Name: À haut débit de cartographie physique des chromosomes à laide automatisée In situ Hybridation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez une méthode de cartographie chromosomique à haut débit utilisant l'hybridation in situ automatisée sur chromosomes polytènes de moustiques. Cette technique améliore l'efficacité et la cohérence des analyses génomiques.

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Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health 1R21AI094289 attribuée à Igor V. Sharakhov. Le système automatisé de coloration de lames Xmatrx et le système automatisé de numérisation ACCORD PLUS ont été achetés grâce au programme du Fonds de crédit-bail pour équipements, du Fralin Life Science Institute, du Département d'entomologie et du Département de biochimie de Virginia Tech.

1. Préparation de chromosomes polyténiques sous haute pression à partir de cellules nourricières ovariennes
<ol>
	<li>Disséquer des femelles Anopheles demi-gestantes 25 heures après l’alimentation en sang sous un microscope stéréoscopique et fixer les ovaires dans une solution de Carnoy modifiée fraîche avec du méthanol (méthanol 100 % : acide acétique glacial, 3:1). À ce stade, les ovaires se trouvent au stade III de Christophers, où les follicules ont une forme ovale et une zone transparente contenant les cellules-nourrices à l’intérieur des follicules présente une forme ronde13. Placer les ovaires d’environ cinq femelles dans 500 μl de solution de Carnoy modifiée dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et les conserver à température ambiante pendant 24 heures. Transférer les ovaires à -20 °C pour un stockage à long terme.</li>
	<li>Préparer la solution de Carnoy modifiée avec de l’éthanol (éthanol 100 % : acide acétique glacial, 3:1) et de l’acide propionique à 50 % juste avant la préparation des lames. Placer une paire d’ovaires sur une lame propre, sans poussière, dans une goutte de solution de Carnoy modifiée. Diviser les ovaires en environ six sections à l’aide d’aiguilles de dissection et les placer dans des gouttes d’acide propionique à 50 % sur des lames propres sous un microscope stéréoscopique Leica MZ6. Utiliser une lame distincte pour chaque section.</li>
	<li>Séparer les follicules à l’aide d’aiguilles de dissection et essuyer les tissus résiduels avec du papier filtre ou du papier absorbant sous un microscope stéréoscopique. Ajouter une nouvelle goutte d’acide propionique à 50 % sur les follicules et laisser agir pendant 3 à 5 minutes à température ambiante. Poser une lamelle sur la goutte d’acide propionique à 50 %. Laisser reposer la lame environ 1 minute.</li>
	<li>Envelopper la lame dans du papier filtre et du plastique. À l’aide d’un outil rotatif Dremel 200 équipé d’un flexible et d’une pointe en plastique souple réglée entre 3000 et 5000 tr/min, écraser les follicules en effectuant des mouvements circulaires tout en appuyant légèrement sur la lamelle afin d’étaler uniformément les noyaux. Cette étape doit durer environ 1 minute. Vérifier la qualité de l’étalement à l’aide d’un microscope à contraste de phase Olympus CX41 avec un objectif 20x.</li>
	<li>Constituer un sandwich en plaçant une lamelle supplémentaire à côté de celle qui recouvre les chromosomes, puis recouvrir le tout d’une seconde lame de microscope. Cette étape réduit le risque d’écrasement de la lame dans l’étau. Envelopper l’ensemble avec une feuille plastique provenant des boîtes à lames ainsi qu’avec du papier filtre afin de maintenir le sandwich en place et de protéger la lame contre les rayures dues à l’étau.</li>
	<li>Appliquer une pression sur les lames à l’aide d’un étau mécanique. Une pression de 85 à 120 pouces-livres est suffisante et s’obtient à l’aide d’une clé dynamométrique. Cette étape est nécessaire pour aplatir les chromosomes au maximum.</li>
	<li>Retirer la seconde lame de microscope et la lamelle supplémentaire. Chauffer la lame munie de la lamelle recouvrant les chromosomes à 55 °C sur un système de dénaturation/hybridation pour lames pendant 10 à 15 minutes afin d’aplatir davantage les chromosomes. Plonger la lame dans de l’azote liquide pendant au moins 15 secondes, puis, lorsque les bulles cessent, retirer rapidement la lamelle à l’aide d’une lame de rasoir. Placer immédiatement les lames dans de l’éthanol à 50 % froid pendant 5 minutes. Déshydrater les lames dans de l’éthanol à 70 %, 90 % et 100 % pendant 5 minutes chacun. Laisser sécher les lames à l’air.</li>
</ol>
2. FISH à l'aide d'un système automatisé de coloration de lames
Le programme est configuré avec le système automatisé de coloration de lames Xmatrx pour exécuter les étapes suivantes, à l'exception du marquage de la sonde. Le protocole détaillé de marquage par traduction entaille est décrit dans la documentation fournie avec la DNA polymérase de Fermentas.
<ol>
	<li>Avant la FISH, préparez des sondes fluorescentes en marquant de l'ADN génomique BAC avec un fluorochrome en utilisant un protocole de traduction par entaille. Mélangez 1 μg d'ADN, 0,05 mM chacun des dATP, dCTP et dGTP non marqués et 0,015 mM de dTTP, 1 μl de dUTP marqué au Cy3 ou au Cy5, 0,05 mg/ml de BSA, 5 μl de tampon 10x pour la traduction par entaille, 20 unités de polymérase I de l'ADN, 0,0012 unité de DNase I et de l'eau sans nuclease jusqu'à un volume total de 25 μl. Le rapport entre la polymérase I de l'ADN et la DNase I est choisi empiriquement afin d'obtenir des sondes dont la taille varie entre 300 et 500 pb. Incubez le mélange à 15 °C pendant 1 heure.</li>
	<li>Placez les lames et les réactifs dans le système automatisé de coloration Xmatrx et démarrez le programme pour exécuter les étapes suivantes. Appliquez 800 μl de PBS 1x pendant 20 min. Soufflez les lames à l'air. Effectuez une fixation au formol en appliquant 450 μl de formol à 4 % dans du PBS 1x pendant 1 min, suivie de lavages avec de l'éthanol à 100 % pendant 1 seconde, deux fois, puis pendant 2 min une fois. Soufflez les lames à l'air.</li>
	<li>Chauffez les lames à 45 °C pendant 2 min afin d'éviter la formation de bulles lors de l'application des sondes. Appliquez 20 μl des sondes d'ADN, ajoutez des gouttes d'huile minérale pour éviter l'évaporation de la solution d'hybridation, puis placez une lame couvre-objet par-dessus. Dénaturez les chromosomes et les sondes d'ADN en chauffant les lames à 90 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Pour l'hybridation, incubez les lames à 42 °C pendant 14 heures avec les lames couvre-objets en place. La solution d'hybridation est composée de 2x SSC, 100 mM de phosphate de sodium, 1x solution de Denhardt, 100 μg/ml d'azoture de sodium et 10 % de sulfate de dextrane dans du formamide.</li>
	<li>Pour les lavages de stringence, chauffez les lames à 42 °C pendant 2 min, retirez les lames couvre-objets, puis lavez les lames dans du SSC 2x pendant 1 seconde, quatre fois. Soufflez les lames à l'air. Appliquez 800 μl de SSC 0,4x à 42 °C pendant 10 min, deux fois. Lavez les lames dans du SSC 2x à 25 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Réalisez la coloration des chromosomes en appliquant 50 μl de YOYO-1 à 1 μM dans du PBS 1x. Ajoutez des gouttes d'huile minérale pour éviter l'évaporation de la solution de coloration, placez des lames couvre-objets et incubez à 25 °C pendant 10 min. Retirez les lames couvre-objets, lavez les lames dans du SSC 2x pendant 1 seconde, quatre fois. Soufflez les lames à l'air. Appliquez 15 μl de réactif antifade ProLong Gold. Placez des lames couvre-objets.</li>
</ol>
3. Lecture des lames à l'aide d'un système d'imagerie fluorescente automatique
Cette section décrit l'utilisation du logiciel Duet, fourni de série avec le système de numérisation automatisé ACCORD PLUS. Les instructions commencent après avoir allumé les appareils dans l'ordre suivant : l'alimentation Olympus U-RFL-T pour une ampoule halogène, l'ordinateur Dell precision T3500, le microscope Olympus BX61 équipé d'une caméra Olympus U-CMAD3.
<ol>
	<li>Pour configurer le pré-numérisage à 10x, ouvrez le logiciel Duet dans le système de numérisation automatisé ACCORD PLUS. Cliquez sur le bouton « Online ». Saisissez un nouvel identifiant de cas et attribuez un identifiant de lame. Cliquez sur le point intitulé « BF », qui correspond à l’option en champ clair. Sélectionnez « 10x Prescan » comme option de numérisation. Choisissez « 2500x circle », « 10000x circle » ou « rectangle ». Cliquez sur « Set&amp;run » pour lancer le pré-numérisage à 10x.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton « OK » pour exécuter le pré-numérisage à 10x. Suivez les instructions à l’écran pour ajuster correctement la numérisation. Cliquez sur « Finish » pour démarrer la numérisation. Appuyez sur l’onglet « Main » pour revenir à l’écran principal. Cliquez sur le bouton « Offline ». Recherchez l’identifiant de cas et l’identifiant de lame attribués, puis cliquez sur « Offline Scan ». Dans la zone noire située en haut à gauche, cliquez sur une flèche et sélectionnez « 10x Prescan ». À l’aide des flèches (&lt; || Δ &gt;, également appelées boutons « back », « pause », « play », « forward »), parcourez les images numérisées.</li>
	<li>Une fois l’image d’intérêt trouvée, double-cliquez au centre de la région cible à l’écran, puis appuyez sur « Snap ». Cette action marque l’image pour une capture ultérieure. Après avoir sélectionné toutes les cibles, cliquez sur « Classify ». Sélectionnez « 10x Prescan ». Faites un clic droit sur une image pour pouvoir la classer. Choisissez « Polytene ».</li>
	<li>Configurez le pré-numérisage à 40x dans le logiciel Duet. Cliquez sur « Main » pour revenir au menu principal. Sélectionnez de nouveau « Online ». Choisissez une lame. Remplacez « BF » par « FL ». Modifiez le nom de la tâche en « Revisit-X40-RG ». Changez la section située juste en dessous du dernier paramètre en « Revisit-ALL ». Cliquez sur « Set&amp;Run ». Appuyez sur « OK ». Suivez à nouveau les instructions pour configurer l’automatisation. Cliquez sur le bouton « Start matching views » pour apparier les images à 10x et à 40x. Cliquez sur « Finish » pour démarrer la numérisation. Une fois terminé, cliquez sur « Classify » et examinez les images.</li>
</ol>
4. Résultats représentatifs
Figure 1 illustre schématiquement le protocole de préparation des chromosomes sous haute pression. Cette étape comprend l'écrasement et l'aplatissement des chromosomes à l'aide d'un outil Dremel et d'un étau mécanique, ainsi que la visualisation des chromosomes au microscope à contraste de phase. Figure 2 montre l'hybridation d'une sonde marquée fluorescentément à l'ADN cible sur des préparations de chromosomes en utilisant un système automatisé de coloration de lames, l'utilisation d'un microscope de numérisation automatisé pour visualiser et cartographier les sondes après l'expérience de FISH, et le positionnement et l'orientation de scaffolds génomiques sur les chromosomes.
Des préparations de chromosomes polytènes des cellules nourricières ovariennes provenant de femelles d'An. gambiae ont été réalisées à l'aide de la technique de haute pression. Cette méthode n'endommage ni ne modifie la majeure partie de la structure chromosomique (Figure 3). Elle aplatisse les chromosomes courbés et révèle ainsi des bandes fines cachées, invisibles dans les préparations classiques (Figure 4).
Les sondes utilisées dans ce protocole sont des clones d'ADN génomique de type BAC provenant d'une bibliothèque BAC ND-TAM, construite à partir de l'ADN de la souche PEST d'An. gambiae. L'ADN génomique de cette bibliothèque a été extrait de larves nouvellement écloses de premier stade, de sexe mâle et femelle. Figure 5 présente les résultats de l'hybridation in situ en fluorescence (FISH) utilisant des clones BAC hybridés aux chromosomes polytènes d'An. gambiae. Cette procédure a été réalisée à l'aide du système automatisé de coloration de lames Xmatrx. À l'aide d'une photomappe cytogénétique d'An. gambiae10, deux clones BAC, 102B24 (GenBank : BH372701, BH372694) et BAC 142O19 (GenBank : BH368703, BH368698), ont été localisés respectivement dans les subdivisions 16C et 16D du bras 2R. Toutefois, une recherche BLAST contre l'assemblage AgamP3 de la souche PEST d'An. gambiae14 a identifié les séquences homologues à 102B24 et 142O19 respectivement dans les subdivisions 16B et 17A du bras 2R (Tableau 1). Par conséquent, la correspondance entre les coordonnées génomiques et les subdivisions cytogénétiques peut désormais être ajustée selon nos données de cartographie. Une recherche BLAST contre les assemblages génomiques des formes M et S d'An. gambiae a révélé que les deux clones BAC se trouvent sur des contigs différents, mais sur les mêmes scaffolds au sein de chaque forme (Tableau 1). Les contigs identifiés peuvent désormais être associés à des emplacements chromosomiques spécifiques. De plus, les scaffolds identifiés peuvent désormais être correctement orientés au sein des subdivisions cytologiques 16CD. Curieusement, les distances entre les séquences 102B24 et 142O19 dans les scaffolds sont respectivement de 1 892 981 pb, 1 658 391 pb et 1 688 426 pb dans les assemblages génomiques de la souche PEST, de la forme M et de la forme S. Étant donné que la souche PEST est un hybride des formes M et S, cette différence est probablement due à un assemblage incorrect du génome PEST.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BAC 
			(numéro d'accession)</td>
			<td>Souche PEST 
			AgamP3 
			 
			Coordonnées</td>
			<td>Forme M 
			contigs 
			 
			Coordonnées</td>
			<td>Forme M 
			scaffolds 
			 
			Coordonnées</td>
			<td>Forme S 
			contigs 
			 
			Coordonnées</td>
			<td>Forme S 
			scaffolds 
			 
			Coordonnées</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372694)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_26 (16B) 
			 
			43 681 342- 
			43 681 874</td>
			<td>ABKP020247 
			53.1 
			 
			32 513- 
			33 045</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			1 858 377- 
			1 858 909</td>
			<td>ABKQ010123 
			32.1 
			 
			4 299- 
			4 832</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			215 891- 
			216 424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372701)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_28 (16B) 
			 
			43 788 213- 
			43 788 969</td>
			<td>ABKP020247 
			51.1 
			 
			24 816- 
			25 575</td>
			<td>EQ090167.1, 
			 
			1 772 683- 
			1 773 442</td>
			<td>ABKQ010123 
			35.1 
			 
			27 782- 
			28 540</td>
			<td>EQ099711.1, 
			 
			305 514- 
			306 272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368698)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			 
			8805_5 (17A) 
			45 428 580- 
			45 429 264</td>
			<td>ABKP020247 
			01.1 
			 
			2 499- 
			3 185</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			315 806- 
			316 492</td>
			<td>ABKQ010123 
			76.1 
			 
			49 242- 
			49 942</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1 791 625- 
			1 792 325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368703)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8805_8 (17A) 
			 
			45 560 099- 
			45 574 323</td>
			<td>ABKP020220 
			17.1 
			 
			30 971- 
			32 469</td>
			<td>EQ090167.1 
			200 518- 
			202 016</td>
			<td>ABKQ010123 
			79.1 
			 
			27 760- 
			28 508</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1 903 569- 
			1 904 317</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1. Résultats du BLAST des séquences de l'extrémité du BAC contre les assemblages du génome d'An. gambiae.
<img alt="Dissection des ovaires de moustique ; microscope stéréoscopique ; préparation de chromosomes ; microscopie en contraste de phase." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Représentation schématique de la préparation de chromosomes sous haute pression. Les ovaires de moustique sont représentés au stade de développement approprié.
<img alt="Marquage de sondes pour la cartographie chromosomique avec hybridation automatisée sur lame et microscope à balayage." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Schéma illustrant la FISH automatisée, le balayage des lames et la cartographie chromosomique de fragments génomiques assemblés.
<img alt="Structure des chromosomes polytènes, image au microscope, analyse du profil de bandes de l'ADN, recherche génétique." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Étalement du chromosome polytène 3 d'An. gambiae obtenu à l'aide de la technique à haute pression. 3L et 3R indiquent les bras gauche et droit au niveau de leurs télomères. PH et IH indiquent respectivement l'hétérochromatine péricentrique et intercalaire.
<img alt="Image microscopique comparant les profils de bandes chromosomiques 3R/3L sous différentes pressions." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Comparaison des chromosomes polytènes d'An. gambiae préparés à l’aide de la technique traditionnelle (haut) et de la technique à haute pression (bas). Les images couvrent les sous-divisions 29A-30E du bras 3R (A) et 43D-46D du bras 3L (B).
<img alt="Cartographie chromosomique, marqueurs fluorescents et locus génétiques sur un diagramme des chromosomes polytènes de Drosophile." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5. Hybridation in situ en fluorescence (FISH) de clones BAC sur des chromosomes polytènes d’An. gambiae. A) Hybridation du clone 102B24 (signal rouge) avec le bras 2R. B) FISH en double couleur du clone 102B24 (signal rouge) et du clone 142O19 (signal bleu) aux sous-divisions 16C et 16D du bras 2R étiré, respectivement. Les flèches indiquent les signaux d’hybridation des clones BAC marqués avec Cy3 (rouge) et Cy5 (bleu). C désigne la région centromérique. a/+ indique l’hétérozygote pour l’inversion 2La. Les chromosomes ont été contre-colorés avec le fluorophore YOYO-1.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+10K%3A+a+proposal+to+obtain+whole-genome+sequence+for+10%2C000+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hered%22%5BJournal%5D)">Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species.</a> J. Hered. 100, 659-674 (2009).</li>
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<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Drosophila+Polytene+Chromosome+Squashes+for+Antibody+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling.</a> J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).</li>
<li>Vatolina, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Identical+Functional+Organization+of+Nonpolytene+and+Polytene+Chromosomes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d'intérêts déclaré.

L'étape la plus critique de la procédure à haute pression est l'écrasement adéquat des cellules nourricières ovariennes isolées au stade III de Christophers du développement ovarien13. Un écrasement inadéquat peut entraîner une dispersion insuffisante des chromosomes, ce qui peut poser des problèmes lors de la détermination de la position des sondes après un marquage FISH. Si les chromosomes sont trop écrasés, ils peuvent se rompre ou s'étirer au point de perdre leurs motifs de banding. La réalisation de plusieurs lames permet d'obtenir une consistance lors de l'écrasement des préparations à l'aide de l'outil Dremel, ce qui augmente l'efficacité globale de la production de lames. La technique de haute pression a été initialement développée pour les glandes salivaires fraîchement isolées de D. melanogaster9. Toutefois, les ovaires de moustiques sont couramment conservés dans une solution de fixateur de Carnoy modifié (3 méthanol : 1 acide acétique glacial en volume) avant d'être utilisés pour les préparations chromosomiques. Par conséquent, nous avons adapté le protocole existant de haute pression afin de le rendre adapté aux chromosomes polytènes des cellules nourricières ovariennes fixées du moustique vecteur du paludisme An. gambiae. Étant donné que la pression élevée est appliquée à l'aide d'un étau de précision doté d'une surface de travail parfaitement parallèle sur toute la lame, la préparation de l'écrasement chromosomique prend nettement moins de temps que la méthode traditionnelle consistant à taper avec la gomme d'un crayon.
D'autres étapes importantes incluent une imprégnation suffisante des follicules dans de l'acide propionique à 50 % et le chauffage de la lame. Ces deux étapes sont essentielles pour aider à aplatir les chromosomes. Si elles sont négligées, les chromosomes peuvent apparaître brillants après déshydratation, ce qui peut entraîner un excès de fond pouvant être confondu avec un signal en FISH. La technique d'écrasement à haute pression fonctionne également bien en utilisant les mêmes solutions lors de la préparation de chromosomes mitotiques. L'étalement et l'aplatissement supplémentaires permettent une meilleure libération des chromosomes hors de leurs noyaux. L'application d'une pression uniforme devrait les aplatir de manière adéquate, permettant ainsi des mesures et éventuellement une meilleure résolution des bandes visibles après coloration. Les détails concernant l'isolement de chromosomes mitotiques à partir de moustiques sont donnés ailleurs15. Bien que les préparations classiques par écrasement soient suffisantes pour de nombreuses applications, notamment la FISH 16 et l'immunomarquage17, la méthode à haute pression réduit non seulement les variations potentielles d'une lame à l'autre, mais améliore également la qualité globale des chromosomes, offrant ainsi un niveau de détail accru lors de la cartographie chromosomique. Cette procédure peut également être utilisée pour préparer des lames de membranes de chromosomes polytènes destinées à la microdissection par capture laser.
Les limites de la méthode à haute pression incluent la rupture des lames et l'étirement excessif des chromosomes. La rupture des lames, provoquée par une contrainte excessive exercée sur la lame via l'étau, est possible, mais elle est limitée en utilisant les pressions indiquées dans l'article. En ce qui concerne l'étirement excessif des chromosomes, si l'outil Dremel est appliqué sur la lame pendant une période prolongée, il se peut que les chromosomes s'étirent trop et perdent en résolution. Ce problème peut être corrigé en appliquant l'outil brièvement, en vérifiant au microscope, puis en appliquant à nouveau l'outil Dremel pendant un temps supplémentaire si les chromosomes ne sont pas suffisamment étalés.
Un protocole classique de FISH comprend plusieurs étapes de lavage et d'incubation, d'une durée habituelle de 5 à 20 minutes, qui exigent une attention quasi constante de la part du chercheur pendant toute la durée de l'expérience. De plus, le nombre de lames pouvant être manipulé manuellement est généralement limité à quelques lames par expérience. En revanche, un système automatisé de coloration de lames effectue automatiquement toutes les étapes (y compris les lavages, les incubations, l'application de la sonde, la dénaturation, l'hybridation, ainsi que la pose et le retrait du couvre-objet). Cela permet de libérer jusqu'à 6 à 8 heures de travail pour le chercheur lors d'une expérience de FISH. Par ailleurs, un système automatisé de FISH peut augmenter considérablement le débit. Par exemple, le système Xmatrx est capable de traiter jusqu'à 40 dosages sur des lames à préparation unique et jusqu'à 80 dosages sur des lames à double préparation simultanément. Parmi les limites de ce système, on note qu'il n'est pas efficace pour un faible nombre d'expériences de FISH, car il nécessite la préparation de grands volumes de solutions. En outre, le protocole de FISH programmé dans le système peut nécessiter des modifications et des ajustements pour de nouvelles applications.
Un système de numérisation de lames est une version automatisée du microscope à fluorescence. Le déplacement automatisé de la platine et un panneau de commande simple du microscope libèrent du temps pour le chercheur et rendent l'utilisation du microscope extrêmement facile. Par exemple, le logiciel du système de numérisation ACCORD PLUS permet une acquisition simple de plusieurs canaux de fluorescence et une gestion aisée de la prise d'images. Un exemple en est l'acquisition de coupes en z, au lieu d'une seule image : le logiciel capture une pile d'images en z configurable afin de s'assurer qu'au moins une image reste nette. Bien que ce système soit davantage conçu pour l'acquisition d'images multiples (un grand nombre de cellules sur une même lame), il facilite tout de même grandement la localisation des chromosomes sur la lame par rapport à une navigation manuelle.
Les systèmes automatisés de coloration de lames et de numérisation sont couramment utilisés en diagnostic FISH des anomalies chromosomiques dans les cellules humaines par les cliniques de cytogénétique. Dans cette étude, nous avons mis au point un protocole utilisant ces systèmes automatisés pour une application en recherche fondamentale. Le protocole automatisé de cartographie physique à haut débit peut faciliter l'élaboration rapide de cartes chromosomiques physiques pour n'importe quelle espèce d'intérêt. Bien que, dans ce rapport, nous ayons utilisé des chromosomes polytènes pour la cartographie physique, les chromosomes mitotiques peuvent également être utilisés avec ces systèmes. Il serait utile d'adapter le protocole aux chromosomes mitotiques, car la majorité des organismes ne développent pas de chromosomes polytènes lisibles. Toutefois, lorsque les chromosomes polytènes sont disponibles, ils peuvent fournir des informations précieuses sur la correspondance entre les domaines fonctionnels du génome et la structure chromosomique, avec la résolution la plus élevée. Les principes d'organisation des chromosomes polytènes, tels que les motifs de bandes et d'interbandes, ont récemment été comparés à ceux des chromosomes réguliers non polytènes (en interphase)18. Par conséquent, la cartographie physique détaillée réalisée sur des préparations de chromosomes à haute pression a le potentiel de relier des séquences d'ADN à des structures chromosomiques spécifiques telles que les bandes, les interbandes, les bourgeons, les centromères, les télomères et l'hétérochromatine ; permettant ainsi la création d'assemblages génomiques basés sur les chromosomes.

<table><tbody><tr><td>Plaquettes de microscope 22x22 mm</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes de microscope 18x18 mm</td><td>Fisher</td><td>12-553-402</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Acide propionique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Outil rotatif Dremel 200 avec attache à arbre flexible</td><td>Rand</td><td></td><td>3&quot; Meuleuse d'établi mini polyvalente (avec limiteur de vitesse)</td></tr><tr><td>Pointes en plastique spécialement conçues de 200 &amp;mu;l (bords en plastique perlés) pour outil Dremel</td><td>Pipetman</td><td>F171300</td><td>Couper et chauffer l'extrémité épaisse des pointes de pipette</td></tr><tr><td>Mors rapide recouvert d'étain</td><td>Avenger Gold Toolmaker</td><td>MTC-200-1</td><td>Usiné avec précision, carré et parallèle à 0,00025 près</td></tr><tr><td>Clé dynamométrique</td><td>Craftsman</td><td>44593</td><td></td></tr><tr><td>Système de dénaturation/hybridation de lames ThermoBrite</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>Lames-barrières de 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT108-SL</td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes de 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT122-90X</td><td></td></tr><tr><td>Système automatisé de coloration de lames Xmatrx</td><td>Abbott Molecular</td><td>08L46-001</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope MZ6 Leica</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>Un autre stéréomicroscope peut être utilisé</td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase Olympus CX41</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>Un autre microscope à contraste de phase peut être utilisé</td></tr><tr><td>Système automatisé de numérisation ACCORD PLUS</td><td>BioView (USA)</td><td>BV-5000-ACCP</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Formol tamponné neutre (NBF) à 10 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formamide à 99 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextrane, sel sodique</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon SSC 20x</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Denhardt 50x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Solution d'iodure de YOYO-1 1 mM (491/509) dans le DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>Réactif antifade ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr></tbody></table>

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l&#39;aide automatisée<em&gt; in situ</em&gt; hybridation

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Des projets visant à obtenir les séquences de génomes entiers pour 10 000 espèces de vertébrés1 et pour 5 000 espèces d'insectes et d'arthropodes apparentés2 devraient être menés au cours des 5 prochaines années. Par exemple, le séquençage des génomes de 15 espèces de moustiques responsables du paludisme est actuellement en cours à l'aide d'une plateforme Illumina3,4. Ce groupe d'espèces d'Anopheles comprend à la fois des vecteurs et des non-vecteurs du paludisme. Lorsque les assemblages génomiques seront disponibles, les chercheurs disposeront d'une opportunité unique d'effectuer des analyses comparatives afin de déduire les changements évolutifs liés à la capacité vectorielle. Toutefois, il s'est avéré difficile d'utiliser les lectures de séquençage de nouvelle génération pour produire des assemblages génomiques de novo de haute qualité5. De plus, les assemblages génomiques existants pour Anopheles gambiae, bien qu'obtenus par la méthode Sanger, présentent des lacunes ou sont fragmentés4,6.
La réussite des analyses génomiques comparatives sera limitée si les chercheurs travaillent avec de nombreux contigs de séquençage, plutôt qu'avec des assemblages génomiques basés sur les chromosomes. Les séquences fragmentées et non cartographiées posent problème pour les analyses génomiques, car : (i) les brèches non identifiées entraînent une annotation incorrecte ou incomplète des séquences génomiques ; (ii) les séquences non attribuées génèrent des confusions entre gènes paralogues et gènes provenant de différents haplotypes ; et (iii) l'absence d'attribution chromosomique et d'orientation des contigs de séquençage empêche la reconstruction de la phylogénie des réarrangements et l'étude de l'évolution chromosomique. Élaborer des cartes physiques à haute résolution pour les espèces dont le génome vient d'être séquencé constitue un investissement opportun et rentable, qui facilitera l'annotation du génome, l'analyse évolutionnaire et le ré-séquençage de génomes individuels provenant de populations naturelles7,8.
Nous présentons ici des approches innovantes de préparation des chromosomes, d'hybridation in situ fluorescente (FISH) et d'imagerie qui facilitent l'élaboration rapide de cartes physiques. En utilisant An. gambiae comme exemple, nous démontrons que l'élaboration de cartes chromosomiques physiques peut potentiellement améliorer les assemblages génomiques et, par conséquent, la qualité des analyses génomiques. Premièrement, nous utilisons une méthode à haute pression pour préparer des étalages de chromosomes polytènes. Cette méthode, initialement développée pour Drosophila9, permet à l'utilisateur de visualiser davantage de détails sur les chromosomes que la technique classique d'écrasement10. Deuxièmement, un système entièrement automatisé en interface est utilisé pour la cartographie physique à haut débit du génome par FISH. Le système automatisé de coloration des lames permet d'effectuer plusieurs tests simultanément et réduit considérablement le temps de manipulation11. Troisièmement, un système d'imagerie fluorescente automatique, comprenant une platine motorisée pour lames, analyse et photographie automatiquement les chromosomes marqués après FISH12. Ce système est particulièrement utile pour identifier et visualiser plusieurs plaques chromosomiques sur une même lame. En outre, le processus de numérisation permet d'obtenir un résultat FISH plus uniforme. Dans l'ensemble, le protocole automatisé de cartographie physique à haut débit est plus efficace qu'un protocole manuel standard.

Les assemblages génomiques basés sur les technologies de séquençage d'ADN massivement parallèles sont généralement très fragmentés. Le développement de cartes chromosomiques physiques peut potentiellement améliorer les assemblages génomiques. Ici, nous démontrons des approches innovantes de préparation des chromosomes, d'hybridation fluorescente in situ et d'imagerie qui augmentent considérablement le débit de production de la carte physique.

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l&#39;aide automatisée<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Des projets visant à obtenir les séquences du génome complet pour 10 000 espèces de vertébrés1 ainsi que pour 5 000 espèces d'insectes et d'arthropodes apparentés2 devraient avoir lieu...

L'objectif général de cette procédure est de cartographier des sondes d'ADN sur les chromosomes de polytène de moustique à l'aide d'une préparation de chromosomes à haute pression, suivie d'une hybridation in situ fluorescente automatisée et d'un examen automatisé par imagerie. Cela est réalisé en préparant d'abord des préparations de chromosomes polytènes selon une méthode à haute pression. L'étape suivante de la procédure consiste à préparer des sondes fluorescentes en marquant l'ADN génomique complémentaire avec un fluorochrome par un protocole de traduction par entaille (Nick translation).La troisième étape consiste à effectuer une hybridation in situ fluorescente en utilisant des systèmes automatisés de coloration de lames. La dernière étape est de numériser et de photographier les chromosomes marqués à l'aide d'un système d'imagerie fluorescente automatique. En fin de compte, les images peuvent montrer la localisation d'une sonde d'ADN marquée fluorescente sur le polychromosome.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme un protocole standard d'hybridation in situ manuel, est que le protocole de cartographie physique à plus haut débit produit des résultats plus reproductibles et réduit considérablement le temps de manipulation. Ce protocole commence par la dissection de femelles demi-gravité et oly environ 25 heures après l’alimentation sanguine afin de prélever leurs ovaires lorsqu’elles se trouvent au stade trois de Christopher. À ce stade, la zone transparente contenant les cellules nourricières à l’intérieur des follicules doit avoir une forme arrondie. Prélevez les ovaires de cinq femelles et fixez-les dans 500 microlitres d’une solution modifiée de carnoy fraîchement préparée.Elles peuvent ensuite être conservées à température ambiante pendant un maximum de 24 heures ou plus longtemps à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, juste avant de préparer les lames de dissection ovarienne, préparez la solution de carnoy et de l'acide propionique à 50 %. Placez chaque paire d'ovaires dans une goutte de solution de carnoy fraîche sur une lame exempte de poussière, sous un microscope stéréoscopique.Diviser les ovaires à l’aide de l’aiguille de dissection. Transférer tous les morceaux d’ovaires sur six lames propres contenant de l’acide propionique à 50 %. Séparer les follicules les uns des autres à l’aide d’aiguilles de dissection.Ensuite, essuyez les tissus résiduels avec une serviette en papier. Ajoutez une autre goutte d'acide propionique à 50 % et attendez trois à cinq minutes. Selon la légende, les follicules plongés dans l'acide propionique à 50 % durant trois à cinq minutes présentent une amélioration significative de l'étalement chromosomique.Ensuite, appliquez une lamelle et attendez une minute supplémentaire pour étaler les noyaux. Enveloppez la lame avec du papier filtre et du plastique. Réglez un Dremel entre 3 000 et 5 000 tr/min, puis, pendant environ une minute, faites tourner légèrement la pointe du Dremel contre la lamelle.Vérifiez la qualité de l'étalement avec un microscope à contraste de phase et appliquez le dremel plus longtemps si nécessaire, afin d'aplatir les chromosomes. Placez une deuxième lamelle à côté de la première, puis placez les lamelles entre un autre microscope. Ensuite, enveloppez les préparations avec une feuille plastique et du papier filtre, puis placez les préparations enveloppées dans un étau pour comprimer les lames entre 85 et 120 pouces-livres.Après avoir aplati les chromosomes sur les six lames, déroulez les lames et retirez les lames supplémentaires afin d'aplatir davantage les chromosomes. Incubez les lames à 55 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes dans un système de dénaturation et d'hybridation de lames. Ensuite, plongez une lame dans l'azote liquide pendant au moins 15 secondes ou jusqu'à ce que les bulles cessent.Retirez ensuite rapidement la lame couvre-objet à l’aide d’un scalpel et placez immédiatement la lame porte-objet dans de l’éthanol froid à 50 % pendant cinq minutes. Répétez ce processus pour chaque lame porte-objet de manière séquentielle. Déshydratez les lames porte-objet dans des bains d’éthanol à 70 %, 90 % et 100 %.Les immerger dans chaque bain pendant cinq minutes. Enfin, après séchage à l'air des lames, elles sont prêtes pour la coloration FISH. Un dispositif automatisé effectue la plupart des étapes de la procédure, à l'exception du marquage de la sonde.Ainsi, avant de charger l'appareil, préparez la sonde fluorescente en marquant à nouveau l'ADN avec le fluorochrome en utilisant un protocole commercial de traduction NIC. Une fois la sonde préparée, chargez les lames et les réactifs dans les lames automatisées. Programmez le système pour effectuer les étapes suivantes. Premièrement, ajoutez 800 microlitres de un XPBS pendant 20 minutes.Deuxièmement, séchez les lames à l’aide d’un sèche-cheveux. Troisièmement, fixez les lames avec 450 microlitres de formol à 4 % dans un XPBS pendant une minute. Ensuite, lavez les lames avec de l’éthanol à 100 % pendant une seconde, deux fois, puis pendant deux minutes.Une fois après le bain d'éthanol, séchez à nouveau les lames à l'air. Chauffez maintenant les lames à 45 degrés Celsius pendant deux minutes afin d'éviter la formation de bulles. Appliquez ensuite 20 microlitres de la sonde d'ADN, suivis d'une goutte d'huile minérale et d'un couvre-objet ; puis dénaturez les chromosomes à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, placer les lames en hybridation à 42 degrés Celsius pendant 14 heures. Après l'hybridation, effectuer les lavages de stringence pendant deux minutes à 42 degrés Celsius, suivis de quatre applications consécutives d'une seconde de deux XSSC et d'un séchage. Appliquer ensuite 800 microlitres de 0,4 XSSC à 42 degrés Celsius pendant 10 minutes, deux fois, puis réaliser un autre lavage avec deux XSSC à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes.Appliquez maintenant la coloration : 50 microlitres de Yo-Yo-1, suivis d'huile minérale et de lamelles. Incubez les lames à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, retirez les lamelles.Lavez les lames deux fois dans du XSSC, quatre fois pendant une seconde par lavage, puis séchez les lames en les soufflant. Enfin, appliquez 15 microlitres de réactif antifade prolongé gold sur chaque lame et fixez de nouvelles lamelles. Mettez sous tension le système automatisé de numérisation Accord plus, en commençant par l'alimentation Olympus U-R-F-L-T pour une ampoule halogène.Ensuite, allumez l'ordinateur, puis enfin le microscope équipé d'un appareil photo. Ouvrez d'abord le logiciel Duet, configurez un préscreening à 10 x. Cliquez sur le bouton en ligne, saisissez un nouvel identifiant de cas et attribuez un identifiant de lame.Cliquez sur le point marqué bf. Il s'agit de l'option de champ clair. Sélectionnez un choix de numérisation pour un présat à 10 x.Sélectionnez 2, 500 x cercle, 10 000 x cercle ou rectangle. Cliquez sur « définir » puis sur « exécuter ». Ensuite, suivez les invites pour ajuster correctement le balayage, puis cliquez sur « terminer ».Pour démarrer l'analyse, appuyez sur l'onglet principal pour revenir à l'écran principal. Cliquez maintenant sur le bouton hors ligne, recherchez l'identifiant du cas et l'identifiant de la lame qui ont été attribués, puis cliquez sur hors ligne.Numériser dans la zone noire située en haut à gauche. Cliquer sur une flèche et sélectionner la pré-numérisation 10 x. Utiliser les flèches pour parcourir les images numérisées après avoir trouvé une image intéressante.Double-cliquez sur l'écran au milieu de la région ciblée, puis appuyez sur capture. Cela permettra de cibler une image pour une acquisition ultérieure, après avoir sélectionné toutes les cibles. Faites un clic droit sur chaque image, cliquez sur classer, sélectionnez pré-numérisation 10 x, puis sélectionnez polytan.Retournez au menu principal et configurez le pré-scan 40 x. Sélectionnez à nouveau en ligne et choisissez une lame. Remplacez BF par ffl et modifiez le nom de la tâche en revisit dash X 40 dash rg.Modifiez la section située juste en dessous du dernier paramètre pour revenir à l'ensemble du tableau de bord. Exécutez ensuite le programme et suivez les instructions. Pour configurer l'automatisation, cliquez sur le bouton Démarrer l'appariement des vues afin d'associer les images à 10 x et 40 x.Cliquez sur « terminer » pour démarrer le balayage. Une fois terminé, cliquez sur « classer » et examinez les images. Des préparations de chromosomes polytènes de cellules nourricières ovariennes provenant de femelles d'anomalie de Gambie ont été réalisées à l'aide de la technique à haute pression.Cette méthode n'endommage pas ou ne modifie pas la majeure partie de la structure chromosomique. Elle aplatit les chromosomes courbés et révèle ainsi des bandes fines cachées qui ne sont pas visibles sur des préparations classiques. Le chromosome a été sondé avec des clones d'ADN back obtenus à partir de la bibliothèque d'anomalie S Gambia nd Tam back.La bibliothèque a été générée à partir de larves étoile de premier stade mâles et femelles de la souche de ravageur *Anopheles gambiae* S. Après cette procédure, un cartographage physique automatisé à haut débit peut être réalisé afin de faciliter le développement rapide d'assemblages génomiques basés sur les chromosomes.

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