Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Bonjour, je m’appelle Ena et nous faisons régulièrement du profilage de l’expression génique en laboratoire. Et nous utilisons cette technique pour surveiller les gènes régulés différentiels entre la méthamphétamine et le type sauvage. Et aujourd’hui, j’ai un type sauvage et des échantillons d’ARN de méthamphétamine et nous faisons tous du C en premier.

Nous utilisons une méthode de marquage indirect et l’avantage de cette technique est d’éviter le biais oculaire qui peut se produire lors du marquage direct. Et pour ce faire, nous avons des échantillons d’ARN et nous choisissons d’obtenir trois microgrammes d’ARN dans 13 microlitres de volume total. Et nous ajoutons 2,5 micro d’he aléatoire dans nos parcs.

Et nous allons incuber l’échantillon à sept cinq degrés pour avoir la nature de l’ARN pendant huit minutes. Et maintenant, nous allons ajouter le, nous allons ajouter le cocktail de transcription inverse qui contient le mélange continu AM L-D-L-D-U-T-P, le tampon de transcriptase inverse et également ET TT Big it down Et incuber l’échantillon à 42 degrés pendant quatre heures. Donc, après quatre heures, nous sortons simplement les échantillons.

Et maintenant, dans le tube, nous avons un mélange d’ADNC et d’ARN. Et ce que nous voulons faire, c’est faire de l’ARN hydrox en ajoutant de l’hydroxyde de sodium et de l’EDTA et la concentration finale pour l’hydroxyde de sodium devrait être de cent molaires. Et la concentration finale pour e BT doit être de cinq molaires.

Et maintenant, nous allons incuber des échantillons à un bain-marie à 65 degrés pendant 10 minutes. L’incubation est donc terminée et nous utiliserons des échantillons en ajoutant un pH de sept tas et une eau à la concentration finale de 500 molaires. À ce stade, vous pouvez stocker les échantillons à moins 20 ou vous pouvez continuer le nettoyage.

Pour le nettoyage de l’ADNC, nous utilisons le kit de purification PCR KaiGen. Cependant, puisque le tampon de brousse et le tampon d’ions contiennent de la libération, nous ne le faisons pas, nous préparons notre propre tampon de brousse et notre tampon d’ions de destin et vous ajouterez 300 litres de PPI et nous descendrons lentement ce bassin jusqu’à vous transférerez le mélange en colonnes Et vous tournerez pendant une minute à la vitesse la plus élevée Et vous regarderez le, le tampon que nous avons préparé. Tampon de lavage au phosphate, vous ajouterez 750 microlitres et ainsi de suite, et vous ajouterez un autre Pour un à nouveau.

Nous allons donc tourner à nouveau juste pour nous assurer que nous avons tout le lit. Et nous transférerons ces tubes dans des tubes vides pour délinquants. Et j’ajouterai 30 marqueurs du tampon phophosphate E, soit quatre quatre molaires de phosphate de potassium à pH 8,5.

Et ici, il vous suffit de vous assurer que vous ajoutez tout au centre de la colonne et vous incuberez à température ambiante pendant une minute. Donc, il tournera à nouveau pendant une minute et j’ajouterai un autre tampon de 30 micro zéro que j’incube ou que je chambre. J’enlève donc la colonne et nous avons un volume total de 60 micros ou CDA.

Une fois que nous avons nettoyé le CDNA, vous pouvez, vous pouvez le stocker à moins 20 degrés et nous pouvons également le sécher, puis le stocker afin de pouvoir sécher le CDNA en retour. Donc, maintenant, dans le tube, nous avons du CDA sec, qui est modifié. Et ce que nous allons faire, c’est que je vais suspendre l’échantillon sec.

Je vais suspendre l’échantillon dans 10 ture de bicarbonate 15 LAR à pH neuf. Et je vais juste le faire en faisant des mouvements de haut en bas à cette étape, il est très important de résus l’ADNc. Eh bien, pour que la réaction de la société d’achat fonctionne, cette réaction devrait avoir lieu dans la chambre noire car les étiquettes fluorescentes sont sensibles aux matrices.

Cependant, en optant pour les sciences de la vie et ils sont, ils sont venus dans des emballages individuels. S cinq a une casquette violette et la troisième face a une casquette orange et aussi S cinq apparaît Sion quand il est suspendu et Cary apparaît magenta. Donc, ce que je ferai dans une chambre noire, c’est que je transférerai ces échantillons dans des tubes de colorant, je suspendrai le colorant et les transférerai à nouveau dans le tube que j’ai.

Et puis j’incube dans l’obscurité pendant deux heures, après deux heures d’incubation, ceux-ci arrêtent la réaction en ajoutant 35 re d’acétate de sodium de cent millimolaires à pH 5,2. Et après cela, nous avons nettoyé avec la procédure de nettoyage similaire. Cependant, cette fois, nous utilisons un tampon de lavage et un tampon d’élution fournis par les Cajuns.

Vous pouvez décrire les endroits où vous avez placé l’échantillon et qui devraient nettoyer l’instrument. Donc, vous pouvez votre échantillon ou votre mélange dès maintenant I To, Donc, c’est mon échantillon étiqueté de science-fiction et ici ce que nous voyons est OD deux 60, qui montre le contenu CDA et OD six 50, qui montre l’incorporation D pour scifi. Et voici mon échantillon d’étiquette de la troisième face.

Encore une fois, twist six concentration et cinq 50 mesures site trois incorporation. Étant donné que ma société D fonctionne efficacement, je vais combiner des échantillons maintenant, Mme Miss it brièvement. Et maintenant, nous allons écrire à nouveau un échantillon à l’aide des commentaires.

D’accord, donc pour l’isation du toboggan, nous allons réhydrater en plaçant universellement le toboggan au-dessus de l’eau, ce qui agrandira les taches. Et puis pour protéger cela, nous allons simplement sécher à cent degrés Celsius et nous allons ensuite hybrider ou réticuler les taches dans la lame, puis nous incuberons dans le tampon pré-élevé dont nous disposons. Je place donc le toboggan face cachée, mais il ne touche pas encore l’eau.

Et nous attendrons ainsi pendant cinq minutes. Donc, cette boîte a l’air plus grande, elles devraient être plus brillantes qu’avant que vous ne les mettiez, et vous sécherez simplement en mettant la diapositive à cent degrés et vous observerez la condensation. Et nous allons faire un lien croisé avec vousi.

Donc, pour m’hydrater, je vais simplement tremper la diapositive dans de l’eau d’avant-guerre. Et cela devrait être très rapide parce que le but ici est de vous débarrasser de toutes les taches ou de tous les oligos sur place qui n’est pas lié. Et si vous allez lentement dans ce processus, vous n’obtiendrez que des détails sur vos spots.

Donc, assurez-vous simplement que vous le faites vraiment rapidement et assurez-vous de ne pas prendre votre vol hors de l’eau et de faire ce genre de choses pendant 30 secondes et de rester immédiatement à température ambiante pendant cinq minutes et 700 air pm Obtenez ceci, nous installons cette glissière dans le tampon de la station de tuyauterie d’avant-guerre que nous avions Et poussant lentement la diapositive dans le bocal et nous l’incuberons à 42 degrés pendant à au moins 45 minutes. Nous avons donc ici notre échantillon séché à hybrider. Nous allons donc d’abord suspendre Resus dans l’eau.

À cette étape, il suffit de ressusciter la suspension en se produisant de haut en bas et éventuellement de ne pas exposer l’échantillon trop blanc, blanc. Ensuite, vous ajouterez l’ADN du spermatozoïde de quelqu’un de 1,5 et la concentration est de 10 milligrammes par mil. Et vous ajouterez 1.2 marketeur de TRNA.

La concentration est de 12,5 milligrammes par, nous ajoutons de l’ARNt et de l’ADN de spermatozoïdes pour bloquer l’hydro non spécifique. Et nous ajoutons 5,35 marqueur zéro trois XSSC, ce qui donne une concentration finale de trois x. Et enfin, nous ajoutons 3,5 microlitres de 1 % SDS.

Maintenant, nous allons faire bouillir le mélange pendant cinq minutes et nous allons tourner à la vitesse la plus élevée pendant cinq minutes et il sera prêt à l’avoir. Cela fait une heure que nous avons incubé notre toboggan et en ce moment, j’ai de l’eau et de l’isopropanol. Je vais donc agiter la glissière dans l’eau d’abord pour me débarrasser du SDS, puis laver votre dza propanol et le mettre directement dans l’échantillon standard.

Et ici, faites attention à ne pas trop exposer la lumière à l’air pour éviter le dessèchement. Alors je vais directement de la station de nuisance tampon dans l’eau et nous lavons le toboggan. Quelques minutes, assurez-vous simplement que le mouvement n’est que de haut en bas, pas latéral.

Et assurez-vous également que la lame n’est pas au-dessus de l’eau et nous la transférerons immédiatement dans de l’isopropanol. Et il reste ici pendant quelques minutes encore. Et votre page pourrait-elle répondre à votre page à température ambiante pendant cinq minutes ?

700 R.Cool. Ainsi, notre toboggan est également prêt à être hybridé et il est préférable de le garder dans une boîte à toboggans pour le protéger du bus. Donc, pour la station de récolte, nous utiliserons le levage ou la glissade.

Il y a des bandes blanches sur la lamelle de couverture et elles fourniront un peu de portance et d’espace pour que notre échantillon puisse aller entre la lamelle de couverture et la lame. Et je le nettoie avec de l’éthanol Et puis je pose du fil Et je m’assure simplement qu’il n’y a pas de particule de test. Nous allons donc d’abord prendre notre diapositive de modèle dont la zone d’impression est marquée, et par-dessus, nous mettrons la diapositive que nous avons préparée et nous nous assurerons qu’elles s’alignent parfaitement.

Assurez-vous qu’ils s’alignent parfaitement. Et vous devez vous assurer que les bandes sont sur le côté, que nous allons les faire face. C’est donc vraiment difficile à voir, mais assurez-vous que vous pouvez le voir.

Et les rayures doivent être sur les côtés des glissières. Et nous allons charger notre échantillon par les côtés. Je prends de petites quantités d’échantillon, donc je prends d’abord 15 microlitres et je commence à charger par le coin de la lamelle.

Et lentement, je le rentrerais et je me déplacerais simplement le long du bord pour couvrir toute la surface. À ce stade, il est très important de ne pas introduire de bulles et je prends un autre 15 migrateur et l’applique sur le côté des lames pour éviter tout dessèchement. Ainsi, notre échantillon est prêt et vous incuberez nos lames et nos chambres de hiérarchisation, qui ont des micro-canaux pour hydrater la lame pendant qu’elle s’hybride.

Et nous ajouterons 10 spécialistes du marketing sur trois XSSC dans les six coins de la diapositive. Il y avait six endroits sur la, sur la chambre, désolé, sur chaque coin je, et de chaque côté, assurez-vous de transférer la diapositive très doucement pour que le couvercle ne glisse pas. Et lorsque vous mettez la glissière à l’endroit vers le haut, vous verrez qu’elle va s’empiler, elle va coller à l’eau que vous avez mise et mis le couvercle Et assurez-vous que les vis sont bien serrées.

Nous allons incuber la chambre de conversation à une poche d’eau à 65 degrés, mais nous ne voulons pas la mettre directement au fond. Nous avons donc simplement mis une sorte de barrière en plastique pour empêcher le transfert de chaleur excessif. Et nous plaçons notre chambre d’isation en douceur et pour éviter tout déplacement, vous pouvez également mettre une sorte de poids.

Et cette incubation durera toute la nuit, généralement entre 10 et 12 heures. Ainsi, pour le lavage de la tranche, nous utilisons un XSSC avec 0,05 % de SDS. Il s’agit de retirer le bordereau de couverture.

Et ce sera pour le lavage de la première étape. Et nous n’effectuerons que deux étapes supplémentaires avec 0,06 %six XSC à travers toutes les FDS dont nous disposons. Alors nous bouchons tous la conversation et nous prenons des diapositives et les mettons face cachée dans le récipient du sac à main.

Et nous allons simplement le secouer d’un côté à l’autre et nous verrons que la lamelle tombera doucement. Très bien, et, et nous allons simplement transférer dans un autre tampon de lavage qui contient XES. Vous attendez une minute.

Passez à oh six XSSC. Et juste pour être sûr de nous débarrasser de tous les FDS, nous allons le répéter une fois de plus. La centrifugeuse pour sécher est restée à température ambiante pendant cinq minutes à 700 RP. Vous conservez cette diapositive dans la boîte de diapositives car elle est sensible à la lumière.

Il s’agit donc d’un scanner de diapositives et vous allez mettre la diapositive ici, un peu d’espace ici, placez la diapositive face vers le bas, étiquetée vers et, et dans la deuxième diapositive, vous définirez simplement la zone que vous souhaitez numériser. Et vous allez simplement prendre cette zone dans nos diapositives. Nous avons, nous utilisons 16 épingles pour imprimer nos diapositives.

Ainsi, chaque bloc correspond à une épingle et nos diapositives contiennent plus de 8 000 points. Et nous représentons deux fois le génome de la couleur vi parce qu’il s’agit d’environ 4 000 gènes. Nous avons donc deux points pour chaque oligo que nous utilisons.

Et si ceux-ci zooment, vous verriez dans cette expérience particulière, nous comparons les mutants régulateurs de transcription au type sauvage, et les mutants seraient marqués avec scifi, ce qui donne une couleur rouge. Et le type sauvage était le site trois, ce qui donne une couleur verte. Donc, tout ce qui semble rouge, comme ces taches, indique que l’abondance des transcrits chez le mutant était supérieure à celle du type sauvage.

Ils apparaissent donc rouges ou des nuances de rouge, et tout ce qui apparaîtrait vert indique que l’abondance du transcrit était plus élevée dans le type sauvage par rapport au mutant. Et toute tache qui apparaît jaune indique que cette transcription était également présente chez les mutants et les sauvages. Ainsi, lorsqu’ils se superposent, ils apparaissent jaunes comme ces mais.