ultérieurs, nous préférons le canal de Cuvier en tant que site d&#39;injection par voie intraveineuse pour les embryons à 2-3 dpf. Dans tous les cas, il est essentiel d&#39;injecter des embryons avec des chiffres cohérents de bactéries, ce qui doit être vérifiée par l&#39;injection de placage inoculums pour le comptage des CFU. Les aspects suivants doivent être considérés pour atteindre injections reproductibles. Tout d&#39;abord, il est essentiel de disposer d&#39;aiguilles de haute qualité en verre injection microcapillaires. Si la pointe de l&#39;aiguille est trop grande, l&#39;injection va créer un trou de perforation assez grand pour des saignements de se produire etles bactéries injectées s&#39;écoule de la circulation sanguine. Deuxièmement, les bactéries doivent être injectés directement dans la circulation sanguine. Si la pointe de l&#39;aiguille n&#39;est pas à l&#39;intérieur de la veine ou si les écarts de fluides d&#39;injection dans l&#39;extension du sac vitellin, l&#39;embryon doit être mis au rebut de l&#39;expérience. Troisièmement, à l&#39;aide PVP40 comme support pour injecter M. marinum aidera à prévenir les bactéries de sombrer dans l&#39;aiguille de verre. PVP40 améliore l&#39;homogénéité de la suspension, ce qui entraîne inoculums plus reproductibles pendant toute la durée d&#39;injections. PVP40 peut également être utilisé pour S. injections typhimurium, mais ici il est moins important parce que la plus grande taille et de la fluorescence lumineuse des bactéries permet un contrôle visuel sur l&#39;inoculum d&#39;injection au cours des expériences. Pour pratiquer les injections, nous recommandons l&#39;utilisation de phénol colorant rouge (1% v / v) ou 1 pm sphères fluorescentes disponibles en différentes couleurs (Invitrogen). Une fois que la technique est maîtrisée, il faut environ 30 minutes pour injecter 50-100 embryons, y compris le temps nécessaire pour aligner les embryons sur des plaques d&#39;agarose et le réglage du volume d&#39;injection bactérienne. Alors que les injections intraveineuses dans l&#39;île du sang (protocole 5) ou dans le canal de Cuvier (protocole 6.1) sont les plus couramment utilisés, les autres voies d&#39;infection décrites dans cet article la vidéo se sont révélées utiles pour étudier des macrophages et des neutrophiles chimiotactisme (protocoles 6.2, 6.3 , et 6.4), pour étudier la croissance des souches bactériennes atténuées (protocole 6.5), et d&#39;adapter le modèle d&#39;infection le poisson-zèbre pour applications à haut débit (protocole 6.6) 4-8. Les décrits de micro-injection méthodes peuvent également être appliquées pour des injections de virus 18, 19, les spores fongiques 14, 20 ou parasites protozoaires (Maria Forlenza, communication personnelle). Un complément utile aux procédures d&#39;injection décrites dans cet article la vidéo est une procédure récemment décrit pour injection sous-cutanée de bactéries dans zebrembryons afish 21. Cette procédure a été appliquée à l&#39;étude la phagocytose des bactéries par les neutrophiles, qui ont été trouvés pour les bactéries de manière efficace sur les surfaces des tissus engloutissent, mais, contrairement à macrophages, étaient pratiquement incapables de phagocyter les bactéries lors de l&#39;injection dans le sang ou dans les cavités corporelles remplies de liquide. Pour les embryons injections sous-cutanées sont positionnés les mêmes que pour les injections musculaires queue décrites dans cet article la vidéo, mais l&#39;aiguille est insérée sous la peau pour injecter des bactéries sur une somite. Il est important de considérer que la micro-injection est essentiellement une voie artificielle de l&#39;infection. Cependant, les embryons précoces sont très résistants à l&#39;exposition externe aux pathogènes bactériens. En fait, les essais d&#39;immersion, où les embryons sont baignés dans une suspension bactérienne, ne sont pas reproductibles dans nos mains 22. Alors que certains embryons peuvent être infectés lors de l&#39;immersion, nous avons observé une grande variation dans les taux de mortalité et de l&#39;expressions de gènes marqueurs inflammatoires entre les embryons individuels dans de tels essais. Les méthodes d&#39;injection de micro-décrites dans cet article d&#39;atteindre les infections reproductibles et sont particulièrement utiles pour étudier les interactions bactéries avec les cellules immunitaires innées d&#39;accueil. Une approche efficace pour quantifier une infection bactérienne chez les embryons individuels est d&#39;analyser les images fluorescentes d&#39;embryons infectés par le sur-mesure, le logiciel dédié pixel quantification 17, 23. Cette approche a été démontré une bonne corrélation avec les résultats de UFC après placage d&#39;embryons infectés. De même, les changements relatifs dans le nombre de leucocytes par embryon ont été quantifiés par analyse d&#39;image numérique dans les lignes de leucocytes transgéniques journaliste fluorophores; cette approche serait applicable à la quantification de la réponse de l&#39;hôte à l&#39;infection leukopoietic 24. La fonction de gènes immunitaires innées de l&#39;hôte peuvent être étudiés efficacement in vivo par la combinaison des modèles d&#39;infection décritesavec effet de choc morpholino. Morpholinos sont des oligonucléotides antisens synthétiques qui ciblent ARN spécifiques et de réduire l&#39;expression des produits géniques lorsqu&#39;il est injecté dans 1-cellules embryons de poisson zèbre scène comme le montre la vidéo d&#39;autres articles dans cette revue 10, 25. Dans les études knockdown morpholino, il est d&#39;une grande importance que tous les groupes d&#39;embryons doivent être comparées sont mis en scène correctement avant les injections bactériennes. Ceci est particulièrement important parce que les embryons ont un système immunitaire en développement qui devient de plus en plus compétente au fil du temps. Il ya plusieurs lignes de reporter transgéniques actuellement disponibles pour distinguer les grands sous-ensembles innées immunitaire, les macrophages et les polynucléaires neutrophiles, en embryons de poisson zèbre. Le megapixels et promoteurs Lyz ont été utilisés pour générer des lignes de reporter neutrophiles 16, 26, 27, et le CSF1R (FMS) et MPEG1 promoteurs ont été utilisés pour produire des journalistes macrophages 14, 28. Alors que csf1r (FMS) est en outre exprimé dans xanthophores, mpeg1 expression est exclusivement dans les macrophages. Comme le montre dans cet article la vidéo, les mpeg1 récemment mis au point des lignes journaliste sont très utiles pour la phagocytose par les macrophages imagerie bactérienne.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Fournisseur </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco agar Middlebrook 7H10 </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC enrichissement </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco Bouillon Middlebrook 7H9 </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC enrichissement </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-phénylthiourée (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Ethyl 3-aminobenzoate sel de méthanesulfonate (tricaïne) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Méthylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque agarose (agarose à faible point de fusion) </td><td> Lonza Inc </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 um, rouge fluorescent (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 um, jaune-vert fluorescent (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

l&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Poisson zèbre (Danio rerio) embryons sont de plus en plus utilisé comme un modèle pour étudier la fonction du système immunitaire des vertébrés innée dans les interactions hôte-pathogène 1. Les principaux types de cellules du système immunitaire inné, les macrophages et les neutrophiles, les développer au cours des premiers jours de l&#39;embryogenèse avant la maturation des lymphocytes qui sont nécessaires pour les réponses immunitaires adaptatives. La facilité d&#39;obtention de grands nombres d&#39;embryons, leur accessibilité en raison du développement externe, la transparence optique de stades embryonnaire et larvaire, un large éventail d&#39;outils génétiques, de vastes ressources mutantes et des collections de lignes de reporter transgéniques, tous les ajouter à la polyvalence du poisson-zèbre modèle. Salmonella enterica sérotype Typhimurium (S. typhimurium) et Mycobacterium marinum peut résider intracellulaire dans les macrophages et sont fréquemment utilisés pour étudier les interactions hôte-pathogène chez les embryons de poisson zèbre. Les processus d&#39;infection de ces deuxdes bactéries pathogènes sont intéressants à comparer car S. infection aiguë et typhimurium est mortelle dans la journée, tandis que M. l&#39;infection marinum est chronique et peut être imagée en place au stade larvaire 2, 3. Le site de micro-injection de bactéries dans l&#39;embryon (Figure 1) détermine si l&#39;infection deviendra rapidement systémique ou un premier temps restent localisées. Une infection systémique rapide peut être établie par micro-injection des bactéries directement dans la circulation sanguine via la veine caudale à l&#39;île du sang postérieure ou via le canal de Cuvier, un canal large diffusion sur le sac vitellin reliant le cœur de la vascularisation du tronc. Au 1 dpf, lorsque les embryons à ce stade ont macrophages phagocytically actifs, mais les neutrophiles n&#39;ont pas encore mûri, l&#39;injection dans l&#39;île du sang est préférable. Pour les injections à 2-3 dpf, lorsque les embryons ont également développé fonctionnels (myéloperoxydase-productrice) neutrophiles, le canal de Cuvier est préférable que tsite d&#39;injection, il. Pour étudier la migration dirigée des cellules myéloïdes vers les infections locales, les bactéries peuvent être injectés dans le muscle queue, vésicule otique, ou rhombencéphale ventricule 4-6. En outre, la notochorde, une structure qui semble être normalement inaccessibles aux cellules myéloïdes, est très sensible à l&#39;infection locale 7. Une alternative utile pour applications à haut débit est l&#39;injection de bactéries dans le jaune d&#39;embryons dans les premières heures après la fécondation 8. La combinaison de bactéries fluorescentes et les lignes de poisson-zèbre transgénique avec des macrophages ou de neutrophiles fluorescentes crée des conditions idéales pour l&#39;imagerie multi-couleur des interactions hôte-pathogène. Cet article décrira vidéo des protocoles détaillés pour l&#39;infection par voie intraveineuse et locale des embryons de poisson zèbre avec S. typhimurium ou M. bactéries marinum et pour l&#39;imagerie de fluorescence ultérieure de l&#39;interaction avec les cellules du système immunitaire inné.

Embryons de poisson zèbre transparent ont prouvé hôtes modèle utile pour visualiser et les interactions entre l&#39;étude fonctionnellement les cellules immunitaires innées et bactéries pathogènes intracellulaires, tels que<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Micro-injection de bactéries et de multi-couleur d&#39;imagerie de fluorescence sont des techniques essentielles intervenant dans l&#39;application de poisson-zèbre modèles d&#39;infection d&#39;embryons.

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Les embryons de poisson-zèbre (Danio rerio) sont de plus en plus utilisés comme modèle pour étudier la fonction du système immunitaire inné des vertébrés dans les interactions hôte-pathogène...

L'objectif général de cette procédure est d'injecter par micro-injection des embryons de poisson zèbre avec des bactéries fluorescentes afin d'observer en direct l'interaction avec les cellules immunitaires de l'hôte. Cette opération s'effectue en préparant et en chargeant d'abord l'aiguille d'injection avec des suspensions bactériennes. Ensuite, les embryons sont stagiés et alignés sur une plaque d'injection.Ensuite, l'inoculum bactérien est injecté selon une voie permettant d'obtenir une infection bactérienne soit locale, soit systémique. Enfin, les embryons sont montés et observés en microscopie. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant la localisation intracellulaire de pathogènes bactériens à l'intérieur de phagocytes fluorescents de l'hôte embryonnaire transparent du poisson zèbre, grâce à la microscopie de fluorescence et à la microscopie confocale.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, car le modèle d'embryon de poisson zèbre est très puissant pour l'imagerie en temps réel des interactions hôte-pathogène. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car elle exige beaucoup de pratique pour injecter de façon reproductible des bactéries par microinjection dans la circulation sanguine des embryons de poisson zèbre afin d'induire une infection systémique, ou dans des compartiments spécifiques pour provoquer des infections locales. Après avoir tiré des micropipettes en verre et affûté leurs extrémités selon un angle de 45 degrés, positionner les embryons de poisson zèbre à 28 heures post-fécondation en vérifiant la présence d'une circulation sanguine régulière, le début de la pigmentation de l'œil, une queue droite et la position du cœur juste en dessous de l'œil.Une fois les embryons anesthésiés, utilisez une pointe de micro-chargeur pour charger l'aiguille avec un inoculum bactérien préalablement préparé. Montez l'aiguille chargée sur un micromanipulateur fixé à un support et placez-la sous un microscope stéréo. Réglez le temps d'injection sur 0,2 seconde et la pression de compensation à 15 hectopascals.Réglez la pression d'injection entre 700 et 900 hectopascals pour obtenir le volume d'injection approprié en fonction de l'aiguille utilisée. Placez le micromanipulateur muni de l'aiguille chargée en position avant l'injection. Disposez les embryons anesthésiés sur une plaque d'injection plate contenant 1 % d'agarose et retirez tout excès d'eau d'œuf.Ensuite, utilisez un outil en forme de boucle à cheveux pour aligner les embryons pour chaque injection. Déplacez la plaque manuellement pendant les injections afin d'orienter les embryons avec la queue dirigée vers la pointe de l'aiguille. Placez la pointe de l'aiguille directement au-dessus de la veine coddle, près de l'orifice urogénital.Percez l&#39;endoderme avec la pointe de l&#39;aiguille et injectez la dose souhaitée de bactéries marquées au fluorochrome. Nous utilisons environ 250 unités formant colonies, ou UFC, de salmonella typhimurium et environ 120 UFC de mycobacterium marum. La suspension bactérienne injectée suivra le flux sanguin à travers la veine coddle en direction du moniteur cardiaque si l&#39;injection a été correctement réalisée, ce que l&#39;on vérifie par l&#39;observation d&#39;un volume croissant du système vasculaire juste après le pouls.Vérifiez fréquemment que le volume injecté reste constant au cours de l'expérience. Pour contrôler la reproductibilité des injections tout au long de l'expérience, injectez une goutte de bactéries directement sur une goutte de PBS stérile déposée sur un milieu de croissance bactérien. Après environ chaque 30e injection d'embryon, étalez cette goutte sur un milieu solide et dénombrez les colonies bactériennes après incubation.Pour déterminer le nombre d'UFC dans le volume d'injection, utilisez un microscope stéréo fluorescent pour observer les cellules individuelles de styrie fluorescentes circulant dans la circulation sanguine immédiatement après l'injection, et écartez les embryons qui n'ont pas été correctement injectés. Des agrégats fluorescents de bactéries M marum doivent être visibles deux jours après l'infection et augmenter progressivement en taille. Pour injecter dans le canal de Cuvier, alignez des embryons anesthésiés âgés de deux à trois jours après la fécondation.Pour l'injection dans la veine coddle à un angle de 45 degrés par rapport au côté dorsal de l'embryon, insérer l'aiguille au point de départ du canal de Cuvier. Légèrement au-dessus du point où le canal commence à s'élargir au-dessus du sac vitellin, pour une injection dans le ventricule du cerveau postérieur. Anesthésier les embryons 32 heures après la fécondation, leur côté dorsal orienté vers la pointe de l'aiguille.Insérez l'aiguille dans le ventricule du cerveau postérieur à partir d'une position antérieure, sans toucher le neurohélicum, afin d'injecter les muscles de la queue. Placez les embryons anesthésiés âgés d'un à deux jours après la fécondation de manière à ce que leur queue soit orientée vers la pointe de l'aiguille et que l'aiguille forme un angle d'environ 65 degrés ; injectez dans le muscle situé au-dessus de l'orifice urogénital pour les injections dans la vésicule otique. Orientez les embryons anesthésiés âgés de deux à trois jours après la fécondation de façon que leurs queues soient dirigées vers l'aiguille.Injecter à un angle de 65 degrés et à basse pression pour pénétrer dans le cordon du nœud à l’aide d’un à deux jours. Embryons post-fécondation orientés avec la queue dirigée à l’opposé de l’aiguille. Insérer l’aiguille à travers le tissu musculaire de la queue jusqu’au cordon.Pour une injection dans le vitellus des embryons au stade de 16 à 1000 cellules, percer la membrane chorionique avec l'aiguille jusqu'au centre du vitellus afin d'observer l'infection. Anesthésier les embryons infectés dans une boîte de Pétri recouverte d'une couche d'eau d'œuf contenant du trica. À l’aide d’un outil en forme de boucle en cheveu, aligner les embryons dans la position correcte pour l’imagerie sous un stéréomicroscope à fluorescence.On peut observer directement après l'injection des cellules individuelles fluorescentes en circulation dans le flux sanguin. Si une position différente de la vue latérale est nécessaire, monter les embryons dans du méthylcellulose à 1,5 % et utiliser un outil en forme de boucle de cheveu pour manipuler l'embryon afin d'obtenir la position requise pour imager l'infection à l'aide d'un microscope confocal inversé.Déposez une goutte d'aéros à bas point de fusion sur une boîte en verre à fond plat. Placez l'embryon anesthésié dans la goutte d'aéros avec une quantité limitée d'eau d'œuf et utilisez un outil en forme de boucle capillaire pour positionner l'embryon. Laissez l'aéros durcir, puis immergez la goutte d'aéros dans de l'eau d'œuf contenant de la trica.L'échantillon est désormais prêt pour l'injection en imagerie confocale de bactéries Salmonella typhimurium ou Mycobacterium marum dans l'îlot sanguin d'embryons âgés d'un jour. Après fécondation, cela entraîne une phagocytose rapide par les macrophages. La dissémination de bactéries styriennes marquées avec DS.Red, relativement grandes et fortement fluorescentes, peut être visualisée directement par imagerie en fluorescence stéréo et imagerie confocale deux heures après l'infection. L'observation montre que de nombreuses bactéries sont phagocytées par des macrophages fluorescents.Une dose d'injection de 250 UFC de souche sauvage styria induira une réponse pro-inflammatoire intense et sera létale en moins d'une journée. En revanche, l'injection intraveineuse d'&lt;em&gt;erum&lt;/em&gt; provoque une infection persistante au cours de laquelle les macrophages infectés forment des agrégats compacts considérés comme les stades initiaux de granulomes, caractéristiques marquantes de la tuberculose. L'imagerie en microscopie confocale d'un tel agrégat de type granulomateux, réalisée sur la lignée transgénique EG une EGFP cinq jours après l'infection, met en évidence la croissance intracellulaire de bactéries &lt;em&gt;M num&lt;/em&gt; marquées par la protéine m-cherry.À l'intérieur des macrophages fluorescents verts, des bactéries peuvent être injectées dans le ventricule cérébral postérieur, un compartiment dépourvu de macrophages à 32 heures post-fécondation. L'injection de 20 à 100 unités formant colonies (UFC) de bactéries M marum marquées au Cherry dans ce compartiment entraîne une infiltration rapide par des macrophages qui phagocytent les bactéries, comme illustré ici. En utilisant le transgène M-P-X-E-G-F-P, l'injection d'environ 20 UFC de Styria dans la vésicule otique conduit à l'attraction de neutrophiles trois heures post-infection. Bien que cette réponse ne soit pas observée lors d'injections contrôles au PBS, la notochorde, qui semble résistante à l'infiltration des leucocytes, constitue un compartiment permisif pour la croissance de mutants erum fortement atténués lorsqu'ils sont injectés dans d'autres tissus.Après une injection jumelée d'une dose de 2240 UFC, les bactéries erum se répandent pendant plusieurs jours dans les tissus embryonnaires et forment des agrégats semblables à des granulomes, similaires à ceux observés avec la méthode conventionnelle d'injection intraveineuse. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'un bon étalement des embryons de poisson zèbre est essentiel, car le système immunitaire embryonnaire devient de plus en plus compétent au cours du développement.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le profilage du transcriptome et l'immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont le système immunitaire inné de l'embryon réagit aux infections pathogènes.

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