Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Bonjour, je m'appelle Ena et nous réalisons couramment des profils d'expression génique au laboratoire. Nous utilisons cette technique pour surveiller les gènes régulés de manière différentielle entre meth et le type sauvage. Aujourd'hui, j'ai des échantillons d'ARN de type sauvage et de meth, et nous allons tous faire la C en premier.

Nous utilisons des méthodes de marquage indirect et l'avantage de cette technique est d'éviter le biais visuel qui peut survenir lors d'un marquage direct. Pour ce faire, nous disposons d'échantillons d'ARN et nous choisissons d'obtenir trois microgrammes d'ARN dans un volume total de 13 microlitres. Ensuite, nous ajoutons 2,5 microlitres d'amorces aléatoires dans nos échantillons.

Et nous allons incuber l'échantillon à 75 degrés pour dénaturer l'ARN pendant huit minutes. Ensuite, nous allons ajouter le cocktail de transcription inverse contenant le mix AM L-D-L-D-U-T-P, le tampon de transcriptase inverse et également l'ET TT Big. Incuber ensuite l'échantillon à 42 degrés pendant quatre heures. Après quatre heures, nous prélevons simplement les échantillons.

Et maintenant, dans le tube, nous avons un mélange d'ADNc et d'ARN. Ce que nous voulons faire, c'est hydrolyser l'ARN en ajoutant de l'hydroxyde de sodium et de l'EDTA ; la concentration finale en hydroxyde de sodium doit être de cent molaire, et la concentration finale en EDTA doit être de cinq molaire.

Et maintenant, nous allons incuber les échantillons dans un bain d'eau à 65 degrés pendant 10 minutes. L'incubation est terminée et nous allons utiliser les échantillons en ajoutant de l'eau pH 7,5 à une concentration finale de 500 molaire. À ce stade, vous pouvez conserver les échantillons à -20 ou poursuivre avec la purification.

Pour le nettoyage de l'ADNc, nous utilisons le kit de purification PCR KaiGen. Toutefois, comme le tampon Bush et le tampon ionique contiennent des agents gélifiants, nous préparons nous-mêmes le tampon Bush fate et le tampon ionique fate, puis nous ajoutons 300 microlitres de PPI et nous pipettons lentement ce mélange que vous transférerez ensuite dans des colonnes. Faites centrifuger une minute à vitesse maximale, puis ajoutez 750 microlitres de tampon de lavage au phosphate que nous avons préparé. Ajoutez-en à nouveau 750 microlitres une seconde fois.

Nous allons donc faire une nouvelle centrifugation afin de nous assurer que nous avons bien récupéré tout le culot. Ensuite, nous transférerons ces tubes dans des tubes récepteurs vides. J'ajouterai alors 30 marques de tampon E de phosphate, qui contient 4 molar de phosphate de potassium à un pH de 8,5.

Et ici, vous devez simplement vous assurer d'ajouter tous les éléments au centre de la colonne et d'incuber à température ambiante pendant une minute. Elle centrifugera donc à nouveau pendant une minute, puis j'ajouterai un autre tampon de 30 microlitres zéro. J'incube à température ambiante. J'enlève ensuite la colonne et nous obtenons un volume total de 60 microlitres ou CDA.

Une fois que nous avons purifié l'ADNc, vous pouvez le conserver à moins 20 degrés, et nous pouvons également le sécher puis le stocker, de sorte que nous puissions sécher l'ADNc en retour. Maintenant, dans le tube, nous avons de l'ADNc sec, qui est modifié. Ce que nous allons faire, c'est que je vais resuspendre l'échantillon sec dans.

Je vais suspendre l'échantillon dans 10 ture de 15 LAR de bicarbonate à pH neuf. Et je vais simplement faire ceci en aspirant et en rejetant plusieurs fois à cette étape, il est très important de resuspendre l'ADNc. En effet, pour que la réaction de marquage fonctionne, cette réaction doit avoir lieu dans l'obscurité car les marqueurs fluorescents sont sensibles à la lumière.

Cependant, ces échantillons proviennent des sciences de la vie et ils sont fournis en emballages individuels. L'échantillon S5 possède un bouchon violet et l'échantillon S3 un bouchon orange ; en outre, S5 apparaît en teinte bleu-vert lorsqu'il est en suspension, tandis que Cary apparaît en magenta. Ce que je vais donc faire dans la chambre noire, c'est transférer ces échantillons dans des tubes colorés, les remettre en suspension dans le colorant, puis les replacer dans le tube dont ils proviennent.

Ensuite, j'incuberai à l'obscurité pendant deux heures ; après cette période d'incubation, j'arrêterai la réaction en ajoutant 35 µL d'acétate de sodium 100 mM à pH 5,2. Puis, nous procéderons à la purification selon une procédure de nettoyage similaire. Toutefois, cette fois, nous utiliserons le tampon de lavage et le tampon d'élution fournis par Cajun.

Vous pouvez indiquer les endroits où vous avez déposé l'échantillon, ce qui permet de nettoyer l'instrument. Vous pouvez donc déposer votre échantillon ou votre mélange dès maintenant. Voici mon échantillon marqué scifi, et ce que nous observons ici est l'OD à 260, qui indique la teneur en ADN, et l'OD à 650, qui indique l'incorporation de D pour scifi. Et voici mon échantillon marqué side three.

Encore une fois, mélangez six concentrations et cinq mesures de 50 sur le site d'incorporation numéro trois. Puisque mon entreprise D fonctionne efficacement, je combinerai les échantillons maintenant. Mme Miss, faites une brève pause. Et maintenant, nous rédigerons à nouveau un échantillon en utilisant les retours d'information.

Très bien, pour l’immobilisation sur la lame, nous effectuons une réhydratation en plaçant universellement la lame au-dessus de l’eau, ce qui permet d’agrandir les taches. Ensuite, pour protéger cela, nous procédons simplement à un séchage rapide à 100 degrés Celsius, puis nous effectuons une hybridation UV ou une réticulation UV des taches sur la lame. Enfin, nous incubons dans le tampon de pré-hybridation que nous avons préparé. Je place donc la lame face vers le bas, sans qu’elle touche encore l’eau.

Et nous attendrons ainsi pendant cinq minutes. Je, cette boîte semble plus grande, elles devraient être plus brillantes qu’auparavant que vous les ayez placées, et elles sécheront rapidement en mettant la lame à cent degrés, puis vous observerez la condensation. Et nous effectuerons la réticulation avec vousi.

Pour l'hydratation, je vais simplement plonger la lame dans de l'eau préchauffée. Cette étape doit être très rapide, car il s'agit d'éliminer toutes les taches ou tous les oligos présents sur la tache non liée. Si vous procédez lentement lors de cette étape, vous obtiendrez simplement des queues de comètes sur vos taches.

Veillez donc à bien effectuer cette étape rapidement et à ne pas sortir votre lame de l'eau ; effectuez cette manipulation pendant 30 secondes, puis plongez immédiatement la lame dans de l'eau à température ambiante pendant cinq minutes à 700 tr/min. Ensuite, placez cette lame dans le tampon de la station de préhybridation que nous avions préparé, insérez lentement la lame dans le bocal, et incubez à 42 degrés pendant au moins 45 minutes. Ici, nous avons notre échantillon séché prêt à être hybridé. Nous allons donc d'abord le resuspendre dans de l'eau.

À cette étape, nous procédons simplement à la resuspension en agitant de haut en bas, en évitant éventuellement d'exposer trop longtemps l'échantillon à la lumière blanche. Ensuite, vous ajouterez de l'ADN de sperme de saumon à 1,5, dont la concentration est de 10 milligrammes par millilitre. Et vous ajouterez 1,2 microlitre d'ARNt.

La concentration est de 12,5 milligrammes par, nous ajoutons de l'ARNt et de l'ADN de sperme pour bloquer l'hybridation non spécifique. Et nous ajoutons 5,35 marqueur zéro trois XSSC, ce qui donne une concentration finale de trois x. Enfin, nous ajoutons 3,5 microlitres de SDS à 1 %.

Nous allons maintenant faire bouillir le mélange pendant cinq minutes, puis centrifuger à vitesse maximale pendant cinq minutes, et il sera prêt à être utilisé. Cela fait une heure que nous incubons notre lame, et j'ai maintenant de l'eau et de l'isopropanol. J'agiterai donc la lame d'abord dans l'eau pour éliminer le SDS, puis je la rincerai à l'isopropanol et la placerai directement dans l'étalon témoin.

Et ici, faites attention à ne pas trop exposer la lumière à l’air afin d’éviter le dessèchement. Je passe donc directement du tampon de la station de paraffine dans l’eau et nous lavons la lame. Quelques minutes, en veillant à ce que le mouvement soit uniquement vertical, pas latéral.

Et assurez-vous également que la lame ne se trouve pas au-dessus de l'eau ; nous la transférerons immédiatement dans de l'isopropanol. Laissez-la simplement ici pendant quelques minutes de nouveau. Pourriez-vous placer votre lame à température ambiante pendant cinq minutes, s'il vous plaît ?

700 R.Cool. Notre lame est donc également prête à être hybridée, et il est préférable de la conserver dans une boîte à lames pour la protéger des chocs. Pour la station de récolte, nous utiliserons le lift ou le slip.

Il y a des bandes blanches sur la lame de couverture qui assureront un léger soulèvement et créeront un espace permettant à notre échantillon de s'insérer entre la lame de couverture et la lame porte-objet. Je nettoie ensuite avec de l'éthanol, puis je pose le fil, en veillant à ce qu'aucune particule de test ne soit présente. Tout d'abord, nous prenons notre lame-témoin dont la zone d'impression est marquée, puis nous plaçons par-dessus la lame que nous avons préparée, en veillant à ce qu'elles soient parfaitement alignées.

Veillez à ce qu'ils s'alignent parfaitement. Vous devez également vous assurer que les bandes se trouvent sur le côté, celui que nous allons orienter vers le bas. C'est donc très difficile à voir, mais vérifiez que vous parvenez à le distinguer.

Et les bandes doivent se trouver sur les côtés des lames. Nous chargerons notre échantillon par les côtés. Je prélève de petites quantités d'échantillon, donc je commence par 15 microlitres, et je commence à charger à partir du coin de la lamelle.

Et lentement, je le ramène tout en me déplaçant le long du bord pour couvrir toute la surface. À ce stade, il est très important de ne pas introduire de bulles, et je prends un autre migrateur de 15 µL que j'applique sur le côté des lames afin d'éviter tout dessèchement. Notre échantillon est donc prêt, et vous allez incuber nos lames dans des chambres de priorisation, qui possèdent des microcanaux permettant d'hydrater la lame pendant l'hybridation.

Nous allons ajouter 10 µL de trois XSSC dans six coins de la lame. Il y avait six endroits sur, sur la chambre, désolé, sur chaque coin et sur chaque côté. Assurez-vous de transférer la lame très délicatement afin que la lamelle ne glisse pas. Et lorsque vous placez la lame côté recto vers le haut, vous verrez qu'elle s'agencera, qu'elle adhérera à l'eau que vous avez déposée et à la lamelle. Assurez-vous que les vis sont bien serrées.

Nous allons incuber la chambre de réaction à 65 degrés dans un bain d'eau, mais nous ne voulons pas la placer directement au fond. Nous plaçons donc une barrière en plastique afin d'éviter un transfert de chaleur excessif. Ensuite, nous positionnons délicatement notre chambre d'hybridation, et pour éviter tout déplacement, vous pouvez également ajouter un petit poids.

Cette incubation se fait toute la nuit, généralement entre 10 et 12 heures. Pour le lavage de la coupe, nous utilisons une solution XSSC contenant 0,05 % de SDS. Cela permettra d'éliminer la lame de couverture.

Et cela sera destiné au lavage de la première étape. Nous effectuerons deux autres étapes uniquement avec du six XSC à 0,06 % à travers tous les SDS que nous avons. Nous tournons donc tous la lamelle et prenons les lames pour les placer face vers le bas dans un récipient hermétique.

Et nous allons simplement secouer doucement de côté et nous verrons que la lame couvre glissera délicatement. Très bien, ensuite, nous allons simplement transférer dans un autre tampon de lavage contenant XES. Incubez pendant une minute.

Passez à l’étape oh six XSSC. Et pour vous assurer d’avoir éliminé tout le FDS, répétez l’opération une fois de plus. Faites centrifuger à sec à température ambiante pendant cinq minutes à 700 RP. Conservez cette lame dans la boîte à lames car elle est sensible à la lumière.

Voici un numériseur de lames ; vous placerez la lame ici, dans l'espace prévu à cet effet, en la mettant à l'envers, avec l'étiquette tournée vers l'avant. Sur la deuxième lame, vous définirez simplement la zone que vous souhaitez numériser. Vous sélectionnerez cette zone sur nos lames. Nous utilisons 16 broches pour imprimer nos lames.

Ainsi, chaque bloc correspond à une broche et nos lames contiennent plus de 8 000 points. Nous représentons deux fois le génome de vi color car il comprend environ 4 000 gènes. Nous avons donc deux points par oligonucléotide utilisé.

Et si l'on zoome, on observe dans cette expérience particulière que nous comparons des mutants de régulateurs de la transcription au type sauvage, le mutant étant marqué avec scifi, qui donne une couleur rouge. Le type sauvage correspondait au site trois, qui donne une couleur verte. Ainsi, tout élément qui apparaît rouge, comme ces taches, indique que l'abondance des transcrits chez le mutant était plus élevée que chez le type sauvage.

Ils apparaissent donc rouges ou des nuances de rouge, et tout ce qui apparaît en vert indique que l'abondance du transcrit était plus élevée chez le type sauvage par rapport au mutant. Tout point qui apparaît jaune indique que ce transcrit était présent en quantités équivalentes chez le mutant et le type sauvage. Ainsi, lorsqu'ils se superposent, ils apparaissent jaunes comme ces points.