Automatisation expériences ChIP-seq pour générer des profils épigénétiques sur 10 000 cellules HeLa

L’objectif global de cette procédure est de fournir aux chercheurs une plate-forme automatisée capable d’effectuer des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine sur seulement 10 000 cellules. Ceci est accompli en préparant d’abord de la chromatine cisaillée de haute qualité pour l’immunoprécipitation de la chromatine. Dans un deuxième temps, une expérience automatisée d’immunoprécipitation de la chromatine est créée et des banques automatisées sont exécutées avec l’ADN immunoprécipité.

L’ADN immunoprécipité est analysé par PCR quantitative et séquençage de nouvelle génération. En fin de compte, le succès de la technologie automatisée peut être validé par la comparaison des profils de séquence d’immunoprécipitation de la chromatine générés sur l’échantillon original de 10 000 cellules avec des expériences réalisées sur 100 000 cellules et des ensembles de données existants à titre de référence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique afin d’approfondir notre compréhension des fonctions de biomarqueurs spécifiques dans divers tissus.

Stades de développement et états pathologiques. Cette technique a des implications pour le diagnostic de plusieurs maladies car elle aidera à identifier des biomarqueurs épigénétiques dans la santé et la maladie, précis et fiables. Les technologies automatiques sont des outils importants pour les chercheurs dans l’analyse épigénétique de types cellulaires spécifiques, de sous-populations et de biopsies.

Pour une expérience standard d’immunoprécipitation automatisée de la chromatine, commencez par ajouter 120 microlitres de tampon d’immunoprécipitation de la chromatine H à 100 microlitres de chromatine cisaillée d’un à 2 millions de cellules, en réservant deux à 20 microlitres de chromatine pour l’échantillon d’entrée. Ensuite, pour configurer l’expérience automatisée sur l’IP star compact, sélectionnez protocoles et cliquez sur l’icône d’immunoprécipitation de la chromatine. Choisissez la méthode directe d’immunoprécipitation de la chromatine, puis dans l’écran suivant, choisissez le protocole d’immunoprécipitation de la chromatine 200 microlitres et spécifiez le numéro de l’échantillon.

Réglez les paramètres expérimentaux d’immunoprécipitation de la chromatine à quatre heures pour l’enrobage d’anticorps. Étape 15 heures pour l’étape d’immunoprécipitation, et cinq minutes pour chaque étape de lavage. Ensuite, configurez les réactifs en suivant les instructions affichées sur l’écran d’informations de mise en page, et ajoutez les réactifs appropriés et les anticorps de grade ChIP-seq hautement validés.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de protéines, des billes magnétiques enrobées d’un A pour chaque réaction, et les échantillons de chromatine après la fin du protocole de puce de nuit et de la réticulation inverse. Purifiez l’ADN avec un kit de purification d’ADN à base de billes magnétiques. Utilisez un test fluorométrique commercial très sensible pour quantifier l’ADN immunoprécipité.

Ensuite, en utilisant des amorces pour au moins une région génomique de contrôle positive et une région génomique négative. Analyser la qualité de l’ADN immunoprécipité par PCR quantitative selon les paramètres appropriés des matériaux pour l’analyse. Les résultats sont exprimés en pourcentage de récupération de l’entrée pour le séquençage de prochaine génération selon les protocoles.

Cliquez maintenant sur l’icône de préparation de la bibliothèque, puis choisissez la technologie de préparation de la bibliothèque de votre préférence et configurez les réactifs selon les instructions sur l’écran d’informations de mise en page. Par exemple, dans cette expérience, des profils de séquençage pour six modifications d’histones différentes associées à l’expression des gènes ont été générés. La corrélation de pointe élevée observée entre ces marqueurs d’histones indique la capacité du système automatisé à générer des données précises et fiables.

De plus, ces graphiques montrent la distribution des pics pour les différentes modifications d’histones dans des régions génomiques spécifiques. Enfin, pour une expérience automatisée d’immunoprécipitation de la chromatine pour des échantillons avec un faible nombre de cellules, réglez le protocole automatisé d’immunoprécipitation de la chromatine de 200 microlitres sur le système d’automatisation, comme cela vient d’être démontré. Ensuite, chargez le système avec le ChIP-seq, les anticorps et les réactifs de qualité optimisent pour travailler sur des quantités de chromatine comprises entre 10 000 et 100 000 cellules en utilisant seulement 10 microlitres de protéines, des billes magnétiques enrobées A pour chaque réaction.

Après la puce, exécutez la préparation de la bibliothèque, sélectionnez le protocole de préparation de la bibliothèque micro plex et configurez les réactifs en suivant les instructions affichées sur l’écran d’informations de mise en page. Dans cette PCR quantitative représentative d’une immunoprécipitation de la chromatine à partir d’un échantillon de départ de 10 000 cellules, des enrichissements significatifs en anticorps anti-histones dans les régions de contrôle positif et des signaux négligeables dans les régions de contrôle négatif ont été observés. Ici, une série de 10 réactions d’immunoprécipitation reproductibles et hautement comparables à une expérience manuelle d’immunoprécipitation de la chromatine est présentée, démontrant la capacité du système automatisé à fonctionner avec de faibles quantités de cellules sans augmentation visible de la variabilité d’une expérience à l’autre par rapport à l’immunoprécipitation manuelle.

Ces données illustrent les analyses bioinformatiques des bibliothèques de séquences de 10 000 et 100 000. Il a cellules S3 après immunoprécipitation de la chromatine, démontrant des résultats exceptionnels à partir des échantillons d’immunoprécipitation de la chromatine à faible nombre de cellules. Cet ensemble de données, qui correspond à l’expérience avec 10 000 cellules de matériau de départ, contient un faible bruit de fond avec des pics d’enrichissement très fiables qui sont confirmés à la fois par l’ensemble de données de 100 000 cellules et par l’ensemble de données de référence du Broad Institute.

Pour le projet d’encodage, il est important de noter que les données de 10 000 cellules présentent des pics presque identiques aux données du Broad Institute, avec un taux de chevauchement de 98 % des meilleurs 40 % des pics classés par le score significatif utilisé dans le projet de code final. Le système automatisé IP star nécessite une intervention minimale de l’opérateur, ce qui réduit le temps de manipulation de l’immunoprécipitation de la chromatine à seulement une à deux heures. De plus, le processus automatisé remplace les nombreuses étapes sujettes aux erreurs de l’immunoprécipitation manuelle de la chromatine et fournit des résultats très cohérents.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’une bonne immunoprécipitation de la chromatine et une bonne sélection d’anticorps hautement spécifiques et sensibles sont essentielles au succès de l’expérience. Cette technologie a ouvert la voie aux chercheurs de tous les domaines de la biologie pour améliorer la précision, la reproductibilité et la cohérence de la thérapie. Etudes épigénétiques.