Compact points quantiques pour une seule molécule d'imagerie

L’objectif global de cette procédure est de préparer des points quantiques fluorescents avec une luminosité et une stabilité optimisées, ainsi qu’une taille minimisée et une liaison non spécifique pour une utilisation dans l’imagerie de molécules uniques. Ceci est accompli en préparant d’abord de petits noyaux de points quantiques de séléniure de cadmium. La deuxième étape consiste à allier ces noyaux avec du mercure pour déplacer leur fluorescence dans le spectre rouge et augmenter leur luminosité.

Ensuite, une fine coquille d’alliage est cultivée sur les nanocristaux pour stabiliser leur émission de fluorescence. La dernière étape consiste à transférer ces particules de solvants organiques vers des tampons aqueux à l’aide d’un polymère multidenté, qui peut être modifié avec du polyéthylène glycol biologiquement inerte. En fin de compte, la spectrométrie de fluorescence, la chromatographie sur gel et l’électrophorèse sur gel sont utilisées pour montrer que ces particules ont une fluorescence brillante, une taille hydrodynamique compacte et des attributs de charge électrostatique neutre bien adaptés à l’imagerie par fluorescence de molécules uniques en biologie.

Le principal avantage de ces points quantiques par rapport aux matériaux commerciaux existants est que ces nanoparticules ont une taille hydrodynamique considérablement réduite. Bien que les points quantiques plus petits soient affectés négativement par une diminution de l’intensité de la fluorescence, une diminution de la stabilité de la fluorescence et une fluorescence uniquement dans le spectre bleu, nous avons compensé ces effets à l’aide d’un processus d’échange de cations de mercure. Ces nanocristaux peuvent aider à répondre à des questions clés en biophysique et en signalisation cellulaire en permettant l’imagerie dynamique de biomolécules uniques dans des environnements biologiques surpeuplés.

Pour commencer, préparez une solution de 0,4 molaire de sélénium en ajoutant du sélénium à 50 millilitres. Fiole à trois cols, évacuant la fiole sous vide poussé et remplissant d’argon à l’aide d’une ligne à tige sch dans des conditions sans air. Ajouter 10 millilitres de dessus et chauffer à 100 degrés Celsius en remuant pendant une heure pour obtenir une solution claire et incolore.

Refroidissez la solution à température ambiante et mettez le flacon de côté. Préparez également une solution d’oxyde de cadmium TDPA et ODE dans une fiole à trois cols de 250 millilitres en utilisant les quantités indiquées dans le protocole écrit. En accompagnant cette vidéo, évacuez la solution à l’aide d’une tige tout en remuant.

Augmentez la température à 100 degrés Celsius et évacuez pendant 15 minutes supplémentaires. Pour éliminer les impuretés à bas point d’ébullition sous le gaz argonne, chauffez le mélange à 300 degrés Celsius pendant une heure pour dissoudre complètement l’oxyde de cadmium. La solution passera d’une couleur rougeâtre à claire et incolore, refroidissant la solution à température ambiante.

Ensuite, ajoutez du HDA à la solution de cadmium, chauffez à 70 degrés Celsius et évacuez. Une fois qu’une pression constante est atteinte, augmentez la température et reflux la solution pendant 30 minutes. Basculez la vanne de ligne schlink sur un gaz inerte et insérez le thermocouple directement dans la solution.

Dans des conditions sans air, ajoutez du DPP à la solution de cadmium et augmentez la température à 310 degrés Celsius. Utilisez maintenant une seringue en plastique jetable attachée à une aiguille de calibre 16 pour prélever 7,5 millilitres de la solution de sélénium à 0,4 molaire. Une fois que la température s’équilibre à 310 degrés Celsius, réglez le régulateur de température à zéro degré Celsius et injectez rapidement la solution de sélénium supérieure directement dans la solution de cadmium.

La solution passera de l’incolore au jaune, à l’orange, et la température baissera rapidement et augmentera à nouveau jusqu’à environ 280 degrés Celsius. L’étape la plus difficile de cette procédure consiste à injecter tout le volume de la seringue le plus rapidement possible dans la solution de cadmium. Cela permet de s’assurer que les particules se nucléent de manière homogène.

Après une minute de réaction, retirez le ballon du ballon chauffant et refroidissez-le rapidement avec un courant d’air jusqu’à ce que la température soit inférieure à 200 degrés Celsius. Lorsque la température atteint environ 40 degrés Celsius, dilué avec 30 millilitres d’hexane, la majeure partie du précurseur de cadmium restant se dépose hors de la solution. Éliminer ce précipité par centrifugation.

Dans chacun des six tubes à centrifuger coniques en polypropylène de 50 millilitres, diluez 12 millilitres de la solution brute de nano Krystal résultante. Avec 40 millilitres d’acétone après centrifugation avec les mêmes paramètres, décantez soigneusement et jetez le surnageant. Ensuite, dissolvez les pastilles de nano krysttal dans de l’hexane.

Extrayez la solution avec un volume égal de méthanol en conservant la phase supérieure. Répétez cette extraction deux fois de plus pour la troisième extraction. Le volume de méthanol peut être ajusté à environ 15 millilitres pour obtenir une solution concentrée d’hexane de points quantiques de séléniure de cadmium pur à environ 200 micromolaires.

Le rendement typique de cette réaction est de trois cristaux micromolaires de séléniure de cadmium d’un diamètre de deux trois nanomètres déterminer le diamètre et la concentration du nano Krystal en mesurant le spectre d’absorption visible ultraviolette comme décrit dans la procédure écrite, les nanocristaux peuvent être partiellement échangés avec du mercure au décalage vers le rouge, l’absorption et l’émission de fluorescence. Pour ce faire, dans un flacon en verre de 20 millilitres avec un mélange de barre d’agitation hexane et de chloroforme, puis ajoutez la solution de séléniure de cadmium à points quantiques OLA et le viol d’octane de mercure. Après avoir purifié les nanocristaux et déterminé leur concentration comme décrit dans la procédure écrite, laissez les nanocristaux vieillir pendant au moins 24 heures à température ambiante pour la croissance de la coquille.

Préparez des solutions de précurseurs de coquille molaire de 0,1 millilitre dans des flacons de 50 millilitres à trois cols sous vide sous vide des solutions de précurseur de cadmium, de précurseur de zinc et de précurseur de soufre à reflux pendant une heure pour obtenir des solutions claires, puis chargez d’argon dans une fiole à trois cols. Ajouter le topo ODE et les points quantiques de séléniure de mercure et de cadmium préparés. Évacuez l’hexine à température ambiante à l’aide de la ligne de flanc.

Augmentez la température à 100 degrés Celsius et reflux pendant 15 minutes. Remplacez la vanne de ligne par du gaz Argonne et insérez le thermocouple dans la solution nano Krystal. Après avoir augmenté la température à 120 degrés Celsius, ajoutez 0,5 monocouche ou 140 microlitres de solution de précurseur de soufre et laissez la réaction se poursuivre pendant 15 minutes.

Augmentez la température à 140 degrés Celsius. Ajoutez 0,5 monocouche ou 140 microlitres de solution de précurseur de cadmium et laissez la réaction se poursuivre pendant 15 minutes. Ajoutez ensuite 500 microlitres d’OLA anhydre à la solution réactionnelle.

Ajoutez 160 degrés Celsius, ajoutez 0,5 monocouche ou 220 microlitres de solution de précurseur de soufre, suivie d’une quantité égale de solution de précurseur de zinc à 170 degrés Celsius avec 15 minutes entre chaque ajout. Ensuite, à 180 degrés Celsius, ajoutez 0,25 monocouches, ou 150 microlitres de solution de précurseur de soufre et de solution de précurseur de zinc à intervalles de 15 minutes. Refroidir. La solution à la température ambiante et un nouveau coefficient d’extinction pour ces particules.

À l’aide d’un spectre UV-vis, en supposant que le nombre de nanocristaux n’a pas changé, stockez la solution réactionnelle sous forme de mélange brut dans un congélateur. À ce stade, les nanocristaux peuvent être caractérisés à l’aide de la microscopie électronique, de la spectroscopie d’absorption UV-vis et de la spectroscopie de fluorescence. Ajoutez des points quantiques de coquille à noyau purifié dans une fiole à trois cols de 50 millilitres et retirez l’hexine sous vide poussé.

Pour obtenir un film sec, remplissez le ballon d’argonne. Ajoutez de la purine anhydre au film de nanoparticules et chauffez la boue à 80 degrés Celsius pendant une à deux heures. Les nanoparticules se dissoudront complètement.

Ajoutez un millilitre d’un glycérol FIO à la solution et remuez à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Après avoir refroidi la solution à température ambiante, ajoutez 0,5 millilitre de triéthylamine pour déprotoner le thio glycérol et remuez pendant 30 minutes. La solution peut devenir trouble après l’ajout de triéthylamine en raison de la faible solubilité des nanocristaux polaires dans ce mélange de solvants.

Transférez la solution de points quantiques dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres contenant un mélange de 20 millilitres d’hexane et de 20 millilitres d’acétone et mélangez bien. Isolez les nanocristaux précipités par centrifugation, suivie d’un lavage des pastilles avec de l’acétone, dissolvez la pastille de points quantiques dans cinq millilitres de DMSO avec sonication en bain et poursuivez avec centrifugation. Pour éliminer les agrégats possibles, déterminez la concentration en nanoparticules à partir d’un spectre d’absorption UV V.

La solution de points quantiques purs doit être utilisée dans les trois heures, car la surface peut s’oxyder lentement dans des conditions ambiantes dans l’air. Diluez la solution de points quantiques à 10 micromolaires ou moins avec du DMSO et transférez-la dans une fiole de 50 millilitres. Ajouter une solution préparée de cinq milligrammes par millilitre d’acide polyacrylique dilaté dans du DMSO, goutte à goutte à la solution de points quantiques tout en remuant et dégazer la solution à température ambiante pendant cinq minutes.

Purgez la solution de polymère à points quantiques avec de l’argonne et chauffez à 80 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après avoir refroidi la solution à température ambiante, ajoutez un volume égal de 50 millimolaires de sodium ate pH huit goutte à goutte et remuez pendant 10 minutes. Purifier les points quantiques comme décrit dans la procédure écrite et déterminer la concentration à partir d’un spectre d’absorption UV-vis dans un flacon en verre de quatre millilitres avec un mélange de barre d’agitation, un point quantique mole dans un tampon de borate avec un excédent de 40 000 fois molaire de 750 Dalton mono amino polyéthylène glycol.

Vous trouverez des instructions dans la procédure écrite sur la façon d’ajouter une fonctionnalité chimique spécifique aux nanocristaux. Ajoutez rapidement un excès de 25 000 fois molaire d’une solution fraîchement préparée de la solution d’agent activateur à la solution de points quantiques et remuez-la à température ambiante pendant 30 minutes. Répétez cette étape quatre fois de plus pour saturer la surface du nano krysttal avec du PEG.

Enfin, ajoutez 200 microlitres d’un tampon molaire pour éteindre la réaction avant de purifier les nanocristaux À l’aide de filtres centrifuges de dialyse ou d’ultracentrifugation, le nano chrystal résultant peut être analysé pour la monodispersité, la taille hydrodynamique et la charge de surface à l’aide de la chromatographie liquide, de l’électrophorèse sur gel et de la microscopie à fluorescence. Voici un spectre d’absorption et de fluorescence représentatif des nanocristaux de séléniure de cadmium, du mercure, du cadmium, du séléniure, des nanocristaux après échange de cadion, et un noyau de séléniure de mercure de cadmium, de cadmium en coquille, de nanocristaux de sulfure de zinc après croissance de la coquille. Les nanocristaux de séléniure de cadmium ont un rendement quantique de fluorescence proche de 15 %Cependant, cette efficacité tombe à moins de 1 % après l’échange de mercure, probablement en raison de pièges porteurs de charge introduits par la perturbation des atomes de surface.

La croissance d’une fine coquille de sulfure de cadmium et de zinc augmente cette efficacité à plus de 70 %, qui est largement maintenue après le transfert dans l’eau. En revanche, les nanocristaux de sélénure de cadmium, de cadmium et de sulfure de zinc sans incorporation de mercure perdent une fraction substantielle de leur rendement quantique dans l’eau, à moins qu’une coquille épaisse ne soit cultivée. Il est important de noter que le recouvrement avec du sulfure de cadmium et de zinc déplace les spectres vers le rouge en raison de la fuite des porteurs de charge électroniques dans le matériau de la coque.

Ce décalage est d’environ 20 à 30 nanomètres pour les noyaux de cadmium et augmente avec l’augmentation de la teneur en mercure dans le cœur. Ainsi, en incorporant du mercure dans le nanocristal central, la petite taille du nano Krystal peut être maintenue sans sacrifier la luminosité. La petite taille est démontrée dans cette micrographie électronique à transmission et la distribution granulométrique des nanocristaux de mercure, de cadmium, de sélénide, de cadmium en coquille, de sulfure de zinc montrant un diamètre moyen de 3,2 plus ou moins 0,6 nanomètre.

L’utilisation d’un transfert de phase en deux étapes dans l’eau est essentielle pour obtenir une population homogène de nanocristaux qui ne nécessitent pas de tri de taille supplémentaire pour éliminer les grappes et agrège l’exclusion de taille. Le chromatogramme représenté ici confirme que la taille est similaire à celle de la conalbumine. À 75 kilodaltons et après modification avec 750 Dalton amino PEG, la taille est augmentée à seulement 12 nanomètres, similaire à celle d’un anticorps IgG.

La modification du PEG neutralise la charge de surface, comme le confirme l’expérience d’électrophorèse sur gel aros décrite ici, le puits est marqué d’une flèche et les polarités des électrodes sont indiquées à droite, montrant qu’avant la conjugaison, les nanocristaux migrent sous forme de particules oniques et que les nanocristaux pégylés sont électrostatiquement neutres. Voici une micrographie d’épifluorescence de ces nanocristaux déposés sur une lamelle de verre et excités par une lumière visible de 545 nanomètres. Ces nanocristaux sont facilement observés au niveau de la molécule unique à 30 images par seconde avec une caméra CCD multiplicatrice d’électrons.

Ce graphique montre que le nombre de particules fluorescentes observées dans chaque image fluctue au cours du temps avec une excitation continue. Cela est dû à une combinaison de clignement des yeux et de photodégradation. Le clignement des yeux domine pendant les sept premières minutes avant que la photodégradation oxydative ne devienne lentement apparente.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse chimique de points quantiques, de leur transfert dans des tampons aqueux et de leur modification pour des applications de bioimagerie. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs contenant du cadium et du mercure peut être extrêmement dangereux, et que des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter l’exposition personnelle.