L'infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

L’objectif global de cette procédure est de micro-injecter des embryons de poisson-zèbre avec des bactéries fluorescentes pour l’imagerie en direct de l’interaction avec les cellules immunitaires de l’hôte. Pour ce faire, il faut d’abord préparer et charger l’aiguille d’injection avec des suspensions bactériennes. Ensuite, les embryons sont stabilisés et alignés sur une plaque d’injection.

Ensuite, l’inoculum bactérien est injecté par une voie permettant d’obtenir une infection bactérienne locale ou systémique. Enfin, les embryons sont montés et les embryons sont imagés. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la localisation intracellulaire des agents pathogènes bactériens à l’intérieur des phagocytes fluorescents de l’hôte embryonnaire transparent du poisson-zèbre par fluorescence et microscopie confocale.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, car le modèle d’embryon de poisson-zèbre est très puissant pour l’imagerie de la vie des interactions hôte-pathogène, Généralement, les individus novices en matière de cette méthode auront du mal car elle nécessite beaucoup de pratique Pour micro-injecter de manière reproductible des bactéries dans la circulation sanguine des embryons de poisson-zèbre pour une infection systémique ou dans des compartiments spécifiques pour réaliser des infections locales. Après avoir retiré des aiguilles microcapillaires en verre et biseauté les pointes à un angle de 45 degrés, stabilisez les embryons de poisson zèbre 28 heures après la fécondation en vérifiant la circulation sanguine constante. Le début de la pigmentation dans l’œil, une queue droite et le cœur positionné juste ventralement par rapport à l’œil.

Une fois les embryons anesthésiés, utilisez une pointe de micro-chargeur pour charger l’aiguille avec un inoculum bactérien préalablement préparé. Montez l’aiguille chargée sur un micromanipulateur relié à un support et positionnez-la sous un stéréomicroscope. Réglez le temps d’injection à 0,2 seconde et la pression de compensation à 15 Hector Pascals.

Ajustez la pression d’injection entre 700 et 900 Hector Pascals pour obtenir le bon volume d’injection pour l’aiguille utilisée. Placez le micromanipulateur avec l’aiguille chargée dans la bonne position avant l’injection. Placez les embryons anesthésiés sur une plaque d’injection plate à 1 % d’agarose et retirez tout excès d’eau d’œuf.

Ensuite, utilisez un outil de boucle de cheveux pour aligner les embryons pour chaque injection. Déplacez la plaque à la main lors des injections pour orienter les embryons avec leur queue pointant vers la pointe de l’aiguille. Placez la pointe de l’aiguille directement au-dessus de la veine du codd, près de l’ouverture urogénitale.

Percez le périderme avec la pointe de l’aiguille et injectez la dose souhaitée de bactéries marquées par fluorescence. Nous utilisons environ 250 unités formant colonies ou UFC de salmonella typhimurium et environ 120 UFC de mycobacterium marum. La suspension bactérienne injectée suivra le flux sanguin à travers la veine du cajoleur vers le moniteur cardiaque si l’injection a été effectuée correctement en vérifiant l’expansion du volume du système vasculaire directement après le pouls.

Vérifiez fréquemment que le volume d’injection reste le même pendant l’expérience. Pour contrôler l’uniformité des injections tout au long de l’expérience, injectez une goutte de bactéries directement sur une goutte de PBS stérile sur un milieu de croissance bactérienne. Après environ toutes les 30 injections d’embryons, mettez cette goutte dans une assiette et comptez les colonies bactériennes après l’incubation.

Pour déterminer l’UFC dans le volume d’injection, utilisez un stéréomicroscope à fluorescence pour observer les cellules de styrie fluorescentes individuelles circulant dans la circulation sanguine directement après l’injection et jetez les embryons qui ne sont pas correctement injectés. Les agrégats fluorescents de bactéries M marum devraient être visibles deux jours après l’infection et grossir avec le temps. Pour injecter dans le canal de cuvier, alignez anesthésier deux à trois jours après la fécondation des embryons.

En ce qui concerne l’injection de la veine du cajolot à un angle de 45 degrés par rapport à la face dorsale de l’embryon, insérez l’aiguille dans le point de départ du canal de cuvier. Juste dorsal à l’endroit où le canal commence à s’élargir sur le sac vitellin pour la position d’injection du ventricule du cerveau postérieur. Anesthésier 32 heures après la fécondation des embryons avec leur face dorsale vers la pointe de l’aiguille.

Insérez l’aiguille dans le ventricule du cerveau postérieur à partir d’une position antérieure sans toucher le neurohélium pour l’injecter dans les muscles de la queue. Placez les embryons anesthésiés un à deux jours après la fécondation avec leur queue pointant vers l’extrémité de l’aiguille et avec l’aiguille à un angle d’environ 65 degrés, injectez-la dans le muscle au-dessus de l’ouverture urogénitale pour l’injection de vésicules otiques. Orientez anesthésier deux à trois jours après la fécondation des embryons, la queue pointant vers l’aiguille.

Injectez à un angle de 65 degrés et à basse pression pour injecter dans le cordon nodal en utilisant un à deux jours. Embryons post-fécondation avec la queue pointant à l’opposé de l’aiguille. Insérez l’aiguille à travers le tissu musculaire de la queue dans le cordon.

Pour une injection de vitellus des embryons au stade 16 à 1000 cellules, percez l’aiguille à travers le corion au centre du jaune pour imager l’infection. Anesthésez les embryons infectés dans une boîte de Pétri en couches à 1 % recouverte d’eau d’œuf contenant du trica. À l’aide d’un outil de boucle de cheveux, les embryons ont été alignés dans la bonne position pour l’imagerie au stéréomicroscope fluorescent.

Des cellules fluorescentes individuelles peuvent être observées circulant dans la circulation sanguine directement après l’injection. Si une position différente de la vue latérale est requise. Montez les embryons dans de la méthylcellulose à 1,5 % et utilisez un outil de boucle capillaire pour manipuler l’embryon dans la position requise pour imager l’infection à l’aide d’un microscope confocal inversé.

Placez une goutte d’aeros à bas point de fusion sur un plat à fond de verre. Placez l’embryon anesthésié dans l’aérochute avec une quantité limitée d’eau d’œuf et utilisez un outil de boucle de cheveux pour manipuler l’embryon en position. Laissez l’aéro se solidifier et immerger la goutte d’aéro dans de l’eau d’œuf contenant du trica.

L’échantillon est maintenant prêt pour l’injection d’imagerie confocale des bactéries Salmonella Typhimurium ou Mycobacterium marum dans l’îlot sanguin des embryons à un jour. La post-fécondation entraîne la phagocytose rapide par la dissémination des macrophages du SD relativement grand et fluorescent. Les bactéries styriennes marquées en rouge peuvent être imagées directement par stéréofluorescence et imagerie confocale à deux heures. La post-infection montre que de nombreuses bactéries sont phagocytés par des macrophages fluorescents.

Une dose d’injection de 250 UFC de styrie de type sauvage induira une forte réponse pro-inflammatoire et est létale en une journée. En revanche, l’injection intraveineuse de sérum conduit à une infection persistante où les macrophages infectés forment des agrégats serrés qui sont considérés comme les premiers stades des granulomes, qui sont la marque de la tuberculose. L’imagerie confocale d’un tel granulome dans la lignée transgénique EG one EGFP cinq jours après l’infection montre la croissance intracellulaire des bactéries M num marquées au cerisier.

À l’intérieur des macrophages fluorescents verts, les bactéries peuvent être injectées dans le ventricule du cerveau postérieur, qui est un compartiment dépourvu de macrophages 32 heures après la fécondation. L’injection de 20 à 100 M de bactéries M marum marquées cerise dans ce compartiment conduit à l’infiltration rapide par les macrophages qui phagocytent les bactéries comme indiqué ici. L’utilisation de l’injection transgénique M-P-X-E-G-F-P d’environ 20 UFC de Styrie dans la vésicule otique entraîne l’attraction des neutrophiles trois heures après l’infection. Bien que cette réponse ne soit pas observée dans les injections de contrôle PBS, la notochorde, qui semble résister à l’infiltration par les leucocytes, est un compartiment permissif pour la croissance des mutants de l’érum qui sont fortement atténués lorsqu’ils sont injectés dans d’autres tissus.

Après l’injection d’une dose de 2240 UFC, les bactéries érythromes se propagent pendant plusieurs jours dans les tissus embryonnaires et forment des agrégats semblables à des granulomes. Similaire à ceux observés avec la méthode d’injection intraveineuse conventionnelle. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’une bonne stadification des embryons de poisson-zèbre est essentielle car le système immunitaire embryonnaire devient de plus en plus compétent au cours du développement.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage du transcriptome et l’immunohistochimie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont le système immunitaire inné embryonnaire réagit aux infections pathogènes.