Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées

L’objectif général de cette procédure est d’identifier les voies de signalisation qui régulent les modifications de la masse fonctionnelle des cellules bêta. Ceci est accompli dans des œillets de rat isolés en surexprimant ou en supprimant l’expression d’un gène à l’aide de vecteurs adénoviraux. Après cette manipulation, la fonction des cellules bêta est évaluée par la sécrétion d’insuline et la réplication des œillets mesurée par l’incorporation de thymidine tritiée.

En fin de compte, ces tests peuvent montrer si un gène d’intérêt régule la prolifération et/ou la fonction des cellules bêta in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des paupières, telles que : un composant particulier d’une voie de signalisation influence-t-il la croissance et la fonction des cellules bêta ? Préparez une plaque à six puits non revêtue de culture tissulaire en ajoutant deux millilitres de milieu modifié au nombre requis de puits.

Par exemple, une expérience typique peut nécessiter trois puits, un pour un contrôle sans virus, un pour un contrôle antivirus, et le groupe expérimental réchauffe la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 30 minutes. Immédiatement après l’isolement des œillets de rat, placez un à 200 œillets dans chaque puits de la plaque préparée. 60 œillets seront utilisés pour les tests biochimiques et les œillets restants peuvent être utilisés pour des études d’expression génique ou d’immuno-transfert gonfler doucement la plaque pour amener les œillets au centre de chacun.

Ensuite, pipetez immédiatement l’adénovirus directement sur les œillets. Au centre du plat. Utilisez une à 500 multiplicités d’infection en fonction de l’efficacité de l’adénovirus à surexprimer ou à renverser votre protéine d’intérêt.

Une pénétration adénovirale efficace au cœur de la paupière augmente la cohérence des résultats. Transduction des paupières immédiatement après la paupière. L’isolement est essentiel.

Ne dérangez pas la plaque pendant cinq minutes, puis déplacez-la dans l’incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, retirez la plaque de l’incubateur et gonflez doucement les œillets jusqu’au centre des puits. Transférez les œillets dans un nouveau puits contenant des milieux frais à l’aide d’une micro-pipette de 200 microlitres.

Si les œillets se fixent à la plaque, ils peuvent être délogés en douceur avec la pointe de la pipette. Il est utile d’utiliser un virus témoin exprimant la GFP pour vérifier l’efficacité de la transduction en utilisant la microscopie confocale pour visualiser la pénétration de l’adénovirus dans la culture centrale des îlots. Les îlots pendant un à trois jours de plus, en changeant de média tous les jours.

Le temps de culture doit être optimisé par des études pilotes et varie en fonction des objectifs expérimentaux. Pendant les dernières 24 heures, incorporer la thymidine tritiée dans le milieu à une concentration d’un micro-curie par millimètre de support. Préparez d’abord fraîchement 50 millilitres de SAB de travail dans un tube conique de 50 millilitres et réchauffez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Pipetez 10 millilitres de SAB fonctionnel dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez 66,8 microlitres de glucose D de 2,5 molaires. Pour préparer le SAB à haute teneur en glucose, ajoutez 44,8 microlitres de glucose monolo D 2,5 aux 40 millilitres restants du SAB de travail. Pour préparer le SAB à faible teneur en glucose, étiquetez ensuite trois microtubes à centrifuger de 1,7 millilitre.

Pour chaque puits des six puits, ajoutez un millilitre de PBS dans chaque tube. N’oubliez pas de suivre les protocoles institutionnels pour la manipulation et l’élimination des œillets radioactifs. À l’aide d’un stéréoscope ou d’un microscope standard, sélectionnez et transférez 20 œillets de taille comparable dans chaque microtube de centrifugation.

Par exemple, chaque tube peut contenir cinq œillets de petite taille, 10 de taille moyenne et cinq de grande taille. Bien que les résultats soient normalisés en fonction de la teneur totale en protéines à la fin de l’expérience, il est essentiel que le dimensionnement corresponde aux œillets entre les groupes. Après avoir laissé les œillets se déposer sur le fond du tube par gravité ou par centrifugation, aspirez, pesez le PBS avec une micro-pipette, puis procédez à la préparation des œillets pour les dosages biochimiques.

Pour préparer les œillets au dosage de la sécrétion d’insuline, ils doivent d’abord être pré-incubés avec un SAB à faible teneur en glucose. Pour ce faire, ajoutez 400 microlitres de SAB à faible teneur en glucose dans les tubes et placez-les avec des capuchons dans l’incubateur de culture tissulaire Pendant 60 minutes après une heure, aspirez le SAB de pré-incubation à faible teneur en glucose Pour mesurer la sécrétion basale d’insuline. Répétez la procédure de pré-incubation.

Cependant, pour mesurer la sécrétion d’insuline stimulée, utilisez 400 microlitres de SAB à haute teneur en glucose au lieu de SAB à faible teneur en glucose et, comme précédemment, incubez les œillets pendant 60 minutes après l’incubation dans un prélèvement de SAB à haute ou basse teneur en glucose et le SAB pour le dosage radio-immunologique d’insuline, qui sera exécuté selon le protocole du fabricant. Procédez ensuite au test d’incorporation de la thymidine en utilisant le même ensemble d’œillets. Commencez par les œillets utilisés pour le dosage de la sécrétion d’insuline.

Ajoutez un millilitre de PBS et laissez les œillets se déposer par gravité. Aspirez ensuite le PBS à l’aide d’une micro pipette. Jetez et répétez cette étape une fois de plus.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’acide trichloracétique glacé dans les œillets et incubez-les sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifugez les tubes à quatre degrés Celsius. Ensuite, l’aspiration, jetez le TCA.

Ensuite, ajoutez 80 microlitres d’hydroxyde de sodium normal 0,3 et incubez les œillets pendant 30 minutes à température ambiante. Au cours de cette incubation, faites un vortex vigoureux sur les échantillons pendant cinq à 10 secondes toutes les 10 minutes. En parallèle, ajoutez quatre millilitres d’un cocktail de comptage Conno Safe à des tubes de comptage à scintillation liquide de sept millilitres.

Lorsque l’incubation des œillets est terminée, ajoutez 50 microlitres d’œillets dans un tube à scintillation. Agitez brièvement le tube bouché et mesurez la radioactivité des échantillons dans un compteur à scintillation liquide. De plus, pour mesurer la concentration en protéines, transférez 10 microlitres de vilas dans un test commercial d’acide bionique et suivez le protocole du fabricant.

Plus tard, au cours de l’analyse des données, normalisez les résultats à la concentration en protéines à l’aide des protocoles décrits. Réplication des œillets et fonction des cellules bêta. Chez les œillets de rat, une surexpression adénovirale du gène six hypothétique a stimulé de manière robuste la réplication des œillets sans altérer la fonction des cellules bêta.

Augmentation de l’expression du gène six, augmentation de la synthèse de l’ADN mesurée par l’incorporation de thymidine car la plupart des cellules de l’œillet du rat sont des cellules bêta. D’autres expériences pourraient montrer que cette augmentation de l’incorporation de la thymidine est due à une augmentation de la réplication des cellules bêta. Le test de sécrétion d’insuline a démontré que la surexpression du gène six n’a pas altéré l’une des fonctions primaires des cellules bêta, la sécrétion d’insuline à faible et à haute glycémie.

L’augmentation de la sécrétion d’insuline à des concentrations de glucose faibles et élevées reflète la santé des œillets après un traitement par adénovirus. Si l’augmentation de l’expression du gène six altérait la fonction des cellules bêta, cela se traduirait probablement par une diminution de l’insuline sécrétée à des concentrations élevées de reglucose. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la réplication des cellules bêta et la sécrétion d’insuline pour déterminer si un gène particulier influence la croissance ou la fonction des cellules bêta.