Name: Compact points quantiques pour une seule molécule dimagerie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Apprenez à préparer des points quantiques colloïdaux compacts pour l'imagerie de molécules uniques. Cette méthode optimise la luminosité et la stabilité tout en minimisant la taille hydrodynamique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Hong Yi à la base Emory University microscopie intégrée pour l&#39;imagerie par microscopie électronique. Ce travail a été financé par des subventions du NIH (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 et 1K99CA154006-01).

Les procédés de synthèse suivantes impliquent l&#39;air standard sans techniques et l&#39;utilisation d&#39;un aspirateur / collecteur de gaz inerte; méthodologie détaillée peut être trouvée dans les références 10 et 11. FDS pour toutes les substances potentiellement toxiques et inflammables doit être consulté avant toute utilisation et les composés inflammables et / ou de l&#39;air labile doit être répartie dans des flacons scellés septum dans une boîte à gants ou un sac à gants. 1. Synthèse de séléniure de cadmium mercure (Hg x Cd 1-x Se) Quantum Dot Cores <ol><li> Préparer une solution 0,4 M de sélénium dans trioctylphosphine (TOP). Ajouter le sélénium (0,316 g, 4 mmol) à un 50 ml à 3 cols, puis évacuer et remplir avec de l&#39;argon à l&#39;aide d&#39;une ligne de Schlenk. Sous air sans conditions (azote sec ou d&#39;argon), ajouter 10 ml TOP et de la chaleur à 100 ° C sous agitation pendant 1 heure pour obtenir une solution limpide et incolore. Refroidir la solution à température ambiante et mis de côté dans le ballon. </li><li> Pour un 250 ml à 3 cols, ajouter de l&#39;oxyde de cadmium (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), d&#39;acide tetradecylphosphonic (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol), et l&#39;octadécène (ODE, 27,6 ml), et évacuer la solution en utilisant une ligne de Schlenk tout en remuant. Augmenter la température à 100 ° C et pour évacuer encore 15 min pour éliminer les impuretés à bas point d&#39;ébullition. </li><li> Sous atmosphère d&#39;argon ou d&#39;azote gazeux, on chauffe le mélange à 300 ° C pendant 1 heure pour dissoudre complètement l&#39;oxyde de cadmium. La solution passera d&#39;une couleur rougeâtre limpide et incolore. Refroidir la solution à température ambiante. </li><li> Ajouter hexadécylamine (HDA, 7,0 g) à la solution de cadmium, de la chaleur à 70 ° C, et l&#39;évacuation. Une fois qu&#39;une pression constante est atteinte, augmenter la température à 100-110 ° C et le reflux de la solution pendant 30 min. Changer la valve de ligne de Schlenk de gaz inerte et insérer le thermocouple directement dans la solution. </li><li> Sous des conditions exemptes d&#39;air, ajouter diphénylphosphine (DPP, 100 ul) à la solution et à augmenter la température à 310 ° C. Retirer 7,5 ml de 0,4 M TOP-Se solution(Mmol sélénium 3) dans une seringue jetable en plastique fixée à une aiguille de calibre 16. </li><li> Une fois que la température s&#39;équilibre à 310 ° C, régler le régulateur de température à 0 ° C et rapidement injecter la solution TOP-Se directement dans la solution de cadmium. La solution passe de l&#39;incolore au jaune-orange et la température va rapidement baisser et augmenter de nouveau à ~ 280 ° C Après 1 min de réaction, enlever le ballon de la chemise de chauffage et refroidir rapidement avec un courant d&#39;air jusqu&#39;à ce que la température est inférieure à 200 ° C. </li><li> Lorsque la température atteint 40 ° C, diluer avec 30 ml d&#39;hexane, la plupart du précurseur de cadmium restant s&#39;installer hors de la solution. Retirer ce précipité par centrifugation (5000 xg, 10 min). </li><li> Dans chacun des six tube de 50 ml en polypropylène à centrifuger conique, diluer 12 ml de la solution brute nanocristal avec 40 ml d&#39;acétone, centrifugeuse (5000 xg pendant 10 min), et soigneusement décanter et éliminer le surnageant. </li><li> Dissoudre le nanocrpellets ystal dans l&#39;hexane (25 ml volume total). Extrait cette solution 3 fois avec un volume égal de methanol, tout en conservant la phase supérieure. Pour la troisième extraction, le volume de méthanol peut être ajusté à ~ 15 ml pour obtenir une solution d&#39;hexane concentré de points quantiques de CdSe purs à environ 200 uM. Le rendement de cette réaction typique est de 3 mol nanocristaux de CdSe d&#39;un diamètre de 2,3 nm (50-60% rendement de la réaction). </li><li> Déterminer le diamètre nanocristal et de la concentration en mesurant le spectre d&#39;absorption UV-Vis et consulter le tableau des tailles d&#39;ajustement de Mulvaney et ses collègues 12 et les corrélations d&#39;extinction des Bawendi et ses collègues 13. Voir l&#39;annexe pour plus de détails. </li><li> D&#39;échange de cations mercure: les nanocristaux peuvent être partiellement échangée avec du mercure pour décalage vers le rouge l&#39;absorption et l&#39;émission de fluorescence. Mélanger les éléments suivants ensemble dans l&#39;ordre dans un flacon en verre de 20 ml avec un barreau d&#39;agitation (cette réaction peut être mise à l&#39;échelle au choix): 3 ml d&#39;hexane, 2 ml de chloroforme, 1 Cd ml uM 200Se QD solution (200 nmol), 15 ul oléylamine (LLO), et 500 ul d&#39;une solution 0,1 M de Hg (OT) 2 dans du chloroforme. Mercure octanethioate (HgOT 2) peut être préparé en faisant réagir l&#39;acétate de mercure et octanethiol dans le méthanol (voir annexe). Au fur et à la réaction d&#39;échange de cations, dans la mesure du décalage vers le rouge peut être surveillée par spectrophotométrie d&#39;absorption UV-Vis. Après la bande d&#39;absorption souhaitée est atteinte, mesurer l&#39;absorption de la solution de nanocristaux à 350 nm et de déterminer le coefficient d&#39;extinction nouveau, en supposant que la concentration n&#39;a pas changé nanocristal (30,7 uM dans cet exemple). Stopper la réaction en enlevant le mercure n&#39;a pas réagi: ajouter 5 ml décane, 10 ml d&#39;hexane, et 7 ml de méthanol et d&#39;extraire la solution, en gardant la phase supérieure contenant des nanocristaux. Extraire deux fois plus à l&#39;hexane et le méthanol, et réglez le volume de méthanol afin que la phase supérieure est d&#39;environ 7 ml. Si les phases sont lents à se séparer, la solution peut être centrifugé (5000 xg,10 min). Ajouter 100 ul TOP, 100 LLO ul et 100 ul d&#39;acide oléique aux nanocristaux suivis par 40 ml d&#39;acétone pour induire la précipitation. Recueillir les nanocristaux par centrifugation et disperser dans 3 ml d&#39;hexane. Centrifuger de nouveau pour éliminer les composants insolubles et déterminer la concentration nanocristal nouveau, en utilisant le coefficient d&#39;extinction nouveau à 350 nm. Laisser la solution nanocristal à vieillir pendant au moins 24 heures à température ambiante avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li></ol> 2. Croissance de Sulfure de zinc cadmium (Cd y Zn 1-y S) Shell <ol><li> Préparer solutions à 0,1 M précurseurs shell dans 50 ml 3 flacons à col. Cadmium précurseur: l&#39;hydrate d&#39;acétate de cadmium (230,5 mg, 1 mmol) et 10 ml d&#39;oléylamine (LLO). Précurseur de zinc: l&#39;acétate de zinc (183,5 mg, 1 mmol) et 10 ml LLO. Précurseur de soufre: soufre (32,1 mg, 1 mmol) et 10 ml ODE. Sous vide, chauffer chaque solution au reflux pendant 1 heure pour obtenir des solutions claires, puis rechargez avec de l&#39;argon. La solution de soufre peutrefroidir à la température ambiante, mais des précurseurs de cadmium et de zinc sont maintenues à environ 50 ° C. Le calcul des quantités de précurseurs shell ne peut être trouvée dans la référence 14. </li><li> Ajouter à un ballon à 3 cols: Hg x Cd 1-x Se QDs (120 nmol, 2,3 nm de diamètre), ODE (2 ml), et l&#39;oxyde de trioctylphosphine (TOPO, 250 mg). Évacuer hors de l&#39;hexane à température ambiante en utilisant la ligne de Schlenk. Augmenter la température à 100 ° C et le reflux pendant 15 min. Changer la vanne en ligne de Schlenk de l&#39;argon ou de l&#39;azote gazeux et insérer le thermocouple dans la solution de nanocristaux. </li><li> Augmenter la température à 120 ° C, ajouter 0,5 monocouches de solution de précurseur de soufre (140 pi), et laisser la réaction se poursuivre pendant 15 min. Petites fractions (&lt;50 pi) peut être enlevé en utilisant une seringue en verre pour surveiller la progression de la réaction en utilisant la fluorescence et / ou spectrophotométrie d&#39;absorption UV-Vis. Augmenter la température à 140 ° C, ajouter 0,5 monocouches de solution de précurseur de cadmium (140 pi), et laisser la réaction se poursuivre pendant 15 min. Ajouter 500 ul de la LLO anhydre à la solution réactionnelle. </li><li> À 160 ° C ajouter 0,5 monocouches de solution de précurseur de soufre (220 pi), suivi par une quantité égale de solution de précurseur de zinc à 170 ° C et à 15 minutes entre chaque addition. Puis à 180 ° C ajouter 0,25 monocouches de solution de précurseur de soufre (150 ul) et de la solution de précurseur de zinc dans des intervalles de 15 min. </li><li> Refroidir la solution à température ambiante et à nouveau calculer un nouveau coefficient d&#39;extinction pour ces particules en utilisant un spectre UV-Vis, en supposant que le nombre de nanocristaux n&#39;a pas changé (120 nmol dans 3,8 ml solution de réaction). Stocker la solution de réaction comme un mélange brut dans un congélateur, les nanocristaux peuvent être décongelés et purifié si nécessaire en utilisant la même méthode décrite dans les sections 1.8 et 1.9. </li><li> Les nanocristaux peuvent être caractérisées par microscopie électronique, spectroscopie d&#39;absorption UV-Vis, et la spectroscopie de fluorescence. Rendement quantique peut êtrecalculée en utilisant absolument une sphère d&#39;intégration ou relativement en comparaison à une norme connue en utilisant les méthodes de référence 15. </li></ol> 3. Transfert de phase <ol><li> Ajouter purifiée noyau / enveloppe Hg x Cd 1-x Se / Zn Cd y 1-y S QD (5 ml, 20 uM) à une de 50 ml à 3 cols et enlever l&#39;hexane sous vide poussé pour obtenir un film sec. Remplir la fiole avec de l&#39;argon, ajouter de la pyridine anhydre (3 ml) pour le film de nanoparticules et de la chaleur de la suspension à 80 ° C. Au cours de 1-2 heures les nanoparticules se dissoudre complètement. </li><li> Ajouter 1-thioglycérol (1 ml) à la solution et agiter à 80 ° C pendant 2 heures. Puis refroidir la solution à température ambiante et ajouter la triéthylamine (0,5 ml) à déprotoner le thioglycérol. Agiter pendant 30 min. La solution peut devenir trouble après l&#39;addition de triéthylamine en raison de la faible solubilité des nanocristaux polaires dans ce mélange de solvants. </li><li> Transférer la solution dans un QD centrifugation de 50 ml cont tube coniqueAining un mélange de 20 ml d&#39;hexane et 20 ml d&#39;acétone, et bien mélanger. Isoler les nanocristaux précipitées par centrifugation (5000 xg, 10 min), et laver le culot avec de l&#39;acétone. </li><li> Dissoudre le culot QD dans le DMSO (5 ml) avec sonication en bain, puis centrifuger (7000 xg, 10 min) pour éliminer les agrégats possibles. Déterminer la concentration de nanoparticules à partir d&#39;un spectre d&#39;absorption UV-Vis. Cette solution de BQs purs doivent être utilisés à moins de 3 h, comme les thiols de surface peuvent s&#39;oxyder lentement dans des conditions ambiantes dans l&#39;air. </li><li> Diluer la solution QD à 10 uM ou moins avec du DMSO et transférer dans un flacon de 50 ml. Préparer un 5 mg / ml, solution d&#39;acide polyacrylique thiolé (synthèse décrite en annexe) dans le DMSO. Ajouter la solution de polymère (0,15 mg de polymère par nmol QDs) goutte à goutte à la solution une fois par jour, tout en agitant et dégazer la solution à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Purger la solution QD / polymère avec de l&#39;argon et de la chaleur à 80 ° C pendant 90 min. Puis refroidir la solution à température ambiante uned goutte à goutte ajouter un volume égal de 50 mM borate de sodium, pH 8. Agiter pendant 10 min. </li><li> Purifier les boîtes quantiques par dialyse (20 kDa de coupure) dans 50 mM borate de sodium, pH 8, puis concentrer les particules à l&#39;aide d&#39;un filtre centrifuge (10 kDa de coupure). Déterminer la concentration d&#39;un spectre d&#39;absorption UV-Vis. </li></ol> 4. Revêtement PEG <ol><li> Dans un flacon en verre de 4 ml avec un barreau d&#39;agitation, mélanger 1 nmol QDs dans un tampon de borate avec un excès molaire de 40.000 x 750 Da monoamino-polyéthylène glycol (30 mg, 40 pmol). Si une fonctionnalité chimique spécifique doit être ajouté à des nanocristaux (par exemple hydrazide ou maléimide), il peut être introduit par substitution, une fraction de l&#39;amino-PEG avec un hétéro-amino-PEG (30% molaire fonctionne généralement bien). Diluer la solution de nanocristaux à 1 uM avec un tampon de borate. Cette réaction peut être mis à l&#39;échelle comme vous le souhaitez. </li><li> Préparer une solution fraîche de DMTMM (20 mg, 72 pmol) dans du DMSO (144 pi). Cette solution peut être chauffée brièvement uous un flux de chaleur eau du robinet ou immergé dans un bain sonique pour dissoudre complètement la DMTMM. Ajouter rapidement un excès molaire x 25.000 de cette solution 0,5 M DMTMM (50 pi) à la solution une fois par jour et agiter à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.2 de plus de quatre fois pour saturer la surface du nanocristal avec du PEG. Enfin, ajouter 200 ul de tampon Tris 1 M pour arrêter la réaction et de purifier les nanocristaux utilisant la dialyse, filtres centrifuges, ou ultracentrifugation. </li><li> Les nanocristaux peuvent être analysés pour monodispersité, taille hydrodynamique, et la charge de surface par chromatographie en phase liquide, électrophorèse sur gel, et la microscopie à fluorescence. Pour déterminer la taille hydrodynamique et la distribution de taille en utilisant un système de chromatographie liquide automatisé (GE AKTAprime Plus), utiliser une colonne de Superose 6, avec un débit de 0,5 ml / min avec un tampon PBS éluant, et la détection de l&#39;absorption à 260 ou 280 nm. Comparer les temps d&#39;élution des nanoparticules avec ceux des standards de poids moléculaire. Pour électrophorèse sur gel d&#39;agaroserésistance, préparer un gel d&#39;agarose à 0,5% dans 50 mM de tampon borate de sodium (pH 8,5) ou 50 mM de tampon phosphate de sodium (pH 7,4), mélanger des échantillons de 1 pM avec 10% de glycérol et de charge dans des puits, et fonctionner à 100 V pendant 30 min . L&#39;image des nanocristaux dans le gel à l&#39;aide d&#39;une baguette à la main UV ou transilluminateur UV et l&#39;excitation de fluorescence. À l&#39;image des nanocristaux à l&#39;échelle de la molécule unique par microscopie à fluorescence, diluer les particules à 0,2 nm dans un tampon phosphate 10 mM, déposez 2,5 ul de la solution sur une lamelle de verre, et très délicatement une lamelle de seconde sur le dessus de la perle liquide à s&#39;étaler un film entre les lamelles. L&#39;image de la surface assortis de particules en utilisant un objectif à grande ouverture numérique (idéalement au moins 1,40) en mode épifluorescence ou la FRBR avec une excitation à des longueurs d&#39;onde entre 400-580 nm et d&#39;une caméra CCD multiplicateur d&#39;électrons. Paramètres d&#39;imagerie exactes varieront entre l&#39;installation de microscopie. </li></ol>

<ol><li>Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+tools+for+watching+nanometer-scale+conformational+changes+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">New fluorescent tools for watching nanometer-scale conformational changes of single molecules.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 349-369 (2007).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+single+molecule+fluorescence+methods+for+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in single molecule fluorescence methods for molecular biology.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 51-76 (2008).</li>
<li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+events%2C+one+quantum+dot+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nat. Method. 7, 275-285 (2010).</li>
<li>Smith, A. M., Wen, M. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+cellular+events+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemist%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic cellular events with quantum dots.</a> Biochemist. 32, 12-17 (2010).</li>
<li>Smith, A. M., Duan, H. W., Mohs, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugated+quantum+dots+for+in+vivo+molecular+and+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1226-1240 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Next-generation quantum dots.</a> Nature Biotech. 27, 732-733 (2009).</li>
<li>Groc, L., Lafourcade, M., Heine, M., Renner, M., Racine, V., Sibarita, J. -B., Lounis, B., Choquet, D., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> J. Neurosci. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+hydrodynamic+size+of+quantum+dots+with+multifunctional+multidentate+polymer+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimizing the hydrodynamic size of quantum dots with multifunctional multidentate polymer ligands.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 11278-11279 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+compact+alloyed+quantum+dots+with+broadly+tunable+near-infrared+absorption+and+fluorescence+spectra+through+mercury+cation+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bright and compact alloyed quantum dots with broadly tunable near-infrared absorption and fluorescence spectra through mercury cation exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 24-26 (2011).</li>
<li>Shriver, D. F., Drezdzon, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShriver%2C+DF+%22The+Manipulation+of+Air-Sensitive+Compounds%22">The Manipulation of Air-Sensitive Compounds</a>. , 2nd edn, Wiley-Interscience. (1986).</li>
<li>Errington, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErrington%2C+RJ+%22Advanced+Practical+Inorganic+and+Metalorganic+Chemistry%22">Advanced Practical Inorganic and Metalorganic Chemistry</a>. , Blackie. (1997).</li>
<li>Jasieniak, J., Smith, L., van Embden, J., Mulvaney, P., Califano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examination+of+the+size-dependent+absorption+properties+of+CdSe+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Re-examination of the size-dependent absorption properties of CdSe quantum dots.</a> J. Phys. Chem. C. 113, 19468-19474 (2009).</li>
<li>Leatherdale, C. A., Woo, W. K., Mikulec, F. V., Bawendi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+absorption+cross+section+of+CdSe+nanocrystal+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 7619-7622 (2002).</li>
<li>Smith, A. M., Mohs, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+optical+and+electronic+properties+of+colloidal+nanocrystals+by+lattice+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Tuning the optical and electronic properties of colloidal nanocrystals by lattice strain.</a> Nature Nanotech. 4, 56-63 (2009).</li>
<li>Demas, J. N., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+photoluminescence+quantum+yields.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The measurement of photoluminescence quantum yields. A review.</a> J. Phys. Chem. 75, 991-1024 (1971).</li>
<li>Van Embden, J., Jasieniak, J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+optical+properties+of+CdSe%2FCdS+heterostructure+nanocrystals%3A+the+effects+of+core+size+and+shell+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mapping the optical properties of CdSe/CdS heterostructure nanocrystals: the effects of core size and shell thickness.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 14299-14309 (2009).</li>
<li>Smith, A. M., Duan, H. W., Rhyner, M. N., Ruan, G., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+examination+of+surface+coatings+on+the+optical+and+chemical+properties+of+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">A systematic examination of surface coatings on the optical and chemical properties of semiconductor quantum dots.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 8, 3895-3903 (2006).</li>
<li>Zhang, X., Mohandessi, S., Miller, L. W., Snee, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+functionalization+of+aqueous+CdSe%2FZnS+nanocrystals+using+small-molecule+chemical+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Efficient functionalization of aqueous CdSe/ZnS nanocrystals using small-molecule chemical activators.</a> Chem. Comm. 47, 3532-3534 (2011).</li>
<li>Bucio, L., Souza, V., Albores, A., Sierra, A., Chavez, E., Carabez, A., Guiterrez-Ruiz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+and+mercury+toxicity+in+a+human+fetal+hepatic+cell+line+%28WRL-68+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cadmium and mercury toxicity in a human fetal hepatic cell line (WRL-68 cells).</a> Toxicol. 102, 285-299 (1995).</li>
<li>Han, S. G., Castranova, V., Vallyathan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+cytotoxicity+of+cadmium+and+mercury+in+a+human+bronchial+epithelial+cell+line+%28BEAS-2B%29+and+its+role+in+oxidative+stress+and+induction+of+heat+shock+protein+70%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Environ.+Health+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative cytotoxicity of cadmium and mercury in a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) and its role in oxidative stress and induction of heat shock protein 70.</a> J. Toxicol. Environ. Health Part A. 70, 852-860 (2007).</li>
<li>Strubelt, O., Kremer, J., Tilse, A., Keogh, J., Pentz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+the+toxicity+of+mercury%2C+cadmium%2C+and+copper+toward+the+isolated+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Environ.+Health+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on the toxicity of mercury, cadmium, and copper toward the isolated perfused rat liver.</a> J. Toxicol. Environ. Health Part A. 47, 267-283 (1996).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Par rapport aux points quantiques de CdSe, alliage ternaire Hg x Cd 1-x Se nanocristaux peuvent être réglés en taille et en longueur d&#39;onde de fluorescence de manière indépendante. La taille est d&#39;abord sélectionné lors de la synthèse de nanocristaux de CdSe noyaux, et la longueur d&#39;onde de fluorescence est choisi dans une étape d&#39;échange de cations mercure secondaire, qui ne modifie pas sensiblement la taille des nanocristaux 9. Il est important de laisser le mercure pur...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Sélénium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 229865 </td><td></td></tr><tr><td> Tri-n-octylphosphine </td><td> Strem </td><td> 15-6655 </td><td> Pur à 97%, instable à l&#39;air </td></tr><tr><td> L&#39;oxyde de cadmium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 202894 </td><td> Très toxique: soyez prudent </td></tr><tr><td> Tetradecylphosphonic acide </td><td> Synthèse PCI </td><td> 4671-75-4 </td><td></td></tr><tr><td> Octadécène </td><td> Alfa Aesar </td><td> L11004 </td><td> De qualité technique </td></tr><tr><td> Hexadécylamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7408 </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylphosphine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252964 </td&gt; <td> Pyrophorique </td></tr><tr><td> L&#39;acétate de mercure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 456012 </td><td> Très toxique: soyez prudent </td></tr><tr><td> 1-octanethiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 471836 </td><td> Forte odeur </td></tr><tr><td> L&#39;acide oléique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W281506 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acétate de zinc </td><td> Alfa Aesar </td><td> 35792 </td><td></td></tr><tr><td> Cadmium hydrate d&#39;acétate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 229490 </td><td> Très toxique: soyez prudent </td></tr><tr><td> Oléylamine </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12954 </td><td> Instable à l&#39;air </td></tr><tr><td> Soufre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 344621 </td><td></td></tr><tr><td> Oxyde de trioctylphosphine </td><td> Strem </td><td> 15-6661 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Pyridine </td><td> VWR </td><td> EM-PX2012-6 </td><td> Anhydre </td></tr><tr><td> Thioglycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1753 </td><td> Forte odeur </td></tr><tr><td> Triéthylamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 471283 </td><td> Anhydre </td></tr><tr><td> Un tube de dialyse </td><td> Spectrum Labs </td><td> 131342 </td><td> 20 kDa de coupure </td></tr><tr><td> Filtre centrifuge </td><td> Millipore </td><td> UFC801024 </td><td> 10 kDa de coupure </td></tr><tr><td> Monoamino-PEG </td><td> Rapp Polymere </td><td> 12 750-2 </td><td> 750 Da </td></tr><tr><td> DMTMM, 4 - (4,6-diméthoxy-1 ,3,5-triazine-2-yl)-4-méthylmorpholinium hydrate de chlorure </td><td> Alfa Aesar </td><td> H26333 </td><td></td></tr><tr><td> AKTAprime Chromatographie Plus System </td><td> GE HealthCare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Superose 6 10/300 GL Chromatographie sur colonne </td><td> GE HealthCare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, OmniPur </td><td> VWR </td><td> EM-2120 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Appendice Synthèse de mercure octanethiolate: Ajouter lentement une solution méthanolique d&#39;acétate de mercure (1 éq.) À une solution sous agitation de 1-octane (3 éq.) Et de l&#39;hydroxyde de potassium (3 éq.) Dans le méthanol à température ambiante. Isoler le précipité de mercure octanethiolate (II) par filtration, laver deux fois avec du méthanol et une fois avec de l&#39;éther, puis séché sous vide. Synthèse de polymère multidenté: Dissoudre l&#39;acide polyacrylique (1 g, 1.773 Da) dans 25 ml de diméthylformamide (DMF) dans 150 ml d&#39;un ballon à trois cols et la bulle d&#39;argon pendant 30 min. Ajouter une solution anhydre de cystéamine (374 mg, 4,87 mmol) dans 10 ml de DMF. À température ambiante avec une agitation vigoureuse, ajouter lentement diisopropylcarbodiimide anhydre (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) pendant 30 min, puis de la triéthylamine (170 pi, 1,22 mmol), et de laisser la réaction se poursuivre pendant 72 heures à 60 ° C. Ajouter mercaptoéthanol (501 mg, 6,41 mmol) pour arrêter la réaction, et remuer pendant 2 heures à température ambiante. Éliminer le DMF par évaporation rotative et isoler le polymère avec l&#39;addition d&#39;un mélange 2:1 d&#39;acétone glacée: chloroforme, suivie d&#39;une centrifugation. Dissoudre le polymère dans ~ 5 ml de DMF anhydre, filtre, précipité à nouveau avec du diéthyléther, et recommencez. Sécher le produit sous vide et sous atmosphère d&#39;argon magasin. Détermination du diamètre du noyau CdSe: A partir du spectre d&#39;absorption UV-Vis de déterminer la longueur d&#39;onde du premier pic excitonique (λ, en nm), qui est le pic le plus long-longueur d&#39;onde (par exemple environ 498 nm pour CdSe dans la figure 2a), et d&#39;utiliser le dimensionnement courbe de Mulvaney et ses collègues 12: <img src="/files/ftp_upload/4236/4236eq1.jpg" alt= &quot;Équation 1&quot; /&gt; Détermination de la concentration nanocristal de CdSe: Issu d&#39;un milieu soustrait-UV-Vis spectre d&#39;une solution optiquement claire de nanocristaux de CdSe, déterminer l&#39;absorption à 350 nm de longueur d&#39;onde. Des dilutions en série peut être utilisé pour déterminer si l&#39;absorption optique est dans la plage linéaire de la loi de Beer. La concentration nanocristal (QD, en M) peut être déterminée en branchant le diamètre nanocristal (D, en nm), la valeur d&#39;absorption optique (A 3SA), et la longueur du chemin cuvette (L, en cm) dans l&#39;équation suivante à partir de la corrélation empirique de Bawendi et ses collègues 13: <img src="/files/ftp_upload/4236/4236eq2.jpg" alt="Équation 2" /></td></tr></tbody></table>

compact points quantiques pour une seule molécule d&#39;imagerie

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Une seule molécule d&#39;imagerie est un outil important pour la compréhension des mécanismes de la fonction biomoléculaire et pour visualiser l&#39;hétérogénéité spatiale et temporelle des comportements moléculaires qui sous-tendent la biologie cellulaire 1-4. À l&#39;image d&#39;une molécule individuelle d&#39;intérêt, il est généralement conjugué à un marqueur fluorescent (colorant, de protéines, de perles, ou points quantiques) et observé avec épifluorescence ou fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie. Alors que les colorants et les protéines fluorescentes ont été le pilier de l&#39;imagerie de fluorescence pendant des décennies, leur fluorescence est instable sous haute flux de photons nécessaires pour observer les molécules individuelles, ce qui donne seulement quelques secondes d&#39;observation avant la perte totale du signal. Des billes de latex et de perles colorant étiquetés assurer la stabilité du signal amélioré, mais au détriment de la taille hydrodynamique considérablement plus grande, ce qui peut altérer la diffusion délétère et le comportement de la molécule étudiée. ntent &quot;&gt; Les quantum dots (QDs) offrent un équilibre entre ces deux régimes problématiques. Ces nanoparticules sont constituées de matériaux semi-conducteurs et peut être conçu avec une taille hydrodynamique compact avec une résistance exceptionnelle à la photodégradation 5. Ainsi, ces dernières années QDs ont joué un rôle en permettant aux observation à long terme du comportement complexe macromoléculaire sur le niveau de la molécule unique. Cependant, ces particules ont encore été trouvé exposer diffusion avec facultés affaiblies en environnements encombrés moléculaires tels que le cytoplasme cellulaire et synaptique neuronale de la fente, où leurs tailles sont encore trop grandes 4,6 , 7. Récemment, nous avons conçu les cœurs et les revêtements de boîtes quantiques de taille hydrodynamique réduite au minimum, tout en tenant compte des décalages à la stabilité colloïdale, photostabilité, la luminosité et la liaison non spécifiques qui ont entravé l&#39;utilité des boîtes quantiques compacts dans le passé 8,9. Le but de cet article est de démontrerla synthèse, la modification et la caractérisation de ces nanocristaux optimisées, composée d&#39;un alliage Cd Hg 1-x Se x noyau revêtu d&#39;un isolant Zn Cd Y 1-Y S coquille, en outre revêtu avec un ligand polydenté polymère modifié par du polyéthylèneglycol court ( PEG) (figure 1). Par rapport aux nanocristaux de CdSe conventionnels, Hg x Cd 1-x Se alliages offrent de meilleures rendements quantiques de fluorescence, fluorescence à des longueurs d&#39;onde rouge et proche infrarouge pour améliorer signal-sur-bruit dans les cellules, et d&#39;excitation à la non-cytotoxiques longueurs d&#39;onde visibles. Multidentés revêtements polymères se lier à la surface du nanocristal dans une conformation fermée et plane pour réduire au minimum la taille hydrodynamique, et PEG neutralise la charge de surface pour minimiser liaison non spécifique aux cellules et de biomolécules. Le résultat final est un nanocristal fluorescent vives avec des émissions entre 550-800 nm et une taille hydrodynamique totale près de 12 nm. C&#39;est dans le sgamme de taille ame autant de protéines globulaires solubles dans les cellules, et sensiblement plus petits que les points quantiques conventionnels PEGylées (25-35 nm).

La figure 2 illustre l&#39;absorption et des spectres de fluorescence représentant des nanocristaux de CdSe, Hg x Cd 1-x Se nanocristaux après échange cationique, Hg et Cd x 1-x Se / Zn Cd y 1-y nanocristaux S après croissance de la coquille. Les nanocristaux de CdSe de base ont un rendement quantique de fluorescence près de 15% (y compris les grandes longueurs d&#39;onde profonde piège d&#39;émission) mais cette efficacité tombe à moins de 1% après mercure éc...

Nous décrivons la préparation de points quantiques colloïdaux dont la taille hydrodynamique réduit au minimum pour l&#39;imagerie de fluorescence de molécules uniques. Par rapport aux points quantiques, ces nanoparticules ont une taille similaire à des protéines globulaires et sont optimisés pour une seule molécule de la luminosité, de la stabilité contre la photodégradation et la résistance à la liaison non spécifique des protéines et des cellules.

Compact points quantiques pour une seule molécule d&#39;imagerie

L'imagerie d'une seule molécule est un outil important pour comprendre les mécanismes de la fonction biomoléculaire et pour visualiser la dimension spatiale et temporelle...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des points quantiques fluorescents présentant une luminosité et une stabilité optimisées, ainsi qu'une taille réduite et une liaison non spécifique minimisée, destinés à l'imagerie de molécules uniques. Cela est réalisé en préparant tout d'abord de petits cœurs de points quantiques de séléniure de cadmium. La deuxième étape consiste à allier ces cœurs au mercure afin de décaler leur fluorescence vers le spectre rouge et d'augmenter leur luminosité.Ensuite, une fine couche d'alliage est déposée sur les nanocristaux afin de stabiliser leur émission de fluorescence. La dernière étape consiste à transférer ces particules depuis des solvants organiques vers des tampons aqueux à l'aide d'un polymère multidenté, pouvant être modifié par du polyéthylène glycol biologiquement inerte. Enfin, la spectrométrie de fluorescence, la chromatographie sur gel et l'électrophorèse sur gel sont utilisées pour démontrer que ces particules présentent une fluorescence intense, une taille hydrodynamique compacte et une charge électrostatique neutre, des caractéristiques particulièrement adaptées à l'imagerie de fluorescence à l'échelle de la molécule un

compact-quantum-dots-for-single-molecule-imaging

Research

Recherche

JoVE Journal

Engineering

Ingénierie

Multiple-Cible Le traçage est un algorithme maison développé pour le suivi individuel au sein de molécules marquées de la membrane plasmique des cellules vivantes. Efficacement détecter, évaluer et le traçage des molécules au cours du temps à haute densité de fournir un outil convivial, outil exhaustif visant à étudier la dynamique des membranes nanométriques.

Cartographie Diffusion moléculaire dans la membrane plasmique par multiple-cible de Recherches (MTT)

Fluorophores simples peuvent être localisés avec une précision nanométrique en utilisant FIONA. Voici un résumé de la technique FIONA est rapporté, et comment réaliser des expériences Fiona est décrit.

L&#39;imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

Nous fournissons des instructions détaillées pour la préparation de points quantiques ciblés monovalents (mQD) à partir d’ADN phosphorothioate de longueur définie. L’emballage de l’ADN se produit à haut rendement et, par conséquent, les produits ne nécessitent pas de purification. Nous démontrons l’utilisation de l’étiquette SNAP pour cibler les mQD sur les récepteurs de surface cellulaire pour les applications d’imagerie de cellules vivantes.

La production et le ciblage des monovalent Quantum Dots

Le processus de fabrication et les techniques de caractérisation expérimentale pertinentes pour les pompes à électrons uniques basées sur des points quantiques de silicium métal-oxyde-semi-conducteur sont discutés.

Silicium métal-oxyde-semiconducteur Quantum Dots pour le pompage mono-électronique

La préparation de bicouches lipidiques planes fonctionnalisées par du verre, la détermination de la mobilité des protéines à l’intérieur et la mesure des densités de protéines sont présentées ici. Une feuille de route pour la construction d’un microscope à réflexion interne totale à bruit réduit est esquissée, qui permet de visualiser des fluorochromes résidents d’une seule bicouche avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

Une méthode est décrite selon laquelle les nanoparticules de points quantiques (QD) peuvent être utilisées pour des études immunocytochimiques corrélatives de tissus pathologiques humains enrobés d’époxy. Nous utilisons des QD conjugués à des fragments d’anticorps commerciaux qui sont visualisés par fluorescence à grand champ, microscopie optique et microscopie électronique à transmission.

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

Excitation résonante d’un point unique quantiques auto-assemblées peut être réalisée à l’aide d’un mode d’excitation orthogonal à la mode de collecte de fluorescence. Nous démontrons une méthode utilisant le Guide d’ondes et les modes de Fabry-Perot d’une microcavité planaire entourant les points quantiques. La méthode permet une liberté totale dans la polarisation de la détection.

Fluorescence de résonance d’un point de InGaAs quantique dans une cavité plane à l’aide de détection et Excitation Orthogonal

À l’aide de l’ADN marqué par des points quantiques et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale, nous pouvons étudier le mécanisme de réaction des endonucléases de restriction tout en utilisant des protéines non marquées. Cette technique à molécule unique permet d’observer massivement multiplexée les interactions protéine-ADN individuelles, et les données peuvent être regroupées pour générer des distributions de temps de séjour bien remplies.

Analyse du temps de séjour d’une molécule unique du clivage de l’ADN médié par l’endonucléase de restriction

Dans ce protocole, les points quantiques conjugués au pic recombinant du SARS-CoV-2 permettent aux tests cellulaires de surveiller la liaison du pic à hACE2 au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose ultérieure des protéines liées dans le cytoplasme.

Imagerie confocale à haut débit des trimères de pointes SRAS-CoV-2 conjuguées aux points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose dans les cellules HEK293T

Le présent protocole décrit une méthode d’immunomarquage d’une protéine dans les coupes de tissu cardiaque à l’aide de points quantiques. Cette technique fournit un outil utile pour visualiser la localisation et l’expression subcellulaire de toute protéine au niveau ultrastructurel.

Visualisation de la localisation subcellulaire d’une protéine dans le cœur à l’aide de l’immunomarquage médié par les points quantiques suivi de la microscopie électronique à transmission

Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de nanobilles de points quantiques (QDNB) et la détection de biomarqueurs de maladies à l’aide de bandelettes d’immunodosage à flux latéral basées sur QDNB. Les résultats des tests peuvent être évalués qualitativement sous un éclairage à la lumière UV et mesurés quantitativement à l’aide d’un lecteur de bande fluorescente dans les 15 minutes.

Immunodosage fluorescent à flux latéral basé sur des nanobilles de points quantiques

Apprenez à préparer des points quantiques colloïdaux compacts pour l'imagerie de molécules uniques. Cette méthode optimise la luminosité et la stabilité tout en minimisant la taille hydrodynamique.

Compact points quantiques pour une seule molécule d'imagerie

Explorer plus de vidéos