Name: Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez l'évaluation de la réplication des îlots et de la fonction des cellules bêta chez le rat en utilisant des vecteurs adénoviraux. Cette méthode permet d'identifier les voies de signalisation régulant la masse cellulaire bêta fonctionnelle pour la recherche sur le diabète.

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1. Transduction adénovirale et la culture d&#39;îlots de rats <ol><li> Préparer une plaque à 6 puits de culture tissulaire non revêtu par addition de 2 ml de milieu (RPMI 1640 contenant 8 mM de glucose, 10% de sérum bovin foetal, de 50 unités / ml de pénicilline, et 50 mg / ml de streptomycine) au nombre requis de puits. Par exemple, une expérience typique peut exiger trois puits - un de chaque pour un contrôle sans virus, un contrôle du virus (par exemple, GFP-exprimer adénovirus), et le groupe expérimental. </li><li> Chauffer la plaque à 37 ° C en le plaçant dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 30 min. </li><li> Immédiatement après isolement des îlots de rat 18,19, 100-200 îlots lieu dans des puits individuels de la plaque à 6 puits culture non-tissu enduit. Soixante îlots sont nécessaires pour la sécrétion d&#39;insuline et des essais d&#39;incorporation de thymidine. Les îlots restants peuvent être utilisés pour l&#39;isolation de l&#39;ARN pour les études d&#39;expression génique ou l&#39;isolement de protéines pour immunoblot. </li></ol> [Note: De ce point de l&#39;avant, s&#39;il vous plaît suivre les protocoles institutionnels pour la manipulation, l&#39;utilisation et l&#39;élimination des matières infectieuses.] <ol start="4"><li> Agiter doucement la plaque pour amener les îlots au centre du puits. </li><li> Pipeter l&#39;adénovirus directement sur les îlots dans le centre du plat. Utilisez 100-500 multiplicités d&#39;infection (MOI, le rapport des cellules cibles à virales unités formatrices de plages). </li><li> Laisser reposer pendant 5 min îlots. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Après 24 h, agiter doucement la plaque pour amener les îlots aux centres des puits et transférer les îlots en utilisant une micropipette P200 à un nouveau puits contenant du milieu frais. Si les îlots sont attachés à la plaque, ils peuvent être délogés en douceur avec la pointe de la pipette. </li></ol> [Remarque: Pour vérifier effi transduction adéquatecy, l&#39;utilisation d&#39;un virus de la GFP de commande exprimant est bénéfique, comme îlots peut alors être imagée par microscopie confocale à vérifier la pénétration de l&#39;adénovirus dans le noyau îlot.] <ol start="9"><li> Culture des îlots pour un supplément de 24-72 heures, selon le rythme souhaité de l&#39;expérience des études pilotes d&#39;optimisation. Par exemple, l&#39;induction d&#39;une réponse proliférative peut exiger des durées allant de 24 à 72 h ou knockdown du gène d&#39;intérêt peut exiger 48 ou 72 heures. Transfert des îlots sur des milieux frais chaque jour. </li><li> Pour la finale 24 h de l&#39;expérience, la culture des îlots dans un milieu contenant 1 pCi [méthyl-3 H] -thymidine/ml médias (généralement de 1 pl thymidine / ml les médias). </li></ol> [Note: De ce point de l&#39;avant, s&#39;il vous plaît suivre les protocoles institutionnels pour la manipulation, l&#39;utilisation et l&#39;élimination des matières radioactives.] 2. Essai sécrétion d&#39;insuline <ol><li> Préparer letampon de dosage sécrétion (SAB) solution stock 10X (1,14 M de NaCl, 47 mM de KCl, 12 mM KH 2 PO 4, 11,6 mM MgSO 4) et solution de CaCl 2 de stock 100X (0,25 M CaCl 2). Ces solutions mères peuvent être préparées à l&#39;avance et conservé à température ambiante. </li><li> Fraîchement préparer 50 ml de la RFA de travail (5 mL de SAB 10X, 1 ml de HEPES 1 M, 0,5 ml de CaCl 2, 100X 0,28 ml de 35% de BSA, 0,11 g de NaHCO 3, et de l&#39;eau stérile à 50 ml) dans un conique de 50 ml tube et chaude à 37 ° C en plaçant dans un bain-marie à 37 ° C. </li><li> Introduire à la pipette 10 ml de la SAB de travail dans un tube de 15 ml conique et ajouter 66,8 ul de 2,5 M de D-glucose pour préparer le taux élevé de glucose (16,7 mM) SAB. </li><li> Ajouter 44,8 ul de 2,5 M de D-glucose à la tranche restante de 40 ml de la SAB travaille pour préparer le faible taux de glucose (2,8 mM) SAB. </li><li> Étiquette trois microtubes de 1,7 ml pour chaque puits de la plaque à 6 puits et ajouter 1 ml de tampon phosphate salin (PBS). </li></ol&gt; [Remarque: Comme les îlots sont radioactifs, s&#39;il vous plaît suivre les protocoles institutionnels pour la manipulation, l&#39;utilisation et l&#39;élimination des matières radioactives.] <ol start="6"><li> Placez 20 îlots dans chaque microtube. Faites de chaque tentative d&#39;ajout d&#39;îlots de taille comparable à chaque microtube. Par exemple, chaque tube peut contenir 5 à petite, 10 moyennes et 5 de grande taille (îlots voir Figure 1). </li></ol> [Note: Les îlots peuvent être visualisées en utilisant soit un stéréoscope dissection ou d&#39;un microscope standard.] <ol start="7"><li> Après les îlots se sont installés sur le fond du tube par gravité (~ 2 min), aspirer le PBS avec une micropipette et le jeter. </li></ol> [Remarque: Comme une alternative à la décantation par gravité, les tubes peuvent être centrifugés à 300 g pendant 1 min.] <ol start="8"><li> Pour la pré-incubation, ajouter 400 ul de la faible glucose SAB, placer les tubes (avec leurs bouchons ouvert) dans la incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% de CO 2), et pré-incuber pendant 60 min. Aspirer le pré-incubation faible taux de glucose SAB et le jeter. </li><li> Pour la sécrétion d&#39;insuline basale, ajouter 400 ul de la faible concentration de glucose SAB, placer les tubes (avec leurs bouchons ouvert) dans la incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% de CO 2), et incuber pendant 60 min. Recueillir le faible taux de glucose SAB et enregistrer pour le dosage radioimmunologique l&#39;insuline. </li><li> Pour la sécrétion d&#39;insuline stimulée, ajouter 400 ul de la forte concentration de glucose SAB, placer les tubes (avec leurs bouchons ouvert) dans la incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% de CO 2), et incuber pendant 60 min. Recueillir le taux élevé de glucose SAB et enregistrer pour le dosage radioimmunologique l&#39;insuline. </li></ol> 3. Essai d&#39;incorporation de thymidine <ol><li> Ajouter 1 ml de PBS, après les îlots se sont installés sur le fond du tube par gravité, aspirer le PBS avec une micropipette, jeter, et répétez cettel&#39;étape la fois. </li><li> Ajouter 500 ul de la glace froide d&#39;acide trichloracétique (TCA, 10% w / v) et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Centrifuger les tubes à 16 000 xg pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le TCA, ajouter 80 ul de NaOH 0,3 N, et incuber pendant 30 min à température ambiante. Pendant ce temps, vigoureusement vortex les échantillons pour 5-10 s toutes les 10 min. </li><li> Ajouter 4 ml de cocktail de comptage Econo-sécuritaire de 7 ml de liquide à scintillation tubes de comptage. </li><li> Ajouter 50 ml de l&#39;échantillon dans le tube de comptage à scintillation, plafonner le tube, agiter brièvement, et compter dans un compteur à scintillation liquide. </li><li> Mesurer la concentration de protéines en utilisant l&#39;acide bicinchoninique (BCA) de dosage et 10 ul de l&#39;échantillon selon le protocole du fabricant. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Effectuer le dosage radioimmunologique l&#39;insuline en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Normaliser la sécrétion d&#39;insuline et des données d&#39;incorporation de thymidine avec le concentré de protéineentration. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;expérience pour évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans chez le rat est montré dans la figure 2. Cet exemple montre que la surexpression adénovirale de hypothétique &quot;Gene # 6&quot; stimule la réplication robuste îlot sans altérer la fonction des cellules bêta. Dans le panneau supérieur, les résultats du test d&#39;incorporation de thymidine démontrer que l&#39;augmentation de l&#39;expression de &quot;Gene # 6&quot; augmente la synthèse d&#39;ADN, telle que mesurée par l&#39;incorporation de thymidine. Parce que la plupart des cellules de l&#39;îlot de rat sont des cellules bêta, il est probable que cette augmentation de l&#39;incorporation de thymidine indique une augmentation de la réplication des cellules bêta. Cependant, les expériences de confirmation doit être effectuée pour établir fermement cette. Dans le panneau du bas, les résultats du test la sécrétion d&#39;insuline démontrer que la surexpression de &quot;Gene # 6&quot; ne modifie pas l&#39;une des fonctions primaires de cellules bêta, c&#39;est à dire, ila sécrétion de glucose nsulin à basse et haute. La qualité de l&#39;isolement des îlots et la santé des îlots suivant le traitement avec des adénovirus est indiqué par la multiplication par la sécrétion d&#39;insuline à des concentrations de glucose basse et haute. Si l&#39;augmentation de l&#39;expression de &quot;Gene # 6&quot; fonction des cellules bêta avec facultés affaiblies, ce serait probablement correspond à une diminution de l&#39;insuline sécrétée à fortes concentrations de glucose (16,7 mM de stimulation). Une courbe dose-réponse pour différentes concentrations de glucose pourrait également être effectuée. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Vue d&#39;ensemble du protocole pour évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans isolés de rat après adéno-médiation des altérations dans l&#39;expression des gènes. Îlots de rat fraîchement isolés sont exposés à des adénovirus pendant 24 h puis cultivées jusqu&#39;à 96 h. L&#39;incorporation de thymidine est évalué dans le dernier 24 h, suivi par la mesure de la sécrétion d&#39;insuline àglucose basse et haute. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Les résultats d&#39;une expérience en utilisant un adénovirus contrôle et un adénovirus un gène hypothétique étiquetés comme &quot;Gene # 6&quot; surexprimant. Le panneau supérieur montre l&#39;incorporation de la thymidine et le panneau inférieur de la sécrétion d&#39;insuline.

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<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+to+pancreatic+islets+mediated+by+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors.</a> Transplantation. 59, 263-268 (1995).</li>
<li>Meng, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver+X+receptors+inhibits+pancreatic+islet+beta+cell+proliferation+through+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest.</a> Diabetologia. 52, 125-135 (2009).</li>
<li>Ronnebaum, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyruvate+cycling+pathway+involving+cytosolic+NADP-dependent+isocitrate+dehydrogenase+regulates+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion.</a> J. Biol. Chem. , (2006).</li>
<li>Milburn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cells+in+obesity.+Evidence+for+induction+of+functional%2C+morphologic%2C+and+metabolic+abnormalities+by+increased+long+chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids.</a> J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).</li>
<li>Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Islet+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Islet Isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Établir des voies qui peuvent être modulés afin de stimuler la réplication et d&#39;améliorer la fonction des cellules bêta sont pertinentes pour les deux principales formes de diabète. Parce que fonctionnelle masse des cellules bêta est tributaire de l&#39;existence et la fonction de cellules sécrétrices d&#39;insuline, l&#39;évaluation de ces déterminants a simultanément ses avantages. Ce protocole décrit un protocole simplifié pour déterminer si la surexpression ou la suppression d&#39;une protéine conduit à des chan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI 1640 les médias </td><td> Gibco </td><td> 11879 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> Des plaques 6 puits </td><td> BD-Falcon </td><td> 35-1146 </td><td> Non-TC traités </td></tr><tr><td> [Méthyl-3 H]-thymidine </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z001MC </td><td> 1 mCi / ml </td></tr><tr><td> Micro-centrifugeuse tubes </td><td> Denville </td><td> C2170 </td><td> 1,7 ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> 59888 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Acros </td><td> 42409 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 &lt;/ Sub&gt; PO 4 </td><td> Acros </td><td> 20592 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Acros </td><td> 41348 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Acros </td><td> 34961 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Solution à 1 M </td></tr><tr><td> 35% de BSA </td><td> Sigma </td><td> A7979 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Acros </td><td> 42427 </td><td></td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> TCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> SA9410-1 </td><td> 10% p / v </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Acros </td><td> 12426 </td><td></td></tr><tr><td> Tube de comptage à scintillation </td><td> Sarstedt </td><td> 58.536 </td><td> 7 ml, PP </td&gt; </tr><tr><td> Bouchon du tube de comptage à scintillation </td><td> Sarstedt </td><td> 65.816 </td><td></td></tr><tr><td> Econo-Safe cocktail de comptage </td><td> RPI </td><td> 111175 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;insuline RIA </td><td> Siemens </td><td> TKIN2 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23250 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf </td><td> 5415R </td><td></td></tr><tr><td> Comptage à scintillation portoir </td><td> Sarstedt </td><td> 93.1431.001 </td><td></td></tr><tr><td> Compteur à scintillation liquide </td><td> Perkin Elmer </td><td> Tri-Carb 2910TR </td><td></td></tr></tbody></table>

les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans adenovirally transduites isolées

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

L&#39;homéostasie du glucose est principalement contrôlée par les hormones du système endocrinien de l&#39;insuline et le glucagon, sécrété par la version bêta du pancréas et des cellules alpha, respectivement. Fonctionnelle masse des cellules bêta est déterminée par la masse des cellules bêta anatomique ainsi que la capacité des cellules bêta pour répondre à une charge en éléments nutritifs. Une perte de masse des cellules bêta fonctionnelles est au cœur de ces deux formes principales de diabète 1-3. Considérant que les résultats en déclin bêta fonctionnelles de masse de cellules à partir d&#39;une attaque auto-immune de type 1 du diabète, dans le diabète de type 2, cette décroissance se développe à la fois une incapacité des cellules bêta à sécréter de l&#39;insuline de façon appropriée et la destruction des cellules bêta à partir d&#39;un cadre de mécanismes. Ainsi, les efforts visant à restaurer la fonctionnalité de masse des cellules bêta sont primordiaux pour un meilleur traitement des cures et potentiels pour le diabète. Des efforts sont en cours pour identifier les voies moléculaires qui peuvent être exploitées afin de stimuler la réplication et d&#39;améliorer la fonction des cellules bêta.Idéalement, les objectifs thérapeutiques permettrait d&#39;améliorer à la fois la croissance des cellules bêta et la fonction. Peut-être plus important, cependant, c&#39;est de déterminer si une stratégie qui stimule la croissance des cellules bêta se fait au prix de la fonction des cellules bêta atteinte (par exemple avec certains oncogènes) et vice-versa. Par systématiquement la suppression ou la surexpression de l&#39;expression de gènes cibles dans les îlots isolés de rat, on peut identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour augmenter la masse des cellules bêta fonctionnelles 4-6. Des vecteurs adénoviraux peut être utilisé à des protéines efficacement surexpriment ou démontable en îlots isolés de rat 4,7-15. Ici, nous présentons une méthode pour manipuler l&#39;expression des gènes en utilisant transduction adénovirale et d&#39;évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans isolés de rat (figure 1). Cette méthode a été utilisée précédemment pour identifier de nouvelles cibles qui modulent la réplication des cellules bêta ou la fonction 5,6,8,9,16,17.

Ce protocole permet d&#39;identifier les facteurs qui modulent fonctionnelle masse des cellules bêta de trouver des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du diabète. Le protocole consiste en une méthode simplifiée pour évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans isolés de rat après la manipulation de l&#39;expression des gènes par des adénovirus.

Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées

L'homéostasie du glucose est principalement contrôlée par les hormones endocrines insuline et glucagon, sécrétées par les cellules bêta et alpha du pancréas, ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les voies de signalisation qui régulent les modifications de la masse fonctionnelle des cellules bêta. Cette approche est réalisée sur des îlots de rat isolés en surexprimant ou en supprimant l'expression d'un gène à l'aide de vecteurs adénoviraux. Après cette manipulation, la fonction des cellules bêta est évaluée par la sécrétion d'insuline, et la réplication des îlots est mesurée par l'incorporation de thymidine tritiée.En fin de compte, ces tests permettent de déterminer si un gène d'intérêt régule la prolifération et/ou la fonction des cellules bêta in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des paupières, comme de savoir si un composant particulier d'une voie de signalisation influence la croissance et la fonction des cellules bêta. Préparez une plaque de six puits non revêtue pour culture tissulaire en ajoutant deux millilitres de milieu modifié au nombre requis de puits.Par exemple, une expérience typique peut nécessiter trois puits, un pour un témoin sans virus, un pour un témoin avec virus et un pour le groupe expérimental. Réchauffez la plaque à 37 degrés Celsius

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Nous décrivons hépatique néo-îlots formation en STZ (streptozotocine)-induite des souris diabétiques par transfert de gène de Neurogenin3 (Ngn3) et bêtacelluline (Btc) à l'aide d'aide en fonction de vecteur adénoviral (HDAd) et la reprise de l'hyperglycémie. Notre méthode prend avantages de helper-vecteurs adénoviraux dépendants de leur très efficace dans la transduction in vivo et l'expression du gène de longue durée.

Neo-Islet formation dans le foie des souris diabétiques par Helper-dépendante Transfert de gènes à médiation adénovirale Vecteur

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Ici, nous présentons une méthodologie pour générer et administrer un composé de microsphères poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) chargées d’intérêt à des îlots de souris intacts en culture, avec analyse ultérieure par immunofluorescence de la prolifération des cellules β. Cette méthode convient pour déterminer l’efficacité des mitogènes β cellules candidates.

Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères

Un protocole pour créer des pseudoislets humains modifiés de gène des cellules humaines dispersées d'îlots qui sont transduced par lentivirus portant l'ARN court d'épingle à cheveux (shRNA) est présenté. Ce protocole utilise des vaisseaux d'enzymes et de culture facilement disponibles, peut être exécuté facilement, et produit des pseudoislets humains génétiquement modifiés appropriés pour des études fonctionnelles et morphologiques.

Le silençage du gène médiévirus lentiviral dans le pseudoislet humain préparé dans les plaques à faible attachement

Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.

Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure

Ce protocole décrit une méthode d’acquisition synchrone et de co-enregistrement d’événements de signalisation intracellulaire et de sécrétion d’insuline et de glucagon par des pseudo-îlots humains primaires en utilisant l’administration adénovirale d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), d’un détecteur de différence d’AMPc in situ (cADDis) et d’un système de micropérifusion.

Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Découvrez l'évaluation de la réplication des îlots et de la fonction des cellules bêta chez le rat en utilisant des vecteurs adénoviraux. Cette méthode permet d'identifier les voies de signalisation régulant la masse cellulaire bêta fonctionnelle pour la recherche sur le diabète.

Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées

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