Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Isoler les microglies primaire à partir de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules microgliales

L’objectif global de cette procédure est de préparer des cultures primaires de cellules microgliales à partir de cerveaux de rats nouveau-nés. Ceci est accompli en isolant d’abord le cerveau et en enlevant les méninges. La deuxième étape consiste à homogénéiser le cerveau et à le placer en culture gliale mixte dans des flacons T 75.

Ensuite, les flacons sont incubés pendant 10 à 14 jours jusqu’à ce qu’une monocouche d’astrocytes ait atteint la confluence. La dernière étape consiste à secouer les flacons pour libérer les microglies qui se développent au-dessus de la monocouche d’astrocytes, ce qui donne une culture purifiée de la microglie. En fin de compte, la microglie primaire de haute pureté peut être utilisée dans des essais ultérieurs de culture et de co-culture de cellules uniques in vitro.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la méthode du gradient Perico est que la perturbation mécanique nominale minimise le dysfonctionnement ou l’activation des microglies, et que les microglies pour les expériences peuvent être générées pendant des semaines après la préparation initiale. Je ferai une démonstration de cette procédure avec Tammy Tero, une étudiante diplômée du laboratoire du Dr Clifton Dau. Les cultures de microglie de haute pureté obtenues au cours de ce protocole peuvent être utilisées dans des expériences in vitro pour étudier la fonction de la microglie dans des conditions physiologiques normales, ainsi que dans des conditions pathologiques.

La microglie, la réactivité aux lésions tissulaires, ainsi que les stimuli inflammatoires ont un rapport direct avec les lésions neurologiques et les maladies neurodégénératives. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés parce qu’elles ne savent pas comment enlever les méninges du tissu cérébral en temps opportun afin de réduire la contamination par les fibroblastes dans les cultures de microglie primaire. De plus, il faut veiller à ne pas endommager la monocouche d’astrocytes lors de l’agitation des flacons et de la manipulation des cultures de microglies.

Pour se préparer à la procédure, Chi Livi est L 15 media à quatre degrés Celsius, prêt pour des boîtes de Pétri de 60 x 15 millimètres contenant L 15 media et placé sur de la glace. Réchauffez le milieu de culture à 37 degrés Celsius et assurez-vous que tous les outils chirurgicaux ont été stérilisés. Après avoir décapité un ratillon P un à P cinq avec des ciseaux tranchants, plongez la tête dans de l’éthanol à 70 %.

Une fois que les têtes de cinq ratillons ont été collectées, transférez les têtes dans une solution saline. Retirez tout le cerveau de chaque tête en faisant soigneusement des incisions des deux côtés du crâne au-dessus des oreilles, et en tirant le cerveau vers l’extérieur et dans l’un des problèmes de Petri contenant du milieu L 15 sur de la glace. Une fois que les cinq premiers cerveaux ont été transférés à L 15 sur la glace, les cinq petits suivants peuvent être traités de la même manière lorsque tous les cerveaux ont été collectés.

Retirez les méninges en saisissant doucement un bord de la feuille méningée à l’aide d’une pince et en la décollant soigneusement du cortex sous-jacent. Il est essentiel d’enlever soigneusement les méninges et de le faire le plus rapidement possible. Après avoir retiré les méninges, transférez chacun des cerveaux dans une boîte de Pétri fraîche de L 15 moyen sur de la glace.

À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, aspirez le tissu cérébral et le milieu de la plaque dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Ensuite, centrifuger à 2 500 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation par aspiration.

Le supinate utilise ensuite une pipette stérile de 10 millilitres pour Reese. Mettez la pastille en suspension dans quatre à cinq millilitres de milieu frais L 15, pipetez le milieu et le tissu de haut en bas 10 fois. Ensuite, placez une passoire de cellules interstitielles de 100 microns sur un tube conique frais de 50 millilitres.

Utilisez une pipette stérile de cinq millilitres pour pipeter la suspension tissulaire de haut en bas, puis avec la pipette rincée dans la crépine cellulaire, distribuez le matériau à travers la crépine cellulaire dans le tube conique. Rincez la passoire avec quatre à cinq millilitres de milieu L 15 frais et réfrigéré. Ensuite, centrifugez votre RCF de 2 500 pendant cinq minutes de quatre degrés Celsius.

Pour chaque cerveau de ratier traité, préparez une fiole T 75 stérile en ajoutant 12 millilitres de milieu de culture d’avant-guerre dans chaque fiole. Ensuite, après avoir aspiré le supnatant des cellules granulées, ajoutez cinq à six millilitres de milieu de culture dans la pastille cellulaire, pipetez 10 fois de haut en bas avec une pipette de 10 millilitres. Transférez ensuite un volume égal de suspension cellulaire dans chaque fiole T 75.

Incuber les flacons dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une à trois semaines, en laissant les cellules reposer sans être dérangées pendant les cinq premiers jours suivant le placage initial. Après cinq jours, remplacez le milieu conditionné dans chaque flacon par 12 millilitres de milieu frais pour obtenir la confluence. Cela doit être fait très soigneusement sans toucher le fond du ballon où les cellules se fixent.

Une fois que les cultures gliales mixtes sont complètement en confluence, retirer le ballon de l’incubateur. Couvrez les bouchons du ballon avec un param pour empêcher l’échange gazeux avec l’air ambiant et placez les flacons dans un incubateur à agitation réglé à 100 RPS et 37 degrés Celsius pendant une heure après l’heure écoulée, utilisez une pipette de 10 millilitres pour recueillir le milieu des flacons sans perturber la couche d’astrocytes et distribuez dans des tubes coniques de 50 millilitres. Ajoutez du milieu frais dans les flacons et remettez-les dans l’incubateur.

Après avoir centrifugé les tubes à 2 500 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, aspirez le supinate et mettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de placage microglial. Comptez ensuite les cellules à l’aide d’un cytomètre humain et de procédures standard. Une fois que le nombre de cellules a été déterminé, ajoutez un volume approprié de milieu de placage microglial pour obtenir une cellule.

Une concentration de deux fois 10 pour cinq cellules par plaque d’un millilitre est appropriée pour l’expérience et le retour dans l’incubateur. Pour permettre à la microglie de se fixer pendant la nuit. Les cellules ont été immunomarquées avec un anticorps spécifique de l’IBA, un marqueur microglial, qui apparaît en rouge.

La contamination de la culture par des cellules neuronales est minime, comme le démontre cette image au microscope de l’immunocoloration à l’aide d’un anticorps pour le nouveau marqueur neuronal NA, qui apparaît en rouge. La lame a été colorée avec du DPI pour colorer tous les noyaux cellulaires en bleu. Cette image montre une immunocoloration avec GFAP et marqueur astrocytaire.

Les astrocytes apparaissent verts. Ici, nous voyons une image de la culture microgliale immuno-colorée avec un anticorps spécifique pour CC, un marqueur oligodendrocytaire. Les oligodendrocytes apparaissent rouges.

Cet histogramme montre les résultats de la quantification de chaque type de cellule. On peut voir que les cultures microgliales plaquées sont pures à plus de 90 %. Cette image au microscope à fluorescence montre une culture microgliale qui a été immuno-colorée pour IBA.

Les zones rouges sont des billes de latex marquées par fluorescence. La culture microgliale montrée ici a été traitée avec un nanogramme par millilitre de lipo polysaccharide, et on peut voir que les cellules microgliales ont une phagocytose des billes de latex marquées par fluorescence. Ici, les résultats du test de phagocytose sont affichés dans un histogramme.

Une augmentation de la phagocytose est observée après un traitement par LPS. Cette figure montre que la production d’oxyde nitrique augmente également dans les cultures microgliales après l’ajout de LPS. Enfin, les cultures de neurones microgliaux séparés par insertion directe ou transwell sont susceptibles d’augmenter la mort cellulaire après l’incubation avec le LPS, mesurée par la libération de lactate déshydrogénase. Une fois maîtrisé la première partie de cette technique, jusqu’à l’ensemencement en T 75, les flacons peuvent être faits en une heure et demie, et la procédure complète peut être effectuée en deux semaines.

Une autre considération lors de l’optimisation de ce protocole est de déterminer la durée du temps. Des cultures gliales mixtes doivent être maintenues avant d’isoler la microglie primaire pour le placage Après l’établissement de cultures de haute pureté. À l’aide de cette procédure, la fonction microgliale peut être évaluée, la mesure in vitro de la production d’oxyde nitrique, la libération de cytokines et de chimiokines, ainsi que l’activité phasique, peut être déterminée et mesurée à l’aide d’essais de laboratoire de routine.

Ainsi, avec le développement de cette procédure, les chercheurs dans le domaine des neurosciences ont la capacité d’explorer l’activité microgliale dans un environnement cellulaire homogène et d’étudier leurs rôles dans diverses conditions neurologiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des cultures de cellules microgliales primaires à partir de cerveaux de rats nouveau-nés. En isolant d’abord le cerveau et en enlevant les méninges, puis en homogénéisant le cerveau et en le plaquant dans des flacons, les flacons sont incubés pendant 10 à 14 jours jusqu’à ce qu’une monocouche d’astrocytes ait atteint la confluence.

La dernière étape consiste à secouer les flacons pour libérer les microglies qui se développent au-dessus de la monocouche d’astrocytes, ce qui permet d’obtenir une culture purifiée de la microglie.