À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l'aide automatisée In situ Hybridation

L’objectif général de cette procédure est de cartographier les sondes d’ADN sur les chromosomes polytaniques des moustiques à l’aide d’une préparation chromosomique à haute pression, suivie d’une hybridation fluorescente automatisée en C deux et d’une imagerie automatisée. Ceci est accompli en préparant d’abord les étalements des chromosomes polytaniques à l’aide d’une méthode à haute pression. L’étape suivante de la procédure consiste à préparer des sondes fluorescentes en marquant l’ADN génomique avec le fluorochrome à l’aide d’un protocole de traduction Nick.

La troisième étape consiste à réaliser une hybridation fluorescente en C deux à l’aide de systèmes automatisés de coloration sur lames. La dernière étape consiste à scanner et à photographier les chromosomes marqués à l’aide d’un système d’imagerie fluorescente automatique. En fin de compte, les images peuvent montrer la localisation d’une sonde d’ADN marquée par fluorescence sur le chromosome poly.

Le principal avantage de cette technique ou des méthodes existantes, comme un protocole d’hybridation in situ manuel standard, est que le protocole de cartographie physique à haut débit produit des résultats plus cohérents et réduit considérablement le temps de manipulation. Ce protocole commence par la dissection de femelles à demi-gravité et oly environ 25 heures après l’alimentation sanguine pour recueillir leurs ovaires lorsqu’elles sont au stade trois de Christopher. À ce stade, la zone transparente avec des cellules nourricières à l’intérieur des follicules doit avoir une forme ronde, recueillir les ovaires de cinq femelles et les fixer dans 500 microlitres de solution de bruit de voiture modifiée fraîchement préparée.

Ils peuvent ensuite être conservés à température ambiante jusqu’à 24 heures ou plus longtemps à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, juste avant de faire des lames de dissection ovarienne, préparez une solution de bruit de voiture et 50 % d’acide propionique. Placez chaque paire d’ovaires dans une goutte de solution fraîche contre le bruit de voiture sur une lame exempte de poussière sous un microscope de dissection.

Fendez les ovaires avec l’aiguille de dissection. Transférez tous les morceaux d’ovaire sur six lames propres avec de l’acide propionique à 50 %. Séparez les follicules les uns des autres à l’aide d’aiguilles de dissection.

Essuyez ensuite tous les mouchoirs restants avec une serviette en papier. Ajoutez une autre goutte d’acide proponique à 50 % et attendez trois à cinq minutes. La légende veut que les follicules restent dans 50 % d’acide proponique pendant trois à cinq minutes, ce qui améliore considérablement la propagation des chromosomes.

Ensuite, appliquez une lamelle et attendez encore une minute pour étaler les noyaux. Enveloppez la diapositive avec du papier filtre et du plastique. Réglez un Dremel entre trois et 5 000 tr/min et, pendant environ une minute, faites légèrement tourner une pointe Dremel contre le couvercle.

Confirmez la qualité de l’étalement à l’aide d’un microscope de phase et appliquez le dremel plus longtemps si nécessaire, pour aplatir les chromosomes. Placez une deuxième lamelle adjacente à la première, puis prenez les lamelles en sandwich avec un autre microscope. Faites glisser ensuite, enveloppez les diapositives avec une feuille de plastique et avec du papier filtre, placez les lames d’emballage dans un étau pour presser les diapositives entre 85 et 120 pouces livres.

Après avoir aplati les chromosomes sur les six lames, déballez les lames et retirez les lames supplémentaires pour aplatir davantage les chromosomes. Incuber les lames à 55 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes dans un système d’hybridation par dénaturation de lame. Ensuite, trempez une lame dans de l’azote liquide pendant au moins 15 secondes ou jusqu’à ce que le bouillonnement ait cessé.

Retirez ensuite rapidement la lamelle à l’aide d’une lame de rasoir et placez immédiatement la glissière dans du froid, à 50 % d’éthanol, pendant cinq minutes. Répétez ce processus pour chaque diapositive de manière séquentielle. Déshydratez les lames dans un bain à 70 %, 90 % et 100 % éthanol.

Immergez-les dans chaque bain pendant cinq minutes. Enfin, une fois que les lames ont séché à l’air, elles sont prêtes pour les poissons à colorer. Un dispositif automatisé effectue la plupart des étapes de la procédure, à l’exception de l’étiquetage de la sonde.

Donc, avant de charger l’appareil, préparez la sonde fluorescente en marquant l’ADN avec le fluorochrome à l’aide d’un protocole de traduction NIC commercial avec la sonde préparée, chargez les lames et les réactifs dans les lames automatisées. Système de coloration et programmez le système pour effectuer les étapes suivantes. Tout d’abord, fournissez 800 microlitres d’un XPBS pendant 20 minutes.

Deuxièmement, séchez les lames au sèche-cheveux. Troisièmement, fixez les lames avec 450 microlitres de formol à 4 % dans un XPBS pendant une minute. Lavez ensuite les lames avec de l’éthanol à 100 % pendant une seconde, deux fois et pendant deux minutes.

Une fois après le bain d’éthanol, séchez à nouveau les lames. Chauffez maintenant les lames à 45 degrés Celsius pendant deux minutes pour éviter les bulles. Appliquez ensuite 20 microlitres de la sonde d’ADN, suivis d’une goutte d’huile minérale et d’une lamelle suivante dans la nature, les chromosomes à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, réglez les lames pour qu’elles s’hybrident à 42 degrés Celsius pendant 14 heures. Après le réglage de l’hybridation, la rigueur se lave pendant deux minutes à 42 degrés Celsius, suivie de quatre applications consécutives d’une seconde de deux XSSC et d’un séchage. Appliquez ensuite deux fois 800 microlitres de 0,4 XSSC à 42 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis un autre lavage et deux XSSC à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Appliquez maintenant la tache 50 microlitres de yo-yo un suivi d’huile minérale et de lamelles. Incuber les lames à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez ensuite les caillus.

Lavez les lames en deux XSSC quatre fois pendant une seconde par lavage et séchez-les par soufflage. Enfin, appliquez 15 microlitres de réactif anti-décoloration doré prolongé sur chaque lame et fixez de nouveaux lamelles. Mettez sous tension le système de balayage automatisé Accord plus, en commençant par l’alimentation U-R-F-L-T d’Olympus pour une ampoule halogène.

Puis l’ordinateur, et enfin le microscope avec un appareil photo. Ouvrez d’abord le progiciel duo, configurez un pré-scan 10 fois. Cliquez sur le bouton en ligne, entrez un nouvel ID de cas et attribuez un ID de diapositive.

Cliquez sur le point intitulé bf. Il s’agit de l’option en fond clair. Sélectionnez un choix de numérisation à 10 x pré-numérisation.

Sélectionnez 2, 500 x cercle, 10 000 x cercle ou rectangle. Cliquez sur définir et exécuter. Ensuite, suivez les instructions pour ajuster correctement la numérisation, puis cliquez sur Terminer.

Pour démarrer l’analyse, appuyez sur l’onglet principal pour revenir à l’écran principal. Cliquez maintenant sur le bouton hors ligne, recherchez l’ID de cas et l’ID de diapositive qui ont été attribués. Et cliquez sur hors connexion.

Numérisez dans la boîte noire en haut à gauche. Cliquez sur une flèche et sélectionnez 10 x pré-balayage. Utilisez les flèches pour parcourir les images numérisées après avoir trouvé une image d’intérêt.

Double-cliquez sur l’écran au milieu de la zone ciblée et appuyez sur Snap. Cela ciblera une image à capturer plus tard après avoir sélectionné toutes les cibles. Faites un clic droit sur chaque image, cliquez sur classifier, sélectionnez 10 x pré-balayage et sélectionnez polytan.

Revenez au menu principal et configurez le pré-balayage 40x. Sélectionnez à nouveau en ligne et sélectionnez une diapositive. Changez BF en ffl et changez le nom de la tâche pour revoir dash X 40 dash rg.

Modifiez la section juste en dessous du dernier paramètre pour revoir le tiret tout. Exécutez ensuite le programme et suivez les instructions. Pour configurer l’automatisation, cliquez sur le bouton Démarrer la correspondance des vues pour faire correspondre les images 10 x et 40 x.

Cliquez sur Terminer pour démarrer l’analyse. Une fois cela fait, cliquez sur classifier et regardez les images. Des préparations de chromosomes polytaniques de cellules nourricières ovariennes à partir de l’anomalie féminine Gambie ont été réalisées à l’aide de la technique à haute pression.

Cette méthode n’endommage ni ne modifie la majeure partie de la structure chromosomique. Il aplatit les chromosomes pliés et révèle ainsi de fines bandes cachées que l’on ne voit pas sur les préparations régulières. Le chromosome a été sondé avec des clones d’ADN arrière obtenus à partir de l’anomalie S Gambia et Tam back library.

La bibliothèque a été générée à partir d’un mâle et d’une femelle d’abord dans la larve étoilée de la souche nuisible anomalie S Gambie. À la suite de cette procédure, une cartographie physique automatisée à haut débit peut être effectuée afin de faciliter le développement rapide d’assemblages génomiques basés sur les chromosomes.