Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Lyco négatif brin, virus à ARN. Le génome des virus de la grippe est emballé sous la forme de complexes de protéines nucléaires de côtes virales, ou VR nps, dans lesquels le génome simple brin est encapsulé par la protéine nucléaire et associé au complexe de polymérase de curcuma composé des sous-unités PA PB un et PB deux pour purifier les complexes intacts des cellules de mammifères infectées. Les cellules Hela sont incubées avec le virus de la grippe recombinant marqué streptocoque.

Une fois que le virus pénètre dans les cellules, l’ARN viral est synthétisé dans les noyaux après l’infection, les cellules sont réduites à l’aide d’un détergent et fractionnées en fractions nucléaires cytoplasmiques et chromatiniennes à l’aide de la centrifugation et du protocole de fraction de chromatine basé sur l’assaut. Enfin, l’analyse de la composition en protéines et en ARN du NPS VR purifié par coloration à l’argent démontre qu’en utilisant ce protocole, même de manière étroite, les VRP liés à la chromatine peuvent être isolés. Intact. Ainsi, l’un des principaux avantages de notre protocole par rapport aux méthodes standard de purification par affinité des complexes de protéines nucléaires des côtes du virus de la grippe est qu’en utilisant notre méthode, il est possible de purifier la NPS VR à partir de la chromatine des cellules infectées, qui est connue pour être le site de synthèse de l’ARNm du virus de la grippe.

Notre méthode pourrait donc être utilisée pour répondre à des questions entourant la régulation de la réplication et de la transcription virales, telles que, par exemple, quels facteurs viraux ou cellulaires, mais aussi quelles modifications post-traductionnelles sont nécessaires, par exemple, pour la synthèse de l’ARNm viral ou encore de la synthèse de l’ARN génomique viral. Ainsi, les chercheurs novices dans cette méthode pourraient rencontrer des difficultés car le fractionnement subnucléaire est très sensible aux conditions biochimiques et peut également varier considérablement entre différentes lignées cellulaires. Commencez ce protocole par guérir nos cellules qui ont été infectées par le virus de la grippe, le streptocoque RWSN PB deux, qui a un marqueur streptocoque génétiquement fusionné à l’extrémité C de la sous-unité PB deux à une multiplicité d’infection de trois.

Lavez les cellules une fois avec du PBS froid, puis ajoutez 12 millilitres de PBS froid et retirez-les du plat. À l’aide d’un grattoir en caoutchouc. Transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et granulez-les par centrifugation.

L’aspect le plus difficile de cette procédure est le protocole de fractionnement cellulaire. Les noyaux cellulaires sont très sensibles aux procédures d’homogénéisation et de mélange, et s’ils ne sont pas effectués correctement, ils peuvent facilement ruiner un extrait de chromatine. Il est donc très important de suivre non seulement les techniques d’homogénéisation, mais aussi la manipulation générale des lysats, comme nous le montrons ici.

Après l’aspiration de spin, le PBS et le Resus, suspendent la pastille cellulaire dans 10 millilitres de tampon de saccharose froid. Fixez une pointe de pipette de 200 microlitres à une pipette de sérum en plastique de 10 millilitres et passez-y les cellules pour briser les amas de cellules. Incuber la suspension sur de la glace pendant 10 minutes.

Inverser périodiquement les cellules doucement pour les remettre en suspension. Ensuite, ajoutez du non IET P 40 à une concentration finale de 0,5 % et vortex à grande vitesse pendant 15 secondes centrifugez immédiatement pendant 10 minutes à 3 500 fois G à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table. Après l’essorage, retirez le supinate et transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres.

Conservez le supinate à quatre degrés Celsius. Il s’agit d’une fraction cytoplasmique. La pastille doit être plus petite et plus blanche que la pastille cellulaire d’origine, comme indiqué ici.

Si le protocole doit être terminé ultérieurement, stockez la pastille de cellule à quatre degrés Celsius. Sinon, continuez en lavant la pastille dans cinq millilitres de saccharose froid, tampon et centrifugation comme précédemment. Une fois la mise en forme terminée, jetez le supinate et remettez en suspension la pastille, qui contient les noyaux dans 1,5 millilitre de tampon d’extraction plasmique nucléaire froid.

Transférez la pastille remise en suspension dans un homogénéisateur de danse de quatre millilitres tout en verre refroidi avec un pilon bien ajusté et homogénéisez les noyaux en 20 coups. En évitant la formation de mousse, la résistance devrait augmenter après environ 10 coups. Pour confirmer une homogénéisation efficace, examinez l’échantillon au microscope à contraste de phase.

Les noyaux ne doivent plus être ronds, mais avoir des formes irrégulières et donner l’impression d’avoir éclaté. Une fois les noyaux homogénéisés, transférez-les dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Incuber l’homogénat sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, centrifugez à 16 000 fois G dans une micro-centrifugeuse pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après le spin, transférez le supinate, qui est la fraction plasmique nucléaire, dans un tube de 1,5 millilitre et stockez-le à quatre degrés Celsius. Ensuite, Reese suspend le granulé dans 1,5 millilitres de digestion, tamponne le préchauffage à 37 degrés Celsius.

Ensuite, incubez la fraction pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 42 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires pour porter la concentration finale de chlorure de sodium à 150 millimolaires, puis incubez pendant 20 minutes sur de la glace. Centrifugeuse à 16 000 fois, G dans une micro centrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après l’essorage, retirez le supinate et conservez-le à quatre degrés Celsius. Il s’agit de la fraction CH 50. Pliez la pastille dans 1,5 millilitre de tampon froid à haute teneur en sel et incubez pendant 20 minutes sur de la glace.

Centrifugeuse à 16 000 fois, G dans une micro-centrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’essorage, retirez le support et rangez-le à quatre degrés Celsius. Il s’agit de la fraction CH 500.

Sortez les fractions sauvegardées lors du protocole de fractionnement et placez-les sur de la glace. Ensuite, à la fraction cytoplasmique, ajoutez 300 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires. Transférez ensuite 100 microlitres de streptocoque T tassé dans des billes de Sphero par fraction dans un tube conique de 15 millilitres.

Ajoutez 10 volumes de tampon de lavage de streptocoque sur les billes. Retournez le tube pour mélanger et centrifugez pendant cinq minutes à 1000 fois. G dans une centrifugeuse de table, jeter le sna.

Répétez le lavage du tampon deux fois, puis pliez la pastille dans un volume égal de tampon de lavage de streptocoque, ajoutez 200 microlitres de streptocoques lavés Agissez en bouillie de billes à chaque fraction. Faites pivoter les tubes pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez les tubes pendant une minute à 1000 fois G de quatre degrés Celsius, jetez le supinate.

Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de lavage aux billes pour les billes incubées avec la fraction cytoplasmique dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez le tampon de lavage et transférez les billes dans un tube de 1,5 millilitre. Lavez les perles pendant une minute, puis centrifugez les tubes pendant une minute à 1000 fois G à quatre degrés Celsius.

Répétez deux fois après la dernière étape de lavage. Enlevez toutes les traces du tampon de lavage à l’aide d’une pointe de pipette plate. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon elucian et mélangez délicatement et placez les tubes sur de la glace pendant 15 minutes.

Pendant l’incubation, mélangez de temps en temps les billes en tapotant doucement le fond des tubes. Après 15 minutes ont passé la centrifugeuse pour choisir pendant une minute à 1000 fois G à quatre degrés Celsius. Récupérez le séné contenant le streptocoque élué marqué VRP.

Lui, nos cellules ont été infectées par la souche du virus de la grippe, WSN pendant neuf heures, et les lysats fractionnés ont été analysés par floraison occidentale comme indiqué ici. L’isolement nucléaire doux permet d’extraire efficacement les protéines cytoplasmiques telles que la tubuline tout en évitant la libération de protéines nucléaires abondantes. A noter que la fraction chromatinienne extraite avec une faible teneur en sel est enrichie en protéines importantes pour la transcription.

Alors que la fraction à haute teneur en sel contient principalement des nucléosomes pour déterminer la composition protéique de la fraction cytoplasmique éluée, V NPS des cellules R infectées pendant neuf heures par un virus non marqué, un STREP RWSN ou RWSN PB deux a été analysé par coloration à l’argent, comme indiqué pour un éluat cytoplasmique. Ici, il y a un rapport élevé entre NP et PA PB un, PB deux, comme en témoigne la bande majeure supérieure à 55 kilodaltons par rapport aux bandes entre 95 et 100 kilodaltons, ce qui suggère que la plupart des PB streptococciques deux sont purifiés dans le cadre d’un VRNP entièrement formé, ou en d’autres termes, une polymérase peu soluble est capturée pour comparer les rendements relatifs. VR NPS purifié après neuf heures d’infection avec RWSN PB deux streptocoques ou RWSN ou argenté comme indiqué dans ce gel de coloration à l’argent, v RMPs peuvent être purifiés des quatre fractions cellulaires après neuf heures d’infection.

La plus forte concentration de v RMP se trouve dans le plasma nucléaire, bien que des portions importantes puissent également être purifiées à partir du cytoplasme et de la chromatine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier des rendements élevés de complexes ribonucléoprotéiques intacts du virus de la grippe à partir du noyau des cellules infectées. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des tampons propres et d’éviter d’exposer inutilement les échantillons à la température ambiante, car de cette façon, vous pouvez éviter la dégradation de l’ARN et des protéines, ainsi que le désassemblage des complexes protéiques.

Et n’oubliez pas que travailler avec un virus de la grippe infectieuse peut être dangereux. Toutes les étapes doivent être effectuées sous un établi de niveau de biosécurité deux jusqu’à ce que le NP 40 ait été ajouté aux lysats.