Name: Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: Découvrez le profilage d'expression génique par marquage indirect et hybridation sur puce à ADN. Cette méthode permet de comparer l'expression différentielle entre échantillons mutants et sauvages avec précision.

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Réaction de la transcriptase Tourner bloc chauffant à 70-80 ° C et 42 ° C. Bains d&#39;eau peut également être utilisé dans cette étape. Si l&#39;aide de blocs de chauffage, mettre un peu d&#39;eau afin que la chaleur est uniforme. <ol><li> La réaction d&#39;amorçage <ol><li> Prenez 3 pg d&#39;ARN </li><li> Réglez le volume à 13 ul avec de l&#39;eau RNase </li><li> Ajouter 2,5 pi de hasard hexamère amorces (2mg/mL) </li></ol></li><li> Bien mélanger et incuber à 70-80 ° C pendant 8 minutes. Ensuite, placer sur la glace pendant 5 min. </li><li> Préparer un cocktail RT (14,5 l / Rxn): <table border="0"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 5X tampon First Strand </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> 0,1 M de DTT </td><td> 3 pl </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl-mélange de dNTP </td><td> 1,2 ul </td></tr><tr><td> SuperScript II RT (200U/μl) </td><td> 2,3 ul </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 2,0 ul </td></tr></tbody></table> * Pour les réactions n, préparer Mix Master 0.5 pour n aliquotes de cocktail pour vous assurer que vous ne manquerez pas. </li><li> Ajouter 14,5 ul de réactions refroidi. </li><li> Mélanger (ne pas vortexer) et incuber à 42 ° C pendant 3-4 heures </li><li> Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C si nécessaire. </li></ol> Hydrolyser l&#39;ARN <ol><li> Pour chaque échantillon, ajouter 3 l de NaOH 1 N et 0,6 ul de 0,5 M d&#39;EDTA. (Final conc.s = 100mm NaOH, 10 mM EDTA) </li><li> Mélanger et incuber à 65 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Neutraliser en ajoutant 33,6 ul de HEPES 1M, pH = 7,0 (finale conc .= 500mm HEPES) </li><li> Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C, si nécessaire. </li></ol> Purification de réaction: Suppression des non constituée en société AA-dUTP et amines libres Remarque: Ce protocole de purification est modifié par rapport au protocole de Qiagen QIAquick PCRpurification kit. Le lavage de phosphate et de tampons d&#39;élution sont substitués aux tampons Qiagen fourni parce que les tampons Qiagen contiennent des amines libres en concurrence avec la réaction de couplage Cy colorant. Les colonnes de la trousse de mini-préparation peut également être utilisé. <ol><li> Mélanger la réaction d&#39;ADNc avec 300 pl (ou volume de réaction 5X = 336 ul) de tampon PB (Qiagen fourni) et le transfert à la colonne QIAquick. </li><li> Placer la colonne dans un tube collecteur de 2 ml (Qiagen fourni) et centrifuger à 13000 rpm ~ 1 minute. Tube de collection vide. </li><li> Pour laver, ajouter 750 pi de tampon phosphate de lavage (pas de Qiagen) à la colonne et centrifuger à 13000 rpm ~ 1 minute. </li><li> Vider le tube de collecte et de répéter le lavage 750 ul et l&#39;étape de centrifugation. </li><li> Vider le tube de collecte et centrifuger la colonne 1 minute supplémentaire à vitesse maximale. </li><li> Transfert de colonne à une nouvelle tube de 1,5 ml et centrifuger ajouter prudemment 30 pi de tampon d&#39;élution phosphate. (Voir la section préparation de la solution) </li><li> Incuber pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Eluer par centrifugation à 13000 rpm ~ 1 minute. </li><li> Eluer une seconde fois (avec un autre 30 ul de tampon d&#39;élution phosphate) dans le même tube en répétant les étapes 6-8. Le volume d&#39;élution finale doit être ~ 60 pl. </li><li> Le montant de l&#39;ADNc peuvent être quantifiés à ce stade: ng d&#39;ADNc = (facteur de dilution) (OD260) (37) (volume total élué de la colonne) </li><li> L&#39;échantillon sec dans un Speed ​​Vac à 45 ° C. </li><li> Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C si nécessaire. </li></ol> Couplage aa-ADNc à Cy Ester Dye <ol><li> Resuspendre aminoallyl-ADNc marqué avec 10 pl 50 mM de Na-bicarbonate de pH = 9,0 si nécessaire. (Ce tampon doit être frais tous les deux semaines) </li><li> Travailler dans un endroit sombre, ajouter la sonde à un tube de colorant Cy approprié. Pipet fois monter et descendre plusieurs resuspendre le colorant. </li><li> Incuber la réaction pendant 1 heure dans le noir à température ambiante. (Incubation peut aller jusqu&#39;à deux heures) </li></ol> Purification Réaction II: Prélèvement de colorant découplé <ol><li> Pour la réaction, ajouter 35 ul de 100 mM pH 5,2 NaOAc. Mélanger soigneusement. </li><li> Ajouter 250 pi (ou volume de réaction 5X = 225 ul) Tampon PB (Qiagen fourni) pour chaque échantillon et mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Placer une colonne spin QIAquick dans un tube collecteur de 2 ml (Qiagen fourni), appliquer l&#39;échantillon à la colonne, et centrifuger à 13000 ~ 1 minute. Tube de collection vide. </li><li> Pour laver, ajouter 0,75 ml de tampon PE (Qiagen fourni) à la colonne et centrifuger à 13000 ~ 1 minute. </li><li> Répétez l&#39;étape 4. </li><li> Tube de prélèvement vides et la colonne de centrifugation pour un supplément de 1 minute à vitesse maximale. </li><li> Colonne de la Place dans un endroit propre tube de 1,5 ml et centrifuger, prudemment, 30 pi de tampon EB (Qiagen fourni) pour le centre de la membrane de la colonne. </li><li> Incuber pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Eluer par centrifugation à 13000 rpm ~ 1 minute. </li><li> Eluer une seconde fois dans le même tube en répétantétapes 7-9. Le volume final doit être élué ~ 60 pl. </li></ol> Analyse de la réaction de marquage Le montant de l&#39;ADNc et l&#39;étiquette peuvent être quantifiés à ce stade: <ul><li> Mesure OD 260, 550 et 650 (blanc est l&#39;eau.) Utilisez le programme biopuces Nanodrop. </li><li> Calculer la pmol d&#39;incorporation des colorants et l&#39;ADN et nuc pmol / colorant rapport avec des équations ci-dessous: nucléotides pmol = [OD260 volume * (ul) * 37 ng / uL * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol </li></ul> Note: 1 OD260 = 37 ng / uL d&#39;ADNc; 324,5 pg / pmol poids moléculaire moyen d&#39;un dNTP) pmol Cy3 = OD550 volume * (ul) / 0,15 pmol Cy5 = OD650 volume * (ul) / 0,25 nucléotides / ratio de teinture = pmol ADNc / pmol Cy colorants Si vous utilisez Nanodrop, il donne déjà pmol / ul pour chaque colorant. Il vous suffit de multiplier ce nombre par le volume pour obtenir l&#39;incorporation totale de teinture pmol. Note:&gt; 150-200 pmol d&#39;incorporation de colorants par échantillon et un ratio de moins de 20 nucléotides / molécules de colorant est optimal pour les hybridations. <ul><li> Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C à la noirceur. <ul><li> Combinez des sondes à hybrider ensemble et sèche dans speedvac à 42 ° C. </li><li> Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;au moment de hyb. </li></ul></li></ul> Pré-hyb diapositives <ol><li> Placer la lame vers le bas le visage plus RT 100 ml d&#39;eau dans un support de diapositives rouges nettoyage pendant 3-5 minutes </li><li> Claquement sec de la diapositive en plaçant face visible sur une 100 ° C bloc chauffant pendant quelques secondes - montre pour la condensation à disparaître </li><li> UV réticuler la diapositive à 250 Mjoules (Entrez le réticulant 2500 à UV) </li><li> Hydratez diapositives par trempage dans l&#39;eau pré-chauffée à 42 ° C. Spin 5 min à 700 rpm à température ambiante. </li><li> Incuber dans 50ml jarre de Coplin contenant préchauffé pré-hyb (5XSSC, 1% de BSA, 0,1% SDS) pour au moins 45 minutes @ 42 ° C, et l&#39;incubation peut aller plus si nécessaire. 50 ml de tampon de pré-hyb: 12,5 mL 20x SSC, 10 ml de 5% de BSA, 0,5 ml SDS à 10%, 27 ml d&#39;eau </li><li> Plongez dans les diapositives pré-chauffé de l&#39;eau (42 ° C) et agiter quelques minutes pour enlever les pré-hyb tampon. </li><li> Rincer dans de l&#39;isopropanol et de spin 5 min à 700 rpm, la température ambiante, à sécher. </li></ol> Préparation des échantillons pour l&#39;hybridation <ol><li> Sonde Remettre en suspension dans l&#39;eau (les volumes sont donnés ci-dessous) <table border="0"><tbody><tr><td> Pour volume total. = 30μl </td><td> Pour volume total. = 35μl </td><td> Pour volume total 40μl .= </td><td></td></tr><tr><td> 19,8 ul d&#39;eau </td><td> 23,55 ul d&#39;eau </td><td> 27,2 ul d&#39;eau </td><td> </td></tr><tr><td> 1,5 pl </td><td> 1,5 pl </td><td> 1,5 pl </td><td> 10 mg / ml d&#39;ADN de sperme de saumon (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1,2 ul </td><td> 1,2 ul </td><td> 1,2 ul </td><td> 12,5 mg / ml d&#39;ARNt </td></tr><tr><td> 4,5 ul </td><td> 5,25 ul </td><td> 6 pl </td><td> 20XSSC (3X final) </td></tr><tr><td> 3 pl </td><td> 3,5 ul </td><td> 4 pl </td><td> SDS à 1% </td></tr></tbody></table> Note: L&#39;ordre d&#39;addition des réactifs sont importants. Ne pas préparer mélange maître. </li><li> Faire bouillir pendant 5 minutes, puis tourner 5 minutes à 14000 rpm. Refroidir pendant 2 min à température ambiante. </li></ol> Hybridation <ol><li> Ajouter 10-12 ul de 3X SSC pour les puits de la chambre d&#39;hybridation sur chaque bord et au milieu. </li><li> Ajouter un bordereau de lifter propre à la zone appropriée de la lame et en douceur de charge dans la solution d&#39;hybridation (30 -40 ul). Il devrait s&#39;agir d&#39;un échantillon supplémentaire sur chaque bord de la lamelle. </li><li> Placer la lame dans la chambre. Serrer les vis et les placer dans un bain d&#39;eau à 65 ° C pendant la nuit. Ne pas placer la chambre directement sur le fond du bain-marie. Placer un bloc sur le dessus de la chambre supérieure pour tenir tout en place. Gardez le couvercle sur le bain d&#39;eau pour protéger les échantillons sensibles à la lumière. </li></ol> Lave Hyb <ol><li> Préparer les tampons suivants: <ul><li> 1X SSC, SDS à 0,05% </li><li> 0,06 X SSC </li></ul></li><li> Après la chambre d&#39;hybridation d&#39;incubation desceller. Retirer la lame de la chambre, en prenant soin de ne pas déranger la lamelle. </li><li> Pour retirer des lamelles, des diapositives plonger dans un plat contenant 1X SSC chaude, 0,05% SDS lamelle tampon de lavage face au fond du plat. La lamelle va tomber en se déplaçant du côté de glisser sur le côté. </li><li> Après la lamelle est retirée, placer la lame dans un rack d&#39;un bain chaud frais avec 1XSSCm SDS à 0,05%. Agiter pendant quelques minutes </li><li> Transfert diapositives plus porte à un bain de 0,06 X SSC. </li><li> Transfert diapositives à l&#39;autre bae de 0,06 X SSC contenant un rack frais, buvard la lame sur une serviette en papier pour enlever autant de SDS-tampon contenant que possible avant de placer dans le bain frais. </li><li> Agiter diapositives pour un couple de minutes. </li><li> Spin immédiatement à la température ambiante pendant 5 min à 700 rpm, puis glisse êtes prêt à numériser. Conserver dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce numérisées. </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-aminoallyl)-2&amp;rsquo;deoxyuridine-5&amp;rsquo;-triphosphate</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>100 mM dNTP Set PCR grade</td></tr><tr><td>Amorces aléatoires hexamériques</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>Kit de colorant réactif post-marquage</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Kit de purification PCR</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>Pour préparer un tampon phosphate 1 M (KPO4, pH 8,5-8,7), mélanger : 9,5 mL de K2HPO4 1 M et 0,5 mL de KH2PO4 1 M</td></tr><tr><td>Tampon de lavage au phosphate</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>Pour 100 mL de tampon de lavage au phosphate (5 mM KPO4, pH 8,0, 80 % EtOH), mélanger : 0,5 mL de KPO4 1 M, pH 8,5 + 15,25 mL d’eau MilliQ + 84,25 mL d’éthanol 95 %. Le tampon de lavage sera légèrement trouble. **IMPORTANT : le tampon de lavage au phosphate doit être préparé quotidiennement.</td></tr><tr><td>Tampon d’élution au phosphate</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>Diluer le KPO4 1 M, pH 8,5, à 4 mM avec de l’eau stérile</td></tr><tr><td>Tampon de carbonate de sodium</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3) : 0,5 M, pH 9,0. Dissoudre 4,2 g de NaHCO3 dans 80 mL d’eau stérile et ajuster le pH à 9,0 avec de la NaOH 10 N ; compléter le volume à 100 mL avec de l’eau stérile. Pour préparer une solution 50 mM destinée à la réaction de couplage du colorant, diluer 1:10 avec de l’eau. Remarque : la composition du tampon carbonate évolue avec le temps ; le renouveler toutes les deux à trois semaines environ.</td></tr></tbody></table>

analyse bactérienne expression génique par puces à adn

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Bonjour, je m'appelle Ena et nous réalisons couramment des profils d'expression génique au laboratoire. Nous utilisons cette technique pour surveiller les gènes régulés de manière différentielle entre meth et le type sauvage. Aujourd'hui, j'ai des échantillons d'ARN de type sauvage et de meth, et nous allons tous faire la C en premier.Nous utilisons des méthodes de marquage indirect et l'avantage de cette technique est d'éviter le biais visuel qui peut survenir lors d'un marquage direct. Pour ce faire, nous disposons d'échantillons d'ARN et nous choisissons d'obtenir trois microgrammes d'ARN dans un volume total de 13 microlitres. Ensuite, nous ajoutons 2,5 microlitres d'amorces aléatoires dans nos échantillons.Et nous allons incuber l'échantillon à 75 degrés pour dénaturer l'ARN pendant huit minutes. Ensuite, nous allons ajouter le cocktail de transcription inverse contenant le mix AM L-D-L-D-U-T-P, le tampon de transcriptase inverse et également l'ET TT Big. Incuber ensuite l'échantillon à 42 degrés pendant quatre heures. Après quatre heures, nous prélevons simplement les échantillons.Et maintenant, dans le tube, nous avons un mélange d'ADNc et d'ARN. Ce que nous voulons faire, c'est hydrolyser l'ARN en ajoutant de l'hydroxyde de sodium et de l'EDTA ; la concentration finale en hydroxyde de sodium doit être de cent molaire, et la concentration finale en EDTA doit être de cinq molaire.Et maintenant, nous allons incuber les échantillons dans un bain d'eau à 65 degrés pendant 10 minutes. L'incubation est terminée et nous allons utiliser les échantillons en ajoutant de l'eau pH 7,5 à une concentration finale de 500 molaire. À ce stade, vous pouvez conserver les échantillons à -20 ou poursuivre avec la purification.Pour le nettoyage de l'ADNc, nous utilisons le kit de purification PCR KaiGen. Toutefois, comme le tampon Bush et le tampon ionique contiennent des agents gélifiants, nous préparons nous-mêmes le tampon Bush fate et le tampon ionique fate, puis nous ajoutons 300 microlitres de PPI et nous pipettons lentement ce mélange que vous transférerez ensuite dans des colonnes. Faites centrifuger une minute à vitesse maximale, puis ajoutez 750 microlitres de tampon de lavage au phosphate que nous avons préparé. Ajoutez-en à nouveau 750 microlitres une seconde fois.Nous allons donc faire une nouvelle centrifugation afin de nous assurer que nous avons bien récupéré tout le culot. Ensuite, nous transférerons ces tubes dans des tubes récepteurs vides. J'ajouterai alors 30 marques de tampon E de phosphate, qui contient 4 molar de phosphate de potassium à un pH de 8,5.Et ici, vous devez simplement vous assurer d'ajouter tous les éléments au centre de la colonne et d'incuber à température ambiante pendant une minute. Elle centrifugera donc à nouveau pendant une minute, puis j'ajouterai un autre tampon de 30 microlitres zéro. J'incube à température ambiante. J'enlève ensuite la colonne et nous obtenons un volume total de 60 microlitres ou CDA.Une fois que nous avons purifié l'ADNc, vous pouvez le conserver à moins 20 degrés, et nous pouvons également le sécher puis le stocker, de sorte que nous puissions sécher l'ADNc en retour. Maintenant, dans le tube, nous avons de l'ADNc sec, qui est modifié. Ce que nous allons faire, c'est que je vais resuspendre l'échantillon sec dans.Je vais suspendre l'échantillon dans 10 ture de 15 LAR de bicarbonate à pH neuf. Et je vais simplement faire ceci en aspirant et en rejetant plusieurs fois à cette étape, il est très important de resuspendre l'ADNc. En effet, pour que la réaction de marquage fonctionne, cette réaction doit avoir lieu dans l'obscurité car les marqueurs fluorescents sont sensibles à la lumière.Cependant, ces échantillons proviennent des sciences de la vie et ils sont fournis en emballages individuels. L'échantillon S5 possède un bouchon violet et l'échantillon S3 un bouchon orange ; en outre, S5 apparaît en teinte bleu-vert lorsqu'il est en suspension, tandis que Cary apparaît en magenta. Ce que je vais donc faire dans la chambre noire, c'est transférer ces échantillons dans des tubes colorés, les remettre en suspension dans le colorant, puis les replacer dans le tube dont ils proviennent.Ensuite, j'incuberai à l'obscurité pendant deux heures ; après cette période d'incubation, j'arrêterai la réaction en ajoutant 35 µL d'acétate de sodium 100 mM à pH 5,2. Puis, nous procéderons à la purification selon une procédure de nettoyage similaire. Toutefois, cette fois, nous utiliserons le tampon de lavage et le tampon d'élution fournis par Cajun.Vous pouvez indiquer les endroits où vous avez déposé l'échantillon, ce qui permet de nettoyer l'instrument. Vous pouvez donc déposer votre échantillon ou votre mélange dès maintenant. Voici mon échantillon marqué scifi, et ce que nous observons ici est l'OD à 260, qui indique la teneur en ADN, et l'OD à 650, qui indique l'incorporation de D pour scifi. Et voici mon échantillon marqué side three.Encore une fois, mélangez six concentrations et cinq mesures de 50 sur le site d'incorporation numéro trois. Puisque mon entreprise D fonctionne efficacement, je combinerai les échantillons maintenant. Mme Miss, faites une brève pause. Et maintenant, nous rédigerons à nouveau un échantillon en utilisant les retours d'information.Très bien, pour l’immobilisation sur la lame, nous effectuons une réhydratation en plaçant universellement la lame au-dessus de l’eau, ce qui permet d’agrandir les taches. Ensuite, pour protéger cela, nous procédons simplement à un séchage rapide à 100 degrés Celsius, puis nous effectuons une hybridation UV ou une réticulation UV des taches sur la lame. Enfin, nous incubons dans le tampon de pré-hybridation que nous avons préparé. Je place donc la lame face vers le bas, sans qu’elle touche encore l’eau.Et nous attendrons ainsi pendant cinq minutes. Je, cette boîte semble plus grande, elles devraient être plus brillantes qu’auparavant que vous les ayez placées, et elles sécheront rapidement en mettant la lame à cent degrés, puis vous observerez la condensation. Et nous effectuerons la réticulation avec vousi.Pour l'hydratation, je vais simplement plonger la lame dans de l'eau préchauffée. Cette étape doit être très rapide, car il s'agit d'éliminer toutes les taches ou tous les oligos présents sur la tache non liée. Si vous procédez lentement lors de cette étape, vous obtiendrez simplement des queues de comètes sur vos taches.Veillez donc à bien effectuer cette étape rapidement et à ne pas sortir votre lame de l'eau ; effectuez cette manipulation pendant 30 secondes, puis plongez immédiatement la lame dans de l'eau à température ambiante pendant cinq minutes à 700 tr/min. Ensuite, placez cette lame dans le tampon de la station de préhybridation que nous avions préparé, insérez lentement la lame dans le bocal, et incubez à 42 degrés pendant au moins 45 minutes. Ici, nous avons notre échantillon séché prêt à être hybridé. Nous allons donc d'abord le resuspendre dans de l'eau.À cette étape, nous procédons simplement à la resuspension en agitant de haut en bas, en évitant éventuellement d'exposer trop longtemps l'échantillon à la lumière blanche. Ensuite, vous ajouterez de l'ADN de sperme de saumon à 1,5, dont la concentration est de 10 milligrammes par millilitre. Et vous ajouterez 1,2 microlitre d'ARNt.La concentration est de 12,5 milligrammes par, nous ajoutons de l'ARNt et de l'ADN de sperme pour bloquer l'hybridation non spécifique. Et nous ajoutons 5,35 marqueur zéro trois XSSC, ce qui donne une concentration finale de trois x. Enfin, nous ajoutons 3,5 microlitres de SDS à 1 %.Nous allons maintenant faire bouillir le mélange pendant cinq minutes, puis centrifuger à vitesse maximale pendant cinq minutes, et il sera prêt à être utilisé. Cela fait une heure que nous incubons notre lame, et j'ai maintenant de l'eau et de l'isopropanol. J'agiterai donc la lame d'abord dans l'eau pour éliminer le SDS, puis je la rincerai à l'isopropanol et la placerai directement dans l'étalon témoin.Et ici, faites attention à ne pas trop exposer la lumière à l’air afin d’éviter le dessèchement. Je passe donc directement du tampon de la station de paraffine dans l’eau et nous lavons la lame. Quelques minutes, en veillant à ce que le mouvement soit uniquement vertical, pas latéral.Et assurez-vous également que la lame ne se trouve pas au-dessus de l'eau ; nous la transférerons immédiatement dans de l'isopropanol. Laissez-la simplement ici pendant quelques minutes de nouveau. Pourriez-vous placer votre lame à température ambiante pendant cinq minutes, s'il vous plaît ?700 R.Cool. Notre lame est donc également prête à être hybridée, et il est préférable de la conserver dans une boîte à lames pour la protéger des chocs. Pour la station de récolte, nous utiliserons le lift ou le slip.Il y a des bandes blanches sur la lame de couverture qui assureront un léger soulèvement et créeront un espace permettant à notre échantillon de s'insérer entre la lame de couverture et la lame porte-objet. Je nettoie ensuite avec de l'éthanol, puis je pose le fil, en veillant à ce qu'aucune particule de test ne soit présente. Tout d'abord, nous prenons notre lame-témoin dont la zone d'impression est marquée, puis nous plaçons par-dessus la lame que nous avons préparée, en veillant à ce qu'elles soient parfaitement alignées.Veillez à ce qu'ils s'alignent parfaitement. Vous devez également vous assurer que les bandes se trouvent sur le côté, celui que nous allons orienter vers le bas. C'est donc très difficile à voir, mais vérifiez que vous parvenez à le distinguer.Et les bandes doivent se trouver sur les côtés des lames. Nous chargerons notre échantillon par les côtés. Je prélève de petites quantités d'échantillon, donc je commence par 15 microlitres, et je commence à charger à partir du coin de la lamelle.Et lentement, je le ramène tout en me déplaçant le long du bord pour couvrir toute la surface. À ce stade, il est très important de ne pas introduire de bulles, et je prends un autre migrateur de 15 µL que j'applique sur le côté des lames afin d'éviter tout dessèchement. Notre échantillon est donc prêt, et vous allez incuber nos lames dans des chambres de priorisation, qui possèdent des microcanaux permettant d'hydrater la lame pendant l'hybridation.Nous allons ajouter 10 µL de trois XSSC dans six coins de la lame. Il y avait six endroits sur, sur la chambre, désolé, sur chaque coin et sur chaque côté. Assurez-vous de transférer la lame très délicatement afin que la lamelle ne glisse pas. Et lorsque vous placez la lame côté recto vers le haut, vous verrez qu'elle s'agencera, qu'elle adhérera à l'eau que vous avez déposée et à la lamelle. Assurez-vous que les vis sont bien serrées.Nous allons incuber la chambre de réaction à 65 degrés dans un bain d'eau, mais nous ne voulons pas la placer directement au fond. Nous plaçons donc une barrière en plastique afin d'éviter un transfert de chaleur excessif. Ensuite, nous positionnons délicatement notre chambre d'hybridation, et pour éviter tout déplacement, vous pouvez également ajouter un petit poids.Cette incubation se fait toute la nuit, généralement entre 10 et 12 heures. Pour le lavage de la coupe, nous utilisons une solution XSSC contenant 0,05 % de SDS. Cela permettra d'éliminer la lame de couverture.Et cela sera destiné au lavage de la première étape. Nous effectuerons deux autres étapes uniquement avec du six XSC à 0,06 % à travers tous les SDS que nous avons. Nous tournons donc tous la lamelle et prenons les lames pour les placer face vers le bas dans un récipient hermétique.Et nous allons simplement secouer doucement de côté et nous verrons que la lame couvre glissera délicatement. Très bien, ensuite, nous allons simplement transférer dans un autre tampon de lavage contenant XES. Incubez pendant une minute.Passez à l’étape oh six XSSC. Et pour vous assurer d’avoir éliminé tout le FDS, répétez l’opération une fois de plus. Faites centrifuger à sec à température ambiante pendant cinq minutes à 700 RP. Conservez cette lame dans la boîte à lames car elle est sensible à la lumière.Voici un numériseur de lames ; vous placerez la lame ici, dans l'espace prévu à cet effet, en la mettant à l'envers, avec l'étiquette tournée vers l'avant. Sur la deuxième lame, vous définirez simplement la zone que vous souhaitez numériser. Vous sélectionnerez cette zone sur nos lames. Nous utilisons 16 broches pour imprimer nos lames.Ainsi, chaque bloc correspond à une broche et nos lames contiennent plus de 8 000 points. Nous représentons deux fois le génome de vi color car il comprend environ 4 000 gènes. Nous avons donc deux points par oligonucléotide utilisé.Et si l'on zoome, on observe dans cette expérience particulière que nous comparons des mutants de régulateurs de la transcription au type sauvage, le mutant étant marqué avec scifi, qui donne une couleur rouge. Le type sauvage correspondait au site trois, qui donne une couleur verte. Ainsi, tout élément qui apparaît rouge, comme ces taches, indique que l'abondance des transcrits chez le mutant était plus élevée que chez le type sauvage.Ils apparaissent donc rouges ou des nuances de rouge, et tout ce qui apparaît en vert indique que l'abondance du transcrit était plus élevée chez le type sauvage par rapport au mutant. Tout point qui apparaît jaune indique que ce transcrit était présent en quantités équivalentes chez le mutant et le type sauvage. Ainsi, lorsqu'ils se superposent, ils apparaissent jaunes comme ces points.

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Biologie

Nous présentons une méthode pour générer des ADNc de l'ARNm de l'environnement. En général, l'ARN total est d'abord recueilli de l'environnement, l'ARNr est enlevé sélectivement, l'ARNm est sélectivement amplifié, et l'ADNc synthétisé à partir de la piscine ARNm enrichi est séquencé. Séquences récupérés peuvent être annotés en utilisant des techniques standard de la bioinformatique pour identifier les gènes exprimés.

Analysant l&#39;expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement

Microarrays Gene sont des outils puissants en matière de profilage d'expression génique au niveau du génome entier. Cette technologie a des applications dans une variété de disciplines biologiques, y compris la biologie du développement et de la toxicologie. Dans cette vidéo, nous détaillons un protocole d'analyse d'expression génique globale à l'aide d'une plateforme complète d'oligonucléotides biopuces pour le poisson zèbre.

Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Dans ce protocole d'expression génique, chez la levure...

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

L'analyse par microréseau a été menée pour déterminer les profils d'expression génétique...

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Systématiques et à grande échelle de synthèse génétiques écrans d'interaction gène-gène (ou épistasie) peut être utilisé pour explorer la redondance génétique et la voie de la diaphonie. Ici, nous décrivons un haut débit quantitatif synthétique de la technologie génétique de dépistage tableau, appelé ESGA que nous avons développé pour élucider les relations épistatiques et l'exploration des réseaux d'interactions...

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Ce manuscrit décrit l’utilisation de la technologie de pointe fournie par les puces à ADN. Les microréseaux fournissent une vue d’ensemble des changements transcriptomiques chez les bactéries subies dans une condition spécifique. De plus, nous soulignons la facilité avec laquelle de grandes quantités de données peuvent être analysées à l’aide de progiciels pratiques développés en interne.

Un pipeline rapide et fiable pour l&#39;étude de cas analyse bactérienne transcriptome: Serine dépendant régulation des gènes dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Nous avons développé un protocole rapide, sensible et reproductible pour le profilage de l’expression génique des agents pathogènes au cours d’une infection.

Profil d&#39;expression génique de microbes infectant utilisant une plateforme numérique de codage de bar

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Cette procédure décrit comment établir des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris et est suivie par transfection en utilisant le système d'électroporation Gene Pulser MXCell.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.

Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 1

Découvrez le profilage d'expression génique par marquage indirect et hybridation sur puce à ADN. Cette méthode permet de comparer l'expression différentielle entre échantillons mutants et sauvages avec précision.

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

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