Quantitative, en temps réel Analyse de l'activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

L’objectif global de l’expérience suivante est de mesurer les taux de réparation de l’ADN et d’extraits nucléaires cellulaires en temps réel à l’aide de balises moléculaires qui deviennent fluorescentes une fois qu’elles sont réparées. Les balises moléculaires de réparation d’excision de base sont composées d’oligonucléotides désoxy dans une structure en boucle de tige contenant une lésion de base unique avec six fractions oxy-fluorescéine courbées conjuguées aux cinq extrémités premières et dil moti conjuguées aux trois extrémités principales lorsqu’elles sont pliées. Le six fam moty est éteint par dab sil de manière non fluorescente via le transfert d’énergie par résonance forestière.

Pour évaluer l’activité de réparation de l’ADN, les balises sont incubées avec des extraits nucléaires cellulaires, qui contiennent des enzymes de réparation. Le glycosylate d’ADN est reconnu et élimine la lésion d’ADN dans la balise. Les sites ABA résultants sont des substrats pour l’endonucléase AP un ou le singe Un Lors de la reconnaissance, APE un clive le squelette de l’ADN au niveau du site ABA, permettant à l’ADN contenant le six fam de se dissocier librement de l’épingle à cheveux.

Le détachement de l’extincteur entraîne une augmentation de la fluorescence proportionnelle au niveau de réparation de l’ADN et peut être évaluée en temps réel à l’aide d’une machine PCR quantitative en temps réel. La capacité de réparer les dommages à l’ADN est cruciale pour chaque cellule et chaque organisme. Parmi la multitude de voies de réparation de l’ADN cellulaire, les cibles de réparation par excision de bases, les bases endommagées qui peuvent résulter d’agressions oxydatives ou chimiques élucidant le rôle des éléments cellulaires individuels qui pourraient influencer la réparation par excision de bases est l’un des principaux objectifs de nos études en laboratoire.

En tant que tel, mesurer l’activité de réparation de l’ADN avec précision et sensibilité est devenu un intérêt dans notre laboratoire. Ce test peut fournir de telles données. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le marquage 32 PN et l’analyse par électrophorèse sur gel est que notre technique n’utilise pas de substrats radioactifs, peut mesurer les taux de réparation des daries en temps réel et a une très large plage dynamique.

De plus, cette approche peut utiliser plusieurs fluoro quatre et/ou lésions de base différentes pour déterminer la spécificité du substrat. Nous avons montré que ce test est très quantitatif et très sensible dans différents contextes. Ce test de balise moléculaire de réparation par excision de base se prête à l’analyse cinétique.

La sensibilité et la spécificité élevées du test permettent une quantification précise de la réparation par excision de bases, et sont donc utiles pour le dépistage ou la validation des inhibiteurs de réparation. De plus, il est adaptable pour mesurer l’activité de réparation des tissus et des lysats de cellules tumorales pour les mesures de biomarqueurs fonctionnels. Lors de la conception de balises moléculaires qui seront utilisées pour ce test, tenez compte des oligonucléotides d’ADN suivants qui ont une longueur de 43 bases, comme indiqué ici.

Travaillez bien. La séquence d’ADN n’est pas unique, mais doit permettre la formation d’une structure en épingle à cheveux. Lorsqu’on s’agenouille comme illustré ici, la spécificité est obtenue par l’insertion de lésions basiques spécifiques telles que l’uracile ou la tétra-hydrofurine.

À la position X six bases de l’extrémité première cinq, le contenu GC doit être d’au moins 32 % et une base GB ne doit pas être placée à l’extrémité cinq. Six carboxy-fluorescéine ou six fam doivent être conjugués à l’extrémité cinq premiers et l’extrémité trois premières doit être modifiée avec du dab sil. Ce sera le substrat des protéines de réparation de l’ADN pour assurer la liaison et l’activité des libérations de glycosyle.

La position de la lésion a été choisie pour fournir suffisamment d’espace entre la structure en épingle à cheveux et l’extrémité de l’ADN. La longueur de la tige ou de l’épingle à cheveux duplex doit être d’au moins 15 paires de bases. La longueur de boucle recommandée est de 13 bases.

La balise moléculaire de contrôle doit être identique à la balise moléculaire expérimentale, sauf qu’elle ne contient pas de lésion de l’ADN. Il ne devrait donc pas être reconnu par les enzymes de réparation de l’ADN. Une fois que les balises moléculaires sont en main, une évaluation de la qualité doit être effectuée pour s’assurer qu’elles ne deviennent pas fluorescentes jusqu’à ce qu’elles soient chauffées.

Et pour déterminer la température de fusion optimale, toutes les étapes de la procédure d’extraction doivent être effectuées sur de la glace ou à quatre degrés Celsius. Pour assurer la stabilité des protéines, préparez-vous à l’expérience en pré-refroidissant. Deux béchers d’un litre par échantillon, des chambres de dialyse, une microcentrifugeuse, des tubes, des seringues et des aiguilles.

Étiquetez les tubes coniques de 15 millilitres et placez-les sur de la glace. Aspirez le milieu de croissance des cellules, puis lavez-les deux fois avec 7,5 millilitres de PBS froid Après le deuxième lavage. Ajoutez cinq millilitres de PBS froid dans chaque plat et utilisez un élévateur de cellules pour gratter les cellules de la plaque.

Transférez les cellules dans un tube conique réfrigéré de 15 millilitres, puis centrifugez-les à 500 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’essorage, retirez le surnageant et estimez le volume de la cellule garnie en le comparant à des volumes connus de liquide dans des tubes similaires. Centrifugez les tubes pendant encore une minute, puis retirez le PBS restant à l’aide d’une pipette resus.

Mettez en suspension la pastille de cellule dans 150 microlitres de réactif d’extraction Nuke Buster à raison d’un pour chaque tranche de 50 microlitres de volume de cellule emballée. Transférez ensuite les cellules remises en suspension dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre et faites tourbillonner pendant 15 secondes à grande vitesse. Après le vortex, incubez le tube sur de la glace pendant cinq minutes, puis vortex pendant 15 secondes supplémentaires et centrifugez à 13 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après la rotation, retirez et jetez le surnageant, qui contient la fraction cytoplasmique. Resus suspend la pastille dans un mélange d’un microlitre de cocktail d’inhibiteur de protéase en suspension resus, d’un microlitre de 100 millimolaires de DTT et de 75 microlitres d’extraction nuke buster. Réactif deux par 50 microlitres de volume de cellule emballée.

Vortex pendant 15 secondes à grande vitesse. Incuber sur de la glace pendant cinq minutes, puis à nouveau faire un vortex pendant 15 secondes à la centrifugeuse à grande vitesse à 13 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une seringue, on transfère le surnageant, qui contient les protéines nucléaires, dans une cassette de dialyse sur lame avec une coupure de 7 000 poids moléculaires.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’une molaire DTT à 500 millilitres de tampon de dialyse pré-refroidi et dialysez le lysat pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius en agitant doucement. Après 90 minutes, transférez la cassette de dialyse dans un deuxième bécher contenant 0,5 litre de tampon de dialyse pré-réfrigéré avec DTT et dialysez. Le lysat pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius avec une légère agitation après la dialyse, l’extrait peut s’être cristallisé en raison de concentrations élevées de protéines.

Ensuite, insérez une nouvelle seringue dans un port différent de celui utilisé pour injecter la cassette et recueillez la solution de protéine nucléaire dialysée de la cassette de dialyse. Essayez d’inclure des cristaux d’apparence trouble lors de l’élimination de la solution de protéine nucléaire dialysée. Aliquote l’échantillon dans des microtubes à centrifuger de 20 microlitres chacun, congelez-le rapidement sur de la glace sèche, puis stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Déterminer la concentration de protéines et effectuer le contrôle de la qualité tel que décrit dans le document d’accompagnement. Pour effectuer le test de balise moléculaire, décongeler et diluer les lysats cellulaires à deux microgrammes par microlitre de protéine avec un tampon de réaction de réparation de cision basique contenant un millimolaire de DTT, diluez les balises moléculaires à 200 micromolaires avec un tampon de réaction de réparation d’excision basique. Étant donné que l’appareil de PCR quantitative en temps réel n’est généralement pas utilisé comme fluorimètre, modifiez la méthode d’exécution sur l’appareil de PCR quantitative en temps réel pour collecter des données toutes les 20 secondes à 37 degrés Celsius pendant au moins 180 cycles.

Puis toutes les 20 secondes pendant 15 cycles à la fluorescence maximale de la balise moléculaire pour obtenir des données de normalisation. Réglez le volume de réaction à 25 microlitres. Ensuite, configurez la conception de la plaque sur l’instrument à l’aide du logiciel de biosystème appliqué avec une courbe standard sélectionnée comme type d’expérience, complétez la disposition de la plaque.

Ce tableau en donne un exemple, qui se trouve également dans le document d’accompagnement. N’ajoutez rien à la courbe bien sélectionnée comme standard. Placez le tampon de réaction de réparation d’excision de base DTT lysat cellulaire à une concentration de deux microgrammes par microlitre et toutes les balises moléculaires utilisées dans l’expérience sur de la glace.

Ajoutez ensuite le DTT au tampon de réaction de réparation d’excision de base jusqu’à une concentration finale d’une pipette millimolaire. 15 microlitres de tampon de réaction de réparation d’exérèse de base avec DTT dans chaque puits d’une plaque optique Q-R-T-P-C-R compatible sur glace. Ensuite, en suivant la disposition des plaques, pipetez les balises dans les puits appropriés.

Chaque combinaison de lysat et de balise moléculaire ou de contrôle doit être dosée en trois exemplaires. Enfin, pipetez cinq microlitres par puits de lysat nucléaire dilué dans les puits appropriés. Il est important de ne pas oublier de garder tous les réactifs moléculaires froids et de pipeter les lysats dans la plaque comme dernière étape.

N’oubliez pas que les lysats contiennent des protéines actives et qu’ils commenceront à réparer les balises moléculaires dès qu’ils seront pipés dans le mélange réactionnel. Par conséquent, il est très important de garder tous les réactifs froids pour minimiser la quantité de réparation de la balise qui se produit avant de commencer à prendre des mesures. Une fois que tout a été ajouté, scellez la plaque avec un film adhésif optique et mélangez en tapotant doucement la plaque.

Ensuite, effectuez un essorage rapide de dix secondes avec une centrifugeuse pour recueillir les solutions au fond des tubes ou de la plaque après le centrifugation, insérez la plaque dans la machine de PCR quantitative en temps réel et commencez le test une fois terminé, exportez les données brutes de préférence au format Excel et suivez les instructions du document d’accompagnement pour analyser les données une fois que les calculs nécessaires ont été effectués. Tracez les données de fluorescence normalisées en pourcentage de fam libre en fonction du temps en secondes dans un nuage de points avec les erreurs correspondantes pour évaluer l’activité de réparation de l’ADN et la qualité des extraits nucléaires des cellules LN 4 28 et d’une lignée cellulaire de surexpression MPG désignée LN 4 28 MPG. Le test décrit dans cette vidéo a été réalisé à l’aide d’une balise moléculaire contenant la tétrafurine du substrat APE one comme contrôle positif.

Comme le montre cette figure, les deux lignées cellulaires ont une activité APE robuste comme l’indique la pente abrupte, l’activité du glycosat d’ADN spécifique pour l’élimination du substrat MPG. L’hypohypoxanthine indiquée comme HX a été mesurée dans les lysats nucléaires des deux lignées cellulaires. Chaque lysat a été analysé à l’aide d’une balise moléculaire de contrôle de réparation d’excision de base ou d’une balise moléculaire HX de réparation d’excision de base pour la balise de contrôle LN 4 28 est indiquée en vert et LN 4 28 MPG indiquée en violet pour la balise d’hypo.

LN 4 28 est illustré en bleu et LN 4 28 MPG est illustré en orange. Les résultats sont rapportés comme A les unités de fluorescence moyennes et B, la fluorescence normalisée. Une augmentation de la fluorescence en fonction du temps, indicatrice de la réparation de HX, s’est produite dans chaque cellule.

Lysat incubé avec la balise moléculaire HX comme prévu. La lignée cellulaire LN 4 28 MPG indiquée par la trace orange présentait un taux de réparation beaucoup plus élevé, comme l’indique l’accumulation plus rapide de fluorescence, que la lignée cellulaire parentale LN 4 28, qui a une protéine MPG minimale. Ainsi, le taux de réparation de lésions spécifiques de l’ADN par des protéines de réparation spécifiques peut être mesuré à partir d’extraits cellulaires en temps réel avec des niveaux minimaux de clivage non spécifique de l’ADN.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir vos balises moléculaires et de mesurer les taux de réparation de l’ADN en temps réel à l’aide de protéines purifiées ou de lysats cellulaires. En ce qui concerne l’analyse, il est essentiel d’évaluer la plage dynamique et les valeurs de fond en incluant les réactions de contrôle telles que avec ou sans les balises de contrôle positif et négatif. Compte tenu de la variabilité d’un puits à l’autre, il est utile de normaliser les données de chaque puits en fonction des valeurs d’entrée.

Ceux-ci sont déterminés par l’étape la plus fine à la température de fusion. Ceci et l’inclusion d’autres colorants comme une matrice de roche tiendront compte de la variabilité inhérente aux erreurs de pipetage ou aux différences dans un détecteur. Cette technique nous a permis d’élucider l’influence des composants individuels de réparation par excision sur l’activité et la capacité globales de réparation.

Il est suffisamment sensible pour démasquer de petits changements qui n’auraient pas été détectables avec les méthodes conventionnelles.