Name: Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Apprenez à isoler des microglies primaires à partir de cerveaux de rats nouveau-nés par culture gliale mixte et agitation mécanique. Cette méthode offre une haute pureté cellulaire pour étudier les fonctions microgliales in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financé par le programme intra-muros à l&#39;Université en uniforme des services.

1. Dissection des tissus de cerveau de rat nouveau-né <ol><li> Refroidissement Leibovitz L-15 milieux conditionnés (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) à 4 ° C. Milieux de culture chaudes (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) à 37 ° C. Préparer 4 60x15 mm boîtes de Pétri avec 4-5 ml de L-15 climatisées médias sur la glace. Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec de l&#39;éthanol 100%. </li><li> Rincer les chiots nouveau-nés P2 rap avec de l&#39;éthanol 70%. (Ratons nouveau-nés âgés de P1 à P5 peut être utilisé dans ce protocole.) </li><li> Rapidement décapiter un raton avec des ciseaux bien aiguisés stériles et déposer la tête immédiatement dans l&#39;éthanol à 70%. Répétez l&#39;opération pour un total de 5 ratons ensuite transférer la tête dans une solution saline. </li><li> Retirez les cerveaux entiers de la tête et les placer dans une boîte de Pétri avec 4 - 5 ml solution L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + 1% Pen / Strep) sur la glace. </li><li> Répéter les procédures 1.2 - 1.4 pour les chiots qui restent dans la litière. </li><li> Retirez les méninges du cerveau et de transférer le destissu cérébral IRED (c.-à-cortex, le cervelet, le cerveau entier, etc) dans un nouveau plat de Pétri avec 4-5 ml de solution de L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) sur la glace. </li></ol> 2. Préparation de la population de cellules gliales mixte <ol><li> Sans endommager le tissu cérébral avec des ciseaux ou une lame, transférer le tissu avec une pipette de 10 ml à 50 ml une stérile tube conique. </li><li> Centrifuger conique à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant. Ajouter 4-5 ml de frais L-15 médias (Leibowitz L-15 + 0,1% + 1% BSA Pen / Strep). </li><li> Introduire à la pipette des tissus de haut en bas 10 fois avec une pipette stérile de 10 ml. </li><li> Placer un tamis cellulaire (100 pores um) sur un nouveau tube de 50 ml conique. Tissus pipette de haut en bas une fois avec une solution stérile de pipette 5 ml et que la pipette au ras de la crépine cellule, distribuer le matériau à travers la crépine cellule dans le tube conique. </li><li> Rincer la crépine cellule avec 4-5 ml de frais L-15 médias (Leibowitz L-15 + 0,1% BSUn stylo + 1% / Strep). </li><li> Centrifuger conique avec des cellules tendues à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C. </li></ol> 3. Placage et d&#39;entretien des cultures mixtes de cellules gliales <ol><li> Pour chaque cerveau de rat nouveau-nés traités, préparer 1 T-75 stériles flacon en ajoutant 12 ml de milieux de culture (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) dans chaque flacon. </li><li> Aspirer le surnageant des cellules granulées et ajouter 5-6 ml de milieux de culture pour le culot cellulaire. Introduire à la pipette de haut en bas 10 fois avec une pipette de 10 ml. </li><li> Transférer un volume égal de suspension cellulaire dans chaque fiole T-75. </li><li> Incuber fioles dans un 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C pour un total de 1-3 semaines. </li><li> Flacons devrait d&#39;abord être incubées pendant 5 jours, et le cinquième jour, remplacer les milieux de culture dans chaque flacon avec 12 ml de milieu frais et retourner à l&#39;incubateur. Puis, tous les 3 jours, remplacer les milieux conditionnés dans chaque flacon avec 12 ml de milieu frais pour atteindre la confluence. Ce doit être le fairene très attentivement sans toucher le fond des flacons où les cellules se fixent. </li></ol> 4. Isolement et Revêtement de l&#39;enseignement primaire microglies <ol><li> Après mixtes cultures gliales sont complètement confluentes, retirez flacons de l&#39;incubateur et les caches flacon avec du parafilm pour éviter les échanges gazeux avec l&#39;air ambiant. </li><li> Agiter flacons à 100 RPS (Companion Lab SI-600, JEIO Tech) pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Recueillir les médias de tous les flacons avec une pipette de 10 ml, sans perturber la couche d&#39;astrocytes à la surface ballon. Placez le support dans des tubes de 50 ml coniques. Ajouter des milieux frais aux flacons et bouteilles de retour à l&#39;incubateur. </li><li> Centrifuger les tubes coniques à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer surnageant de tous les tubes coniques. Les culots cellulaires sont élevés cellules de la microglie de pureté. Pellets Remettre en suspension dans 1 ml de placage microglie médias (DMEM + FES 10% + 1% de pénicilline / streptomycine). </li><li> Comptez la densité cellulaire dans les médias remises en suspension à l&#39;aideun hémocytomètre. </li><li> Ajouter un volume approprié de géloses microglies pour atteindre un 2 x 10E5 cellules par ml de densité. Plate comme il convient pour l&#39;analyse expérimentale. </li><li> Autoriser les microglies pour attacher la nuit. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Le protocole décrit ci-dessus les résultats dans les cultures primaires de haute pureté microglie. Comme déterminé par immunohistochimie pour un marqueur cellulaire de macrophages / microglies spécifique (Iba1), plaqués cultures microglies sont&gt; à 90% (figure 2). En outre, la coloration des marqueurs de cellules astrocytes, oligodendrocytes et des neurones spécifiques démontre une contamination minimale (figure 2). Après avoir établi mixtes cultures de cellules gliales, la microglie peut être isolé en secouant jusqu&#39;à 4 fois successives. L&#39;isolement initial microglie donnera environ 2,2 x 106 cellules / ml ou environ 9 millions de cellules par 10 flacons et le rendement attendu diminue à chaque sha successifske. La microglie isolés par cette méthode ont été utilisées avec succès pour étudier la capacité de phagocytose, la fonction, comme la production d&#39;oxyde nitrique, et la toxicité neuronale (Figure 3) 13-14. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble du protocole de préparation de cultures mixtes de cellules gliales et l&#39;isolement de la microglie primaire. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> Figure 2. Isolement de la microglie de haute pureté tel que vérifié par une analyse immunohistochimique utilisant la microglie (Iba-1, rouge), des astrocytes (GFAP, vert), neurone (NeuN, rouge) et des oligodendrocytes (CC1, rouge) des marqueurs spécifiques. La coloration de l&#39;ADN des cellules en culture par DAPI (en bleu) est également indiquée. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> Figure 3. Microglie isolés dans la descri méthodelit ont été utilisées dans un certain nombre de tests, y compris, mais sans s&#39;y limiter, les dosages, les dosages de la fonction de phagocytose et des études de neurotoxicité. Dans ces études, nous avons constaté que la microglie (Iba-1 positive, vert), lorsqu&#39;ils sont exposés à contrôler (A) ou LPS (B) des médias traités, augmenter leur phagocytose de billes de latex marquées par fluorescence (rouge), qui peuvent être quantifiées ( C). En outre, le LPS (1ng/ml) le traitement peut augmenter la production d&#39;oxyde nitrique dans la microglie (D). Enfin, via à la fois transwell insert-séparés ou directs microglie-neurones cultures, nous avons constaté que les microglies incubées avec LPS peuvent induire la mort des cellules neuronales, telle que mesurée par la lactate déshydrogénase (LDH) de libération (E, F).

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain%3A+graded+response%2C+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li>
<li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li>
<li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li>
<li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).</li>
<li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li>
<li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus%3A+immunophenotypic+and+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li>
<li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li>
<li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Alors que ce protocole est régulièrement utilisé pour produire la microglie pur et sain pour les expériences de recherche, un examen attentif des aspects techniques au cours de parties critiques de la procédure permettra de minimiser la variabilité dans la microglie isolée. Tout d&#39;abord, lors de la dissection du tissu cérébral de rats nouveau-nés petits, travaillant en temps opportun est nécessaire pour minimiser les dommages hypoxiques et ischémiques du tissu. Cependant, il est également important d&#39;enlever com...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm boîtes de Pétri </td><td> Fisher marque </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> De Sharp ciseaux de dissection </td><td> Outils belle science </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b pince standard des conseils, des courbes, 11cm </td><td> Outils belle science </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pince standard des conseils, des droites, 11 cm </td><td> Outils belle science </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 50 ml à centrifuger coniques </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 pipettes sérologiques ml </td><td> Grenier Bio One </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 pipettes sérologiques ml </td><td> Grenier Bio One </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 um crépine stérile cellule de nylon </td><td> Faucon </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 flacons de culture tissulaire </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco milieu essentiel minimal (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz milieu L-15 </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Fœtale sérum équin </td><td> Pêcheur </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline-streptomycine </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol à 100% </td><td> La Société Warner Graham </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate solution saline tamponnée, 10X, pH 7,4 </td><td> Qualité biologique, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X dans l&#39;eau distillée stérile </td></tr><tr><td> Sacs de Biohazard </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td> Hausser scientifique </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> Des plaques 6 puits culture cellulaire avec une surface CellBIND </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Les microglies représentent environ 12 % de la population cellulaire totale dans le cerveau des mammifères. Bien que les neurones et les astrocytes soient considérés comme les principaux types cellulaires du système nerveux, les microglies jouent un rôle important dans la physiologie normale du cerveau en surveillant les débris et les agents pathogènes présents dans les tissus et en maintenant l'homéostasie du parenchyme par une activité phagocytaire 1,2. Les microglies sont activées dans diverses conditions de lésion et de maladie, notamment les maladies neurodégénératives, les traumatismes crâniens et les infections du système nerveux 3. Dans ces conditions d'activation, les microglies augmentent leur activité phagocytaire, subissent des changements morphologiques et prolifératifs, et sécrètent activement des espèces réactives de l'oxygène et de l'azote, des chimiokines et des cytokines pro-inflammatoires, activant souvent une boucle paracrine ou autocrine 4-6. Étant donné que ces réponses microgliales contribuent à la pathogenèse des affections neurologiques, des recherches centrées sur les microglies sont justifiées.
	En raison de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau, il est techniquement difficile d'obtenir, lors d'expériences in vivo, une quantité suffisante d'échantillons de microglie avec une haute pureté. Les recherches actuelles sur les fonctions neuroprotectrices et neurotoxiques des microglies nécessitent une méthode technique standardisée permettant de produire de manière reproductible des microglies pures et saines, en quantité suffisante pour l'étude. Nous présentons, sous forme de texte et de vidéo, un protocole d'isolement de microglies primaires pures à partir de cultures mixtes de glie, destiné à diverses applications en aval. Brièvement, cette technique utilise des tissus cérébraux dissociés provenant de ratons néonatals afin de produire des cultures cellulaires gliales mixtes. Une fois les cultures gliales mixtes devenues confluentes, les microglies primaires sont isolées mécaniquement par une courte agitation de la culture. Les microglies sont ensuite mises en culture avec une haute pureté pour des études expérimentales.
	Le principe et le protocole de cette méthode ont été décrits dans la littérature 7,8. Par ailleurs, d'autres méthodes pour isoler les microglies primaires sont bien documentées 9-12. Le tissu cérébral homogénéisé peut être séparé par une centrifugation en gradient de densité afin d'obtenir des microglies primaires 12. Toutefois, cette centrifugation, d'une durée modérée (45 min), peut provoquer des dommages cellulaires et une activation, ainsi qu'une enrichment en microglies et en autres populations cellulaires. Un autre protocole a été utilisé pour isoler des microglies primaires chez divers organismes, par agitation prolongée (16 h) en culture 9-11. Après agitation, le surnageant du milieu est centrifugé pour isoler les microglies. Cette méthode d'isolement en deux étapes, plus longue, peut également perturber la fonction et l'activation des microglies. Nous utilisons principalement le protocole d'isolement des microglies suivant dans notre laboratoire pour plusieurs raisons : (1) les microglies primaires reproduisent la biologie in vivo plus fidèlement que les lignées cellulaires de microglies de rongeurs immortalisées, (2) une perturbation mécanique minimale réduit au minimum les risques de dysfonctionnement ou d'activation cellulaires, et (3) un rendement suffisant peut être obtenu sans passage des cultures mixtes de cellules gliales.
	Il est important de noter que ce protocole utilise des tissus cérébraux de rats nouveau-nés pour isoler les microglies, et que l'utilisation de rats plus âgés pour l'isolement des microglies peut influencer significativement le rendement, l'état d'activation et les propriétés fonctionnelles des microglies isolées. Des données montrent que le vieillissement est associé à un dysfonctionnement des microglies, à une neuroinflammation accrue et à des pathologies neurodégénératives ; c'est pourquoi des études antérieures ont utilisé des microglies adultes ex vivo afin de mieux comprendre le rôle des microglies dans les maladies neurodégénératives où le vieillissement constitue un paramètre important. Toutefois, les microglies ex vivo ne peuvent pas être maintenues en culture pendant de longues périodes. Par conséquent, bien que ce protocole prolonge la survie des microglies primaires en culture, il convient de noter que ces microglies présentent un comportement différent de celui des microglies adultes, et que les études in vitro doivent être soigneusement interprétées lorsqu'elles sont transposées à un contexte in vivo.

Isoler les microglies primaire à partir de l&#39;hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules microgliales<em&gt; In vitro</em&gt; Étude et les applications en aval.

Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Les microglies représentent environ 12 % de la population cellulaire totale du cerveau des mammifères. Alors que les neurones et les astrocytes sont considérés comme les principaux...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des cultures primaires de cellules microgliales à partir de cerveaux de rats néonatals. Cela est réalisé en isolant d'abord le cerveau et en retirant les méninges. La deuxième étape consiste à homogénéiser le cerveau et à ensemencer la culture gliale mixte dans des flacons T75.Ensuite, les flacons sont incubés pendant 10 à 14 jours jusqu'à ce qu'une monocouche d'astrocytes atteigne la confluence. La dernière étape consiste à agiter les flacons afin de libérer les microglies qui se développent au-dessus de la monocouche d'astrocytes, ce qui donne une culture purifiée de microglies. En définitive, des microglies primaires de haute pureté peuvent être utilisées dans des essais ultérieurs de culture cellulaire unique in vitro et de coculture.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la méthode de gradient de Perico, est qu'une perturbation mécanique nominale minimise le dysfonctionnement ou l'activation des microglies, et que des microglies pour des expériences peuvent être obtenues pendant plusieurs semaines après la préparation initiale. Je vais démontrer cette procédure avec Tammy Tero, étudiante diplômée du laboratoire du Dr Clifton Dau guard. Les cultures de microglies de haute pureté obtenues lors de ce protocole peuvent être utilisées dans des expériences in vitro afin d'étudier la fonction des microglies dans des conditions physiologiques normales, ainsi que dans des conditions pathologiques de maladie.Les microglies, leur réactivité aux lésions tissulaires ainsi qu'aux stimuli inflammatoires, ont une incidence directe sur les atteintes neurologiques et les maladies neurodégénératives. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés car elles ne savent pas comment retirer les méninges du tissu cérébral rapidement, afin de réduire la contamination par les fibroblastes dans les cultures primaires de microglies. En outre, il convient de manipuler les cultures de microglies et d'agiter les flacons avec précaution pour ne pas endommager la monocouche d'astrocytes.Pour préparer la procédure, refroidir le milieu Chi Livi à L 15 à quatre degrés Celsius, le préparer dans des boîtes de Pétri de 60 par 15 millimètres contenant le milieu L 15 et les placer sur de la glace. Réchauffer le milieu de culture à 37 degrés Celsius et s'assurer que tous les instruments chirurgicaux ont été stérilisés. Après avoir décapité un raton âgé de P un à P cinq à l’aide de ciseaux bien aiguisés, plonger la tête dans de l’éthanol à 70 %.Après avoir prélevé les têtes de cinq ratons, transférez les têtes dans une solution saline. Retirez l'ensemble du cerveau de chaque tête en effectuant soigneusement des incisions de chaque côté du crâne au-dessus des oreilles, puis en extrayant le cerveau et en le plaçant dans l'une des boîtes de Pétri contenant le milieu L 15 sur de la glace. Une fois que les cinq premiers cerveaux ont été transférés dans le milieu L 15 sur glace, les cinq ratons suivants peuvent être traités de la même manière, une fois que tous les cerveaux ont été collectés.Retirer les méninges en pinçant doucement un bord de la feuille méningée avec une pince et en la détachant soigneusement du cortex sous-jacent. Il est essentiel d'éliminer complètement les méninges et de le faire aussi rapidement que possible. Après le retrait des méninges, transférer chacun des cerveaux dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du milieu L 15 placée sur de la glace.Utilisez une pipette de 10 millilitres pour aspirer le tissu cérébral et le milieu de la plaque vers un tube conique stérile de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez à 2 500 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, aspirez.Ensuite, utilisez une pipette stérile de 10 millilitres pour prélever le surnageant. Suspendez le culot dans quatre à cinq millilitres de milieu L 15 frais, puis aspirez et expulsez le milieu et le tissu 10 fois à l’aide de la pipette. Placez ensuite un filtre cellulaire de 100 microns sur un nouveau tube conique de 50 millilitres.Utilisez une pipette stérile de cinq millilitres pour aspirer et expulser la suspension tissulaire plusieurs fois, puis, après avoir rincé la pipette dans le filtre cellulaire, versez le matériel à travers le filtre cellulaire dans le tube conique. Rincez le filtre avec quatre à cinq millilitres de milieu L 15 frais refroidi. Ensuite, centrifugez à 2 500 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Pour chaque cerveau de raton traité, préparer un flacon stérile de 75 cm² en ajoutant 12 millilitres de milieu de culture préchauffé dans chaque flacon. Ensuite, après avoir aspiré le surnageant des cellules en culot, ajouter cinq à six millilitres de milieu de culture au culot cellulaire, puis pipeter 10 fois de haut en bas avec une pipette de 10 millilitres. Puis transférer un volume égal de suspension cellulaire dans chaque flacon T 75.Incuber les flacons dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une à trois semaines, en laissant les cellules au repos sans perturbation pendant les cinq premiers jours suivant le semis initial. Après cinq jours, remplacer le milieu conditionné de chaque flacon par 12 millilitres de milieu frais afin d'atteindre la confluence. Cette opération doit être effectuée avec une grande précaution sans toucher le fond du flacon où les cellules sont attachées.Une fois que les cultures mixtes de cellules gliales sont complètement confluentes, retirez le flacon de l’incubateur. Recouvrez les bouchons des flacons avec du parafilm pour empêcher les échanges gazeux avec l’air ambiant et placez les flacons dans un incubateur rotatif réglé à 100 RPS et 37 degrés Celsius pendant une heure. Une fois l’heure écoulée, utilisez une pipette de 10 millilitres pour recueillir le milieu des flacons sans perturber la couche d’astrocytes, puis versez-le dans des tubes coniques de 50 millilitres. Ajoutez du milieu frais aux flacons et remettez-les dans l’incubateur.Après centrifugation des tubes à 2 500 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans un millilitre de milieu de mise en culture des microglies. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un cytomètre humain et selon les procédures standard. Une fois le nombre de cellules déterminé, ajoutez un volume approprié de milieu de mise en culture des microglies pour obtenir une concentration cellulaire adéquate.Une concentration de deux fois 10 puissance cinq cellules par millilitre de plaque est appropriée pour l'expérience ; remettre ensuite au laboratoire de culture. Laisser les microglies s'attacher toute la nuit. Les cellules ont été immunomarquées à l'aide d'un anticorps spécifique de IBA1, un marqueur microglial, qui apparaît en rouge.La contamination de la culture par des cellules neuronales est minimale, comme le montre cette image microscopique de coloration immunohistochimique réalisée à l'aide d'un anticorps dirigé contre un nouveau marqueur neuronal NA, apparaissant en rouge. La lame a été contre-colorée avec du DPI afin de colorer en bleu tous les noyaux cellulaires. Cette image montre une immunomarquage avec GFAP, un marqueur des astrocytes.Les astrocytes apparaissent en vert. Ici, nous observons une image de la culture de microglie immunomarquée avec un anticorps spécifique de CC un, un marqueur des oligodendrocytes. Les oligodendrocytes apparaissent en rouge.Cet histogramme montre les résultats de la quantification de chaque type cellulaire. On peut observer que les cultures de microglies ensemencées sont pures à plus de 90 %. Cette image de microscope à fluorescence montre une culture de microglies qui a été immunomarquée pour IBA1.Les zones rouges sont des billes de latex marquées par fluorescence. La culture de microglie présentée ici a été traitée avec un nanogramme par millilitre de lipopolysaccharide, et on observe que les cellules microgliales ont phagocyté les billes de latex marquées par fluorescence. Ici, les résultats du test de phagocytose sont présentés sous forme d'histogramme.Une phagocytose accrue est observée après un traitement par le LPS. Cette figure montre que la production d'oxyde nitrique augmente également dans les cultures de microglies après l'ajout de LPS. Enfin, les cultures neuronales de microglies, qu'elles soient directes ou séparées par un insert de type transwell, sont sensibles à une augmentation de la mort cellulaire après incubation avec le LPS, mesurée par la libération de lactate déshydrogénase. Une fois maîtrisée la première partie de cette technique, jusqu’au passage en flacons T 75, celle-ci peut être réalisée en une heure et demie, et l’ensemble de la procédure peut être accompli en deux semaines.Une autre considération lors de l'optimisation de ce protocole consiste à déterminer la durée pendant laquelle les cultures gliales mixtes doivent être maintenues avant l'isolement des microglies primaires pour la mise en culture, après l'obtention de cultures de haute pureté. À l'aide de cette procédure, la fonction des microglies peut être évaluée in vitro par la mesure de la production d'oxyde nitrique, de la libération de cytokines et de chimioquines, ainsi que de l'activité phasique, toutes pouvant être déterminées et mesurées à l'aide de tests de laboratoire courants.Ainsi, grâce au développement de cette procédure, les chercheurs dans le domaine des neurosciences disposent de la capacité d'explorer l'activité des microglies dans un environnement cellulaire homogène et d'étudier leurs rôles dans diverses conditions neurologiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des cultures primaires de cellules microgliales à partir de cerveaux de rats néonatals. En isolant d'abord le cerveau et en retirant les méninges, puis en homogénéisant le cerveau et en ensemencant dans des flacons, ceux-ci sont ensuite incubés pendant 10 à 14 jours jusqu'à ce qu'une monocouche d'astrocytes atteigne la confluence.La dernière étape consiste à agiter les flacons afin de libérer les microglies qui se développent au-dessus de la monocouche d'astrocytes, ce qui donne une culture purifiée de microglies.

primary-microglia-isolation-from-mixed-glial-cell-cultures-neonatal

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une méthode d’isolement et de culture de microglie à partir de cerveaux de rats. Il s’agit de séparer la microglie d’autres cellules neuronales et non neuronales à l’aide de plaques recouvertes d’un anticorps monoclonal spécifique de la microglie.

Isolement et culture de la microglie à partir de cerveaux de rats à l’aide de milieux sans sérum

La vidéo a démontré la méthode d’isolement et de culture de cellules à partir du cerveau d’une souris néonatale. Il impliquait une dissociation enzymatique et mécanique du cerveau, suivie d’une culture dans un milieu de croissance dépourvu de facteur de croissance neuronale pour obtenir une population gliale mixte.

Obtention d’une culture mixte de cellules gliales à partir d’un cerveau de souris néonatale

Nous présentons des méthodes pour l'isolement / culture efficace et rapide de la microglie viable du cortex cérébral néonatal et la moelle épinière adulte. La dissection et le placage de la microglie corticale peuvent être accomplies dans les 90 minutes, avec la récolte des microglies subséquente aura lieu ~ 10 jours suivant la dissection initiale.

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Efforts pour comprendre en détail le fonctionnement du microgliales ont été entravées par le manque de modèles de culture microgliales qui récapitule les propriétés des matures in vivo de cellules microgliales. Ce protocole décrit une démarche d’isolement et de la culture visant à maintenir la survie robuste des microglies rat mature très ramifié dans des conditions définies et moyen.

Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement in vitro de plusieurs populations de cellules gliales à partir d’un SNC de souris. Cette méthode permet la ségrégation de la microglie régionale, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des astrocytes pour étudier les phénotypes de chacun dans une variété de systèmes de culture.

Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.

Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.

Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires

Ce protocole décrit une co-culture microgliale-neuronale établie à partir de cellules neuronales primaires isolées d’embryons de souris aux jours embryonnaires 15-16 et de microglie primaire générée à partir du cerveau de souris néonatales aux jours postnatals 1er-2.

Génération et co-culture de microglie primaire murine et de neurones corticaux

Apprenez à isoler des microglies primaires à partir de cerveaux de rats nouveau-nés par culture gliale mixte et agitation mécanique. Cette méthode offre une haute pureté cellulaire pour étudier les fonctions microgliales in vitro.

Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Explorer plus de vidéos