Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l'ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l'essai de ligature de proximité

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

L’objectif général de cette expérience de ligature de proximité est de visualiser et de quantifier la formation de la réponse aux dommages de l’ADN et des complexes protéiques de réparation après l’induction de dommages à l’ADN dans des cultures de cellules en suspension. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la réparation des dommages à l’ADN, telles que l’organisation et la régulation spatio-temporelles, et comment diverses voies de réparation réagissent à différents types de dommages à l’ADN. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est relativement simple, nécessite un faible nombre de cellules et ne nécessite pas de traitement approfondi, ce qui peut perturber ou modifier les interactions protéine-protéine.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la réparation de l’ADN, la formation de complexes protéiques dans les cellules en suspension de culture, elle peut également être appliquée dans des cellules adhérentes cultivées, des tissus congelés ou inclus dans de la paraffine, et même des animaux entiers. La lignée cellulaire lymphoblastique aiguë à cellules B positive pour le BCR humain, BV-173, est utilisée dans cette étude et cultivée dans l’IMDM avec des suppléments à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de 5 % de CO2. Plaquez les cellules à deux fois 10 à six par millilitre dans une plaque à six puits à cinq millilitres par puits.

Pour arrêter les cellules dans la phase G1 du cycle cellulaire, ajoutez cinq micromolaires de méthanesulfonate d’ammonium dans chaque puits et incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de CO2. Le lendemain, ajoutez cinq micromolaires d’un inhibiteur d’ATM dans chacun des deux puits et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 30 minutes. Ensuite, induisez des dommages à l’ADN en ajoutant 50 nanogrammes par millilitre de NCS à l’un des puits qui a été prétraité avec l’inhibiteur ATM et à un autre puits qui n’a pas été prétraité.

Incuber pendant deux heures. Préparez 1XPBS plus 10 % BSA en superposant cinq grammes de fraction-5 BSA sur 50 millilitres de 1XPBS dans un bécher et laissez-le reposer à température ambiante sans secouer ni remuer jusqu’à ce que le BSA soit dissous. Lentement, le filtre la solution PBS plus 10 % BSA à travers un filtre de 0,22 micromètre et garder sur la glace.

Récoltez les cellules en transférant le contenu de chaque puits dans un tube de 15 millilitres. Lavez les cellules deux fois avec de la glace 1XBPS. Après avoir compté les cellules, remettre en suspension à deux fois 10 à la sixième cellule par millilitre en 1XBPS plus 10 % BSA.

Gardez les cellules sur de la glace. Préparez les lames de microscopie pour cette procédure en les polissant soigneusement avec un tissu non pelucheux et en les dégraissant en plaçant un éthanol à 96 % dans un bocal Coplin pendant cinq minutes. Laissez les lames sécher à l’air libre pendant 10 minutes.

Assemblez les lames de microscopie dans les entonnoirs de cytologie de cytospin d’une surface de six millilitres. Pré-enrobez les lames en pipetant 50 microlitres de 1XPBS plus 10 % BSA dans chaque entonnoir et centrifugez pendant une minute à 500 tr/min. Dans chaque entonnoir, ajoutez 100 microlitres de suspension de cellule et centrifugez à 500 tr/min pendant cinq minutes.

Démontez soigneusement les entonnoirs et assurez-vous de ne pas toucher les taches sur les diapositives. Utilisez un bloqueur de liquide pour stylo Pap avec une pointe de cinq millimètres pour dessiner un cercle autour de chaque endroit. Ajoutez ensuite 50 microlitres de solution de fixation PFA à 4 % à chaque endroit.

Et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, lavez les cellules avec 1XPBS dans un bocal Coplin à température ambiante avec une agitation douce. Lavez trois fois de cette manière pendant cinq minutes à chaque fois.

Séchez les lames autour des taches avec un mouchoir non pelucheux et retirez autant de liquide que possible des taches en inclinant la lame et en séchant avec un mouchoir non pelucheux. Ajoutez 50 microlitres de Triton X à 0,25 % en 1XPBS à chaque endroit et incubez pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Lavez les lames dans 50 à 60 millilitres de TBS-T dans un bocal Coplin à température ambiante avec une agitation douce.

Trois fois pendant cinq minutes à chaque fois. Avant de bloquer, tapotez le TBS-T et séchez les lames autour des taches avec un mouchoir non pelucheux. Retirez autant de liquide que possible de l’endroit.

Vortex brièvement la solution de blocage, puis ajoutez une goutte d’environ 40 microlitres à chaque endroit. Placez les lames dans une chambre humidifiée préchauffée et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius. Préparez les cocktails d’anticorps.

Vortex, puis pipetez le diluant d’anticorps commercial dans chaque tube de microfuge. Ajouter l’anticorps anti ATM de chèvre à 1:1000. Et l’anticorps anti-phosphosérine 15 p53 du lapin à 1:100.

Pour les expériences de contrôle d’anticorps uniques, préparez des dilutions d’anticorps contenant uniquement l’anticorps anti-ATM de chèvre et uniquement l’anticorps anti-phosphosérine 15 p53 de lapin. À la fin de l’incubation d’une heure, tapotez la solution de blocage, mais veillez à ne pas laisser les cellules se dessécher. Ajoutez 30 microlitres de chaque dilution de cocktail d’anticorps et incubez dans une chambre humidifiée à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, lavez les lames avec 1X NC2 tampon de lavage A dans un bocal Coplin à température ambiante en agitant doucement deux fois pendant cinq minutes à chaque fois. Après que les lames aient été lavées deux fois avec un tampon de lavage, un tampon de lavage est retiré des lames et ajoute 30 microlitres du mélange de sonde de test de ligature de proximité à chaque endroit. Incuber à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée pendant une heure.

Lavez les lames avec 50 à 60 millilitres de tampon de lavage A dans un bocal Coplin à température ambiante avec une agitation douce. Ensuite, préparez la solution de ligature ligase sur de la glace en ajoutant un microlitre de ligase à 39 microlitres de solution de ligature pour chaque endroit. Ajoutez 40 microlitres de solution de ligature ligase à chaque endroit.

Incuber à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée pendant 30 minutes. Lavez les lames avec le tampon de lavage A dans un bocal Coplin à température ambiante avec une agitation douce. Préparez le mélange d’amplification polymérase sur de la glace.

Diluez d’abord la solution mère d’amplification de un à cinq dans de l’eau. Et ajoutez 0,5 microlitre de polymérase à 39,5 microlitres de solution d’amplification 1X pour chaque point. Tapotez le tampon de lavage et ajoutez 40 microlitres de mélange de polymérase d’amplification par point.

Incuber à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée préchauffée pendant 100 minutes. À la fin de l’incubation de 100 minutes, prélevez le mélange de polymérase d’amplification et lavez les lames avec 1X NC2 wash buffer B dans un bocal Coplin. À température ambiante avec une agitation douce deux fois pendant 10 minutes chacune.

Après cela, lavez les lames dans un tampon de lavage B 0,01x pendant une minute. Tapotez l’excès de tampon de lavage B et séchez les lames autour des taches avec un mouchoir non pelucheux. Retirez autant de liquide que possible de l’endroit.

Préparez du DAPI contenant un milieu d’enrobage qui ne tachera pas trop les noyaux en diluant le DAPI contenant du milieu d’enrobage 1:5 dans un milieu d’enrobage sans DAPI. Ajoutez 25 à 30 microlitres de DAPI dilué contenant du fluide de montage à une lamelle de 24 millimètres sur 24 millimètres. Prenez la lamelle avec la glissière et appliquez une légère pression pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air emprisonnées.

Scellez la lamelle avec du vernis à ongles et attendez au moins 15 minutes avant l’imagerie. Enfin, imagez et analysez les lames à l’aide d’un microscope confocal à fluorescence. Le test de ligature de proximité a été utilisé pour étudier l’interaction entre ATM et la phosphosérine 15 p53 dans les cellules humaines BV 173 positives à la BCR arrêtées en phase G1.

Contrairement aux cellules qui n’ont pas été traitées avec le NCS pour induire des dommages à l’ADN, la majorité des cellules traitées avec le NCS avaient des signaux ponctués exclusivement dans le noyau avec une moyenne de sept signaux par cellule. Cela indique que l’induction de dommages à l’ADN entraîne l’interaction entre ATM et la phosphosérine 15 p53. Le prétraitement des cellules avec un inhibiteur spécifique de la kinase ATM avant l’induction des dommages à l’ADN diminue le nombre de signaux à une moyenne de deux signaux par cellule, confirmant que la phosphorylation de p53 au résidu sérine 15 dépendait de l’activité de la kinase ATM.

Les expériences de contrôle d’anticorps uniques dans lesquelles l’anticorps anti ATM ou l’anticorps anti phosphosérine 15 p53 a été émis n’ont pas donné de signaux comme prévu. Cette figure présente la quantification et l’analyse statistique des résultats qui démontrent et confirment la spécificité de la technique de dosage par ligature de proximité sur des préparations de cytospin de cultures cellulaires en suspension. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures environ après une incubation d’une nuit avec un anticorps primaire si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de titrer soigneusement l’anticorps par coloration par immunofluorescence des cellules qui vous intéressent avant d’effectuer un test de ligature de proximité. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en biologie cellulaire pour explorer les interactions protéiques transitoires qui sont difficiles à évaluer à l’aide de méthodes standard telles que les immunoprécipitations et l’imagerie basée sur FRET qui aboutit souvent à des artefacts techniques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test de ligature de proximité sur des cultures de cellules en suspension pour visualiser et quantifier l’interaction protéine-protéine in situ.